Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Холестерин и его функции 10
1.1.1 Роль холестерина в организации мембран и липидных рафтов 10
1.1.2 Регуляция гомеостаза холестерина 13
1.1.3 Холестерин в нервной системе. Механизм его экскреции 14
1.2 Везикулярный цикл 20
1.2.1 Механизмы и компоненты восстановления пресинаптической мембраны и повторного образования синаптических везикул. 22
1.2.2 Сортировка белков синаптической везикулы и других молекул в пресинаптической области 24
1.2.3 Регулирование рециклирования синаптических везикул 25
1.2.4 Липиды пресинаптической области 27
Глава 2. Материал и методы 40
2.1 Этическое одобрение 40
2.2 Растворы и химические реагенты 40
2.3 Электрофизиологические исследования 42
2.4 Флуоресцентная микроскопия 43
2.4.1 Загрузка и выгрузка красителя FM 43
2.4.2 Оценка времени рециклирования 44
2.4.3 Измерение продукции оксида азота (NO) 45
2.5 Статистический анализ 45
Глава 3. Результаты 46
3.1 Эффекты 24-гидроксихолестерина на нервно-мышечную передачу и механизмы его действия 46
3.1.1 Эффекты 24-гидроксихолестерина на спонтанную и вызванную секрецию нейромедиатора 46
3.1.2 Эффекты 24-гидроксихолестерина на загрузку и выгрузку, вызванную высокочастотной стимуляцией 51
3.1.3 Влияние холестерол-24-гидролазы на загрузку и выгрузку красителя FM 58
3.1.4 Роль NMDA рецепторов в эффектах 24-гидроксихолестерина 60
3.1.5 Регуляция образования оксида азота под действием 24-гидроксихолестерина и глутамата 68
3.1.6 Связь эффектов 24-гидроксихолестерина на экзоцитоз с продукцией оксида азота 71
3.2 Обсуждение результатов 76
3.2.1 Влияние 24-гидроксихолестерина на нейромышечную передачу 76
3.2.2 Предполагаемый механизм действия 24-гидроксихолестерина 77
3.2.3 Возможная физиологическая или патофизиологическая значимость 24-гидроксихолестерина 81
Заключение 83
Список литературы 86
- Липиды пресинаптической области
- Эффекты 24-гидроксихолестерина на спонтанную и вызванную секрецию нейромедиатора
- Роль NMDA рецепторов в эффектах 24-гидроксихолестерина
- Предполагаемый механизм действия 24-гидроксихолестерина
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Химическая синаптическая передача происходит в результате освобождения нейромедиатора из пресинаптического нервного окончания. Молекулы нейромедиатора упакованы в синаптические везикулы, которые сливаются со специализированными областями на пресинаптической мембране (активными зонами) для высвобождения нейромедиатора. После обнажения участков мембраны везикул внеклеточной среде механизм эндоцитоза возвращает специфичные для везикул компоненты во вновь образованные везикулы, которые затем заполняются нейромедиатором для следующего этапа экзоцитоза. В нервно-мышечном синапсе только малое количество синаптических везикул прикреплены к активной зоне, тогда как основная часть везикул сосредоточена в цитоплазме (Slater, 2015). Везикулы, не прикрепленные к активной зоне, имеют различные свойства: 10-20% везикул легко участвует в нейропередаче благодаря повторному рециклированию (рециклирующий пул); 80-90% везикул составляют резервный пул (Richards et al., 2000). Эффективность освобождения нейромедиатора в течение длительной и/или интенсивной активности зависит от вероятности экзоцитоза в ответ на потенциал действия, повторного использования везикул и вовлечения новых синаптических везикул (Betz and Bewick, 1993; Petrov et al, 2008; Richards et al., 2000). Таким образом, вследствие синаптической активности везикулярная мембрана проходит цикл «перемещения» в нервном окончании.
Везикулярный цикл строго регулируемый процесс, который сильно зависит от наличия холестерина. Холестерин участвует в везикулярных процессах в пресинаптической области различными путями, и снижение количества холестерина приводит к угнетению вызванного экзоцитоза, эндоциоза и везикулярного транспорта (Petrov et al., 2011, 2014; Zamir and Charlton, 2006). При физиологических условиях основным механизмом снижения мембранного холестерина в мозге является его окисление (ферментом CYP46A1) в 24-гидроксихолестерин (24(S)-гидроксихолестерин, 24-ГХ), что потом может усилить транспорт мозгового холестерина путем активации цитоплазматических Liver X-рецепторов (Ltjohann et al., 1996). Возможность влияния 24-ГХ на физиологические процессы за пределами мозга до сих пор плохо изучена. Хотя выглядит интересным предположение, что выведенный из мозга 24-ГХ способен вносить изменения в функционирование периферических тканей.
В целом, вопрос о роли оксисленных производных холестерина в регуляции синаптической передачи и, в частности, пресинаптического везикулярного траффика остается слабо изученным. Хотя повышение продукции определенных оксистеринов может происходить в ходе усиленной синаптической активности, а также развитии патологических процессов. Учитывая наличие ткане-специфичных окисленных форм холестерина, большое разнообразие оксистеринов, а также их высокую проникающую способность, можно предположить значение оксистеринов во вне- и внутриклеточной сигнализации.
Степень е разработанности
Образование 24-ГХ происходит в основном нейронах в области синапсов и увеличивается вследствие повышенной глутаматергической передачи (Sodero et al., 2012). 24-ГХ может способствовать началу длительной потенциации путем положительной аллостерической модуляции глутаматных NMDA-рецепторов (Linsenbardt et al., 2014; Paul et al., 2013). Однако неизвестно может ли 24-ГХ изменять пресинаптические процессы. Уровень 24-ГХ в мозге варьирует в пределах 10-30 мкМ (Ltjohann et al., 1996) и может
значительно изменяться при патологических состояниях. 24-ГХ способен проходить через
гематоэнцефалический барьер, попадая в кровоток, где его концентрация определяется
разницей между синтезом в мозге и выведением печенью (Bretillon et al., 2000; Leoni and
Caccia, 2013; Petrov et al., 2016). Влияние 24-ГХ на нейропередачу и функционирование
синапса за пределами ЦНС до сих пор слабо изучено. Принимая во внимания, что активные
двигательные нейроны могут быть важными продуцентами 24-ГХ, гипотетическое влияние
плазматического 24-ГХ на нервно-мышечные синапсы способно обеспечить
дополнительную гуморальную связь между мотонейронами и периферическим синапсом.
Цели и задачи
Цель данной работы – изучить влияние 24-гидроксихолестерина на синаптическую передачу в нервно-мышечных соединениях.
Для достижения этой цели были выдвинуты следующие задачи:
-
Исследовать эффект 24-гидроксихолестерина на спонтанное и вызванное освобождение нейромедиатора в нервно-мышечном синапсе мыши
-
Оценить влияние 24-гидроксихолестерина на экзо- и эндоцитоз синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши при высокочастотной активности
-
Выявить зависимость эффектов 24-гидроксихолестерина от глутаматных NMDA рецепторов в нервно-мышечном соединении мыши
-
Оценить зависимость эффектов 24-гидроксихолестерина от продукции оксида азота II (NO) в нервно-мышечном синапсе мыши
Научная новизна
Проведенное нами исследование позволило выявить высокую чувствительность нервно-мышечной передачи (в частности, пресинаптического везикулярного цикла) к 24-ГХ. Впервые обнаружено, что в субмикромолярных концентрациях 24-ГХ усиливает нервно-мышечную передачу, ускоряя пресинаптический везикулярный цикл. Расшифрован механизм этого феномена, который оказался связан со снижением продукции оксида азота эндотелиальной изоформой NO-синтазы, которая в условиях активации синапса ограничивает экзоцитоз синаптических везикул. Также впервые получены данные о том, что активация глутаматных NMDA рецепторов в нервно-мышечном синапсе препятствует развитию эффектов 24-ГХ.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе получены новые данные существенно расширяющие представления о регуляции синаптической передачи, в частности пресинаптических везикулярных процессов, окисленным производным холестерина. Учитывая, что усиленное окисление холестерина наблюдается при патологических состояниях (Leoni and Caccia, 2011), а также локально происходит при синаптической активности (Sodero et al., 2011, 2012), полученные данные указывают на возможную роль оксистеринов в развитии, с одной стороны, синаптической дисфункции, а с другой – синаптической пластичности. 24-ГХ вырабатывается преимущественно нейронами ЦНС, проникая в кровоток (Bjrkhem et al., 1997, 2006; Ltjohann et al., 2000). Открытие его влияния на нервно-мышечную передачу и зависимую от оксида азота (II) сигнализацию порождают гипотезу о наличии у 24-ГХ нейрогормональной роли. Возможно, представленная работа будет полезна для будущих молекулярных исследований по выявлению оксистерин связывающих сайтов в синапсах. Таким образом, представленное исследование вносит существенный вклад в развивающуюся концепцию о производных холестерина как мощных регуляторов физиологических функций, на основе которых возможно конструирование новых фармакологических подходов.
Методология и методы исследования
Исследование синаптической нервно-мышечной передачи проводилось на
изолированной мышце диафрагмы самцов половозрелых мышей массой тела 22-25 г.
Использовали флуоресцентный метод с применением красителей FM1-43 и DAF-FM для
оценки везикулярных процессов и продукции оксида азота, а также электрофизиологический
одномикроэлектродный метод фиксации потенциалов концевой пластинки с помощью
внутриклеточных стеклянных микроэлектродов. Для обработки экспериментов
использовалось программное обеспечение Cell^P и ImagePro. Статистический анализ проводился на программном обеспечении Origin 9.2 (OriginLab Corp.).
Связь темы диссертации с планом основных научно-исследовательских работ
университета
Работа выполнена в рамках комплексной научной темы кафедры нормальной физиологии ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ» Минздрава России. Номер государственной регистрации темы А16-116012910018-6.
Работа поддержана грантом РФФИ №16-34-00127 мол_а.
Положения, выносимые на защиту
-
Нервно-мышечная передача в диафрагмальной мышце обладает выской чувствительностью к 24-гидроксихолестерину. 24-гидроксихолестерин способствует вовлечению синаптических везикул в экзоцитоз и ускоряет их рециклирование.
-
Эффект 24-гидроксихолестерина на экзоцитоз синаптических везикул связан с ослаблением зависимой от NO сигнализации и модулируется активацией глутаматных NMDA рецепторов.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность результатов подтверждена достаточным количеством проведеных экспериментов, решением поставленных задач, статистической обработкой полученных данных.
Основные данные и результаты диссертации представлены и доложены на следующих конференциях: на международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2013, 2015), 88, 89, 90-ой всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2014, 2015, 2016), международном симпозиуме «Biological motility» (Пущино, 2016), российской конференции с международным участием памяти профессора В.С. Маркашина «Experimental and computational biomedicine» (Екатеринбург, 2016), на заседании кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.
Публикации
По теме диссертации 43 публикации, среди которых 7 статей в журналах, включенных в список ВАК и реферативную базу SCOPUS.
Личный вклад диссертанта в исследования
Составление плана исследования, схем экспериментов, проведение экспериментов, обработка, анализ, интерпретация полученных данных, оформление публикаций осуществлены при личном участии соискателя.
Структура диссертации
Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты, их обсуждение, выводы и список использованной литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, включает 15
рисунков и одну таблицу. Список использованной литературы содержит 277 источников, из них 274 иностранных авторов.
Липиды пресинаптической области
Липиды представляют собой небольшие амфифильные молекулы, которые нерастворимы в воде и способны к самооргиназации в сложные структуры в водной среде. Нервная система особенно богата липидами и обладает более разнообразным липидным составом, чем другие ткани [26, 211]. Данное разнообразие липидов связано с эволюцией высших когнитивных способностей у приматов [26] и оно зависит от возраста и пола [200, 271], активности нейронов [111], от стресса и травмы [94, 176]. Кроме того, изменения липидомы связаны с широким спектром неврологических и психиатрических заболеваний [36, 40, 117, 118, 131, 147, 160, 199, 257, 275] и это сопровождается интересом к липидным биомаркерам [144] и липид-модифицирующей терапии [100, 204]. Положительные доклинические исследования уже привели к испытаниям лекарственных средств, модифицирующих липиды, и специфичным липидным диетам, особенно для лечения пациенов с болезнью Альцгеймера или боковым амиотрофическим склерозом [132, 216, 222, 256].
В синапсах плазматическая мембрана подвергается значительной реструктуризации для образования синаптических везикул благодаря процессу эндоцитоза, которые сортируются, перемещаются и затем быстро сливаются с плазматической мембраной при открытии потенциал-зависимых ионных каналов. Хотя обычно предполагают, что белковые механизмы управляют данными процессами, молекулы липидов мембраны также играют ключевую роль [49, 193]. Синапсы обогащены холестерином [193] и полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) [145, 228], и для нейропередачи требуется несколько специфичных липидов, включая фосфатидилинозитолфосфат [193]. Кроме того, пресинаптическое окончание содержит множество ферментов, метаболизирующих липиды, которые локально изменяют структуру липидов и связаны с неврологическими заболеваниями [45, 51, 206]. Специализированные функции нервного окончания существуют благодаря близкому взаимодействию между молекулами белков и липидов, и они оба работают в тандеме для обеспечения устойчивой нейропередачи.
Пресинаптическое окончание является областью с высокоэффективным ремоделированием мембраны. Синаптическая везикула сливается с плазматической мембраной в течение 1 мс в результате потенциала действия, и нервное окончание может поддерживать эпизоды слияния везикул при частотах 100 Гц и выше. Экзоцитоз синаптической везикулы происходит в активной зоне, которые расположены близко к рецепторам, чувствительным нейромедиатору, на постсинаптической клетке. Активные зоны содержат аппарат экзоцитоза, включая Q-SNARE, синтаксин 1, SNAP-25, и несколько белков активной зоны (RIM, RIM-BP, Мunc-13, липрин-альфа-1, и ELKS), которые опосредуют докирование, прайминг и вовлечение потенциал-зависимых кальциевых каналов [226]. Второй важный момент реорганизации мембраны происходит после экзоцитоза, когда нервное окончание интернализирует мембрану [248, 274]. Пресинаптический эндоцитоз связан во времени и пространстве с освобождением синаптической везикулы, и без этой компенсации экзоцитоз расширил бы мембрану, нарушилось бы расположение белков и липидов и в конечном итоге нервное окончание лишилось бы синаптических везикул [115]. Липиды мембраны, особенно отрицательно заряженный фосфатидилсерин и фосфатидилинозитолфосфат на внутренней поверхности плазматической мембраны, функционируют на нескольких этапах везикулярного цикла и электростатический заряд данных липидов является центральным для пресинаптического экзо- и эндоцитоза и помогает соединить оба данных процесса.
Головную группу фосфатидилинозитола можно фосфорилировать в трех разных положениях, что дает начало семи различным фосфатидилинозитолфосфатам на основе расположения и количества остатков фосфата. Хотя фосфатидилинозитолфосфаты являются мало распространенными липидами мембраны, некоторые белки специфически распознают каждый фосфатидилинозитолфосфат и, таким образом, специфически располагаются в мембранных компартментах, содержащих данный липид. Фосфатидилинозитол (4,5)-дифосфат особенно важен в пресинаптическом окончании, где он необходим для нейропередачи и непосредственно контролирует скорость кальций опосредованного экзоцитоза [51, 155]. В активных зонах нейроэндокринных PC12 клеток фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфат неравномерно распределяется в плазматической мембране, где он концентрируется в специфических субдоменах, отмеченных Q-SNARE, синтаксином 1А и докированными везикулами [9].
Механистическая основа данной кластеризации относительно хорошо понятна и, как полагают, обусловлена связью между фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфатом и основными остатками в юкстамембранной области синтаксина 1А.
Действительно, молекулярная стимуляция предполагает, что каждый синтаксин 1А связывает 5 молекул фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфатов [106].
Взаимодействие приводит к тому, что обе молекулы совместно образуют кластеры нм, обнаруженные микроскопом сверхвысокого разрешения с использованием антител для идентификации фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфата [14, 163, 236].
Сверхэкспрессия фосфатидилинозитолфосфатазы синаптоянина-1 (кодируемой геном Synj1), которая в значительной степени метаболизирует фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфат и фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфат, приводит к дисперсии синтаксина-1А по плазматической мембране [236].
Точная стереохимическая формула головной группы фосфатидилинозитол (4,5)-дифосфата может быть не так важна для организации синтаксина-1А, т.к. другие отрицательно заряженные фосфатидилинозитолфосфаты, включая фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфат, который имеет еще больший отрицательный заряд, могут играть аналогичную роль [163]. В нервно-мышечном соединении Дрозофилы снижение доступности фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата уменьшает кластеризацию Syx1A и угнетает нейропередачу [107]. Некоторые белки, ответственные за прайминг и докирование синаптических везикул, также связаны с отрицательно заряженными липидами, особенно с фосфатидилинозитолфосфатом, для кластеризации в активной зоне [146]. Данный процесс опосредуется структурированными положительно заряженными мотивами, такими как C2, фосфотирозин-связывающие или плекстриновые гомологичные домены. Домены С2 опосредуют кальций-зависимое и кальций независимое связывание с фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфатом и представлены в цитозольных белках, включая два белка активной зоны (Мunc-13 and RIM) [226].
Домены С2 также представлены в белках синаптических везикул синаптотагмине 1 и Doc2-бета, которые соединяют мембрану синаптической везикулы с плазматической мембраной [48, 250]. Данные мембран-связывающие заимодействия могут регулироваться другими отрицательно заряженными липидами, включая фосфатидилсерин, который может конкурировать с фосфатидилинозитолфосфатом за связывание с белками. Фосфатидилсерин более распространен в синаптических мембранах, чем фосфатидилинозитолфосфат [228] и непосредственно облегчает экзоцитоз в клетках PC12 [271]. На основе экспериментов in vitro фосфатидилсерин и фосфатидилинозитолфосфат, по видимому, конкурируют за то связывается ли синаптотагмин-1 с мембраной синаптических везикул или с плазматической мембраной [38, 239]. Хотя данные липид-белковые взаимодействия чаще обладают низким сродством, присутствие многочисленных мембран-связывающих доменов может объяснять почему в активной зоне способны образовываться стабильные комплексы. Следовательно, фосфатидилинозитолфосфаты кластеризуются и регулируют как трансмембранные, так и периферические белки мембраны в пресинаптической области.
Фосфатидилинозитолфосфат не только помогает группировать белки плазматической мембраны, но также регулирует связывание основных элементов пресинаптического аппарата. Белки синаптической везикулы R-SNARE, VAMP2 и кальциевый детектор синаптотагмин-1 содержат положительно заряженную область для связывания с фосфатидилсерином и фосфатидилинозитолфосфатом [33, 255]. В случае с VAMP2 взаимодействия с фосфатидилинозитолфосфатом и фосфатидилсерином способствуют регулируемому экзоцитозу в бета-клетках, секретирующих инсулин [255]. Полученные данные показывают, что фосфатидилсерин и фосфатидилинозитолфосфат способствуют связыванию VAMP2 и синтаксина-1А путем экранирования положительных зарядов на обеих белках, когда они сближаются во время докирования синаптических везикул. Другие липиды также участвуют в регулировании взаимодействия VAMP2-фосфатидилинозитолфосфат, включая положительно заряженный сфингозин [46, 196], который может локально образован при расщеплении сфинголипидов церамидазой [206]. Таким образом, регулируя взаимодействия между заряженными участками, фосфатидилинозитолфосфат, фосфатидилсерин и сфингозин могут буферизовать белок-белковые взаимодействия для регулирования эффективности экзоцитоза.
Фосфатидилинозитолфосфаты также способны регулировать активность ионных каналов, которые являются основой возбудимости нейронов. Фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфат, в частности, так сильно контролирует конформацию ионного канала, что только протеолипидная форма комплекса проводит ионы [64]. Регулирование каналов фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфатом может гарантировать, что они остаются инактивированными во время перемещения, при условии, что внутренние органеллы содержат очень малое количество фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфата. И наоборот, активные зоны содержат большее количество фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфата и данный механизм может избирательно способствовать активации ионных каналов в области расположения кальций-зависимого мембрано-ремоделирующего аппарата. Данные примеры подтверждают модель, в которой локальные нано- или микродомены специфических липидов (например, фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфатов) регулируют функцию и поддерживают концентрацию белков экзоцитоза в пресинапсе. Фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфат организует сайты слияния синаптических везикул и объединяется с синтаксином и другими белками в пресинаптической области. Он также регулирует белковые взаимодействия, способствуя докированию и праймингу везикул, одновременно контролируя активность ионных каналов, которые отвечают за возбудимость нейронов. Положительные заряды на головной группе сфингозина или ионы кальция могут в свою очередь модулировать фосфатидилинозитолфосфат-зависимую организацию белков, тем самым контролируя белок-белковые взаимодействия и эффективность освобождения нейромедиатора.
Эффекты 24-гидроксихолестерина на спонтанную и вызванную секрецию нейромедиатора
Мы зарегистрировали миниатюрные ПКП в условиях контроля и во время аппликации 24-гидроксихолестерина (0.4 или 4 мкМ). Не наблюдалось изменений амплитуды, времени нарастания и времени спада миниатюрных ПКП (p0.05 парный t-тест, n=8 животных для каждой концентрации) (Рис. 3.1). Кроме того, данный оксистерин в обеих концентрациях не влияет на частоту миниатюрных ПКП (0.47±0.06 с-1 в сравнении с контролем 0.50±0.06 с-1 после 0.4 мкМ 24-гидроксихолестерина, p0.05, парный t-тест; 0.44±0.06 с-1 в сравнении с контролем 0.48±0.05 с-1 после 4 мкМ 24-гидроксихолестерина, p0.05 парный t-тест; Рис. 3.1). С другой стороны, 24-гидроксихолестерин повышает амплитуду ПКП на 18±4% (0.4 мкМ, n=8, p0.05 парный t-тест) и 12±3% (4 мкМ, n=7, p0.05 парный t-тест), не действуя на время нарастания и спада ПКП в ответ на одиночные стимулы (при частоте 0.02 Гц). Данный эффект наблюдается после 5 мин действия оксистерина и достигает фазы плато в течение 15 мин (Рис. 3.2А). Так как амплитуда миниатюрных ПКП не изменялась, повышение амплитуды ПКП свидетельствует об усилении освобождения нейромедиатора, вызванного низкочастотной активностью. Следует отметить, что кривая зависимости ответа от концентрации для стимулирующего действия 24-гидроксихолестерина на амплитуду ПКП, вызванного одиночным стимулом, оказалась достаточно крутой (Рис. 3.2Б), что указывает на то, что эффект данного оксистерина может зависеть от механизма, обладающего высоким сродством и быстрым насыщением (n=8 животных для каждой группы концентраций: 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 4 мкМ).
Гистограммы показывают эффект 24-гидроксихолестерина на максимальную амплитуду (АМПКП) и частоту (ЧМПКП) миниатюрных потенциалов концевой пластинки. Ось ординат показывает нормализованный эффект 24 гидроксихолестерина (24-ГХ) по отношению к исходному значению до аппликации 24-гидроксихолестерина. Справа, стандартные сигналы миниатюрных ПКП до и через 15 мин после добавления 24-гидроксихолестерина.
А – Гистограммы показывают среднюю амплитуду ПКП (в мВ) вызванную низкочастотной стимуляцией (0.02 Гц) в контроле и после 15 минут действия 0.4 или 4 мкМ 24-гидроксихолестерина. Справа примеры сигналов ПКП, зарегистрированных до и после 15 мин аппликации 24-гидроксихолестерина. Звездочка показывает значимость различий ( p0.05). Б – кривая зависимости ответа от концентрации для опосредованного 24-гидроксихолестерином увеличения средней амплитуды ПКП (АПКП, в %), вызванный одиночным стимулом. Линии соответствуют уравнению Хилла. Значительно отличается от контрольных значений до применения 24-гидроксихолестерина (p0.05).
Активация двигательного аксона с частотой 1 Гц далека от естественной модели активности двигательного нерва и приводит к освобождению малой популяции синаптических везикул, которые преимущественно связаны с готовым к освобождению пулом. Высокочастотная стимуляция с частотой 20 Гц более близко отражает ситуацию in vivo [63, 219]. Во время такой высокочастотной стимуляции эффективность нейропередачи сильно зависит от трафика неприкрепленных синаптических везикул к активным зонам и рециклированию везикул [186, 200, 203]. Трехминутная высокочастотная стимуляция в контрольном растворе привела к двухфазному снижению амплитуды ПКП (Рис. 3.3А): первичный быстрый спад с последующим медленным длительным снижением до 51±3% (p0.001, n=9) к третьей минуте активности.
После предварительной аппликации 24-гидроксихолестерина вторая фаза спада амплитуды ПКП была значительно медленнее. Амплитуда снизилась только до 61±3% (p 0.05 в сравнении с контрольной кривой, n=9) или до 63±4% (p 0.05, n=9) к третьей минуте стимуляции в случаях предварительной обработки 0.4 и 4 мкМ 24-гидроксихолестерина, соответственно. Суммирование амплитуд ПКП позволяет измерить общее вызванное освобождение нейромедиатора пачкой стимулов с частотой 20 Гц в течение 3 мин (Рис. 3.3Б). Предварительная аппликация 0.4 или 4 мкМ 24-гидроксихолестерина значительно повышает кумулятивную амплитуду ПКП до 31.1±2.1% (p 0.01) или 30.7±2.9% (p 0.01), соответственно. Таким образом, обе дозы 24-гидроксихолестерина угнетают развитие синаптической депрессии в течение продолжительной высокочастотной активности, вызывая значительный прирост общего количества освобожденного нейромедиатора.
А – Изменения амплитуды ПКП (в %) во время пачки стимулов в контроле и предварительно обработанных 24-гидроксихолестерином препаратах. Данные выражены в виде процентного изменения по сравнению с исходным значением, полученным до начала стимуляции. Справа характерные примеры сигналов ПКП на 0, 60, 180 с при высокочастотной стимуляции двигательного нерва (20 Гц). Б – Кумулятивные кривые амплитуд ПКП (в мВ) при стимуляции с частотой 20 Гц. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего.
Роль NMDA рецепторов в эффектах 24-гидроксихолестерина
В субмикромолярных концентрациях 24-гидроксихолестерин является очень мощным, прямым и избирательным позитивным аллостерическим модулятором NMDA рецепторов с механизмом действия, который не пересекается с другими аллостерическими модуляторами [180]. Субъединицы NMDA рецептора специфически расположены на постсинаптической мембране нервно-мышечного синапса у мышей и крыс, но совпадают с рецепторами ацетилхолина [142, 151]. Для проверки возможной роли NMDA рецепторов в эффектах 24-гидроксихолестерина (0.4 мкМ) мы использовали 2 селективных антагониста AP-5 и MK-801, которые обладают различными механизмами действия (Рис. 3.10А, Б). Удивительно, что оба антагониста усиливают выгрузку красителя FM1-43 при стимуляции с частотой 20 Гц. Интенсивность свечения нервного окончания после 3 мин стимуляции снизилась до 53±3% (n=9, p 0.05) или 48±4% (n=9, p 0.05) в нервно-мышечных препаратах, предварительно обработанных AP-5 или MK-801, соответственно. Это свидетельствует о том, что антагонисты NMDA рецепторов усиливают выгрузку красителя FM1-43 схожим с 24-гидроксихолестерином образом (p# 0.05 в сравнении с кривой выгрузки в нервно-мышечных препаратах, обработанных 24-гидроксихолестерином). Кроме того, при ингибировании NMDA рецепторов аппликация 24-гидроксихолестерина имеет более сильный эффект на скорость выгрузки FM1-43 и интенсивность свечения после 3 мин стимуляции снижается до 40±3% (в обработанных AP-5 препаратах, n=9, p#0.05) и 35±3% (в обработанных MK-801 препаратах, n=9, p#0.05).
Для исключения возможности применения антагониста NMDA рецептора и 24-гидроксихолестерина в ненасыщающих концентрациях, мы применили AP-5 и 24-гидроксихолестерин в различных концентрациях (от 1 до 250 мМ для AP-5; от 0.04 до 4 мМ для 24-ГХ) для построения кривых зависимости ответа от концентрации (Рис. 3.10 В, Г). Эффекты представленных концетраций 24-гидроксихолестерина (в мкМ): 0.04 (n=7 животных), 0.1 (n=6 животных), 0.2 (n=7 животных), 0.4 (n=12 животных), 4 (n=11 животных). Использованные концентрации АР-5 (в мкМ): 1.0 (n=5 животных), 6.25 (n=5 животных), 12.5 (n=6 животных), 25 (n=9 животных), 250 (n=6 животных). Полученные данные указывают на существенную зависимость ответа от концентрации, особенно для 24-гидроксихолестерина, и что использование 0,4 мкМ 24-гидроксихолестерина и 25 мкМ АР-5 являются достаточными для получения почти максимального эффекта данных соединений на выгрузку красителя. Отметим, что совместное действие 0,4 мкМ 24-гидроксихолестерина и 25 мкМ АР-5 вызывала более глубокую выгрузку красителя (см. Рис. 3.10А, процент обесцвечивания красителя FM1-43 после 3 мин стимуляции с частотой 20 Гц составлял 60±3%, n=6), что не достигалось обработкой каждым веществом по отдельности даже при увеличении концентрации в 10 раз (4 мкМ для 24-гидроксихолестерина и 250 мкМ для АР-5).
А, Б – Сравнение кривых выгрузки FM1-43 в нервно-мышечных синапсах после манипуляций с глутаматэргической сигнализацией с применением ингибиторов NMDA рецепторов (AP-5 и MK 801). Мы использовали тот же протокол загрузки и выгрузки описанный в Рис. 3.5. Динамика выгрузки в контроле (незакрашенные кружки) и в нервно-мышечных препаратах, обработанных только 24-гидроксихолестерином (серые кружки), показаны в А, Б как тонкие пунктирные кривые. В, Г – Эффекты 24-гидроксихолестерина и AP-5 на выгрузку красителя FM1-43 в зависимости от концентрации. Кривая ответ-концентрация показывает средний процент снижения интенсивности свечения FM1-43 (ось ординат) в нервно-мышечных препаратах под действием 24-гидроксихолестерина (В) или AP-5 (Г) при 3-хминутной стимуляции с частотой 20 Гц. Линии соответствуют уравнению Хилла. Звездочка показывает значимость различий ( p 0.05) в сравнении с контролем (обозначен серым квадратом на оси ординат).
С другой стороны активация глутаматных рецепторов экзогенным глутаматом (в присутствии глицина) ведет к небольшому снижению скорости выгрузки FM1 63 43 и значительному ослаблению эффектов 24-гидроксихолестерина на динамику выгрузки FM1-43 (Рис. 3.11А). Интенсивность свечения нервных окончаний снижалась до 70.8±1.3% (n=8, p 0.05) или 62.4±2.1% (n=8, p#0.05, p 0.05) после 3 мин стимуляции нервно-мышечных препаратов, выдержанных только в глутамате или в глутамате вместе с 24-гидроксихолестерином, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект 24-гидроксихолестерина зависит от NMDA рецепторов, активация которых может противодействовать увеличению вызванного экзоцитоза синаптических везикул, которое индуцирует данный оксистерин.
Синаптические везикулы в нервно-мышечном синапсе позвоночных содержат пептид-котрансмиттер N-ацетиласпартилглутамат. После освобождения в синаптическую щель данный пептид подвергается гидролизу до N-ацетиласпартата и L-глутамата ферментом глутамат карбоксипептидазой II, которая синтезируется на мембране околосинаптических Шванновских клеток [244]. Таким образом, длительная активность нерва должна вести к увеличению концентрации глутамата в синаптической щели и дальнейшей стимуляции постсинаптических глутаматных рецепторов. Низкочастотная стимуляция нерва (0.2 Гц; 240 стимулов за 20 мин) до пачки стимулов для выгрузки незначительно уменьшала исходную интенсивность свечения FM1-43 (около 5%) и не изменяла скорость выгрузки красителя во время стимуляции с частотой 20 Гц. Интенсивность свечения FM1-43 после 3 мин стимуляции с частотой 20 Гц снизилась до 67±2.4% (n=8, p 0.05). С другой стороны, предварительная низкочастотная стимуляция подавляет увеличение выгрузки FM1-43, вызванное воздействием AP-5 или самого 24 гидроксихолестерина (Рис. 3.11Б). При данных условиях интенсивность свечения нервного окончания после 3 мин высокочастотной стимуляции снижалась до 66±3% (прекондиционирующая стимуляция совместно с AP-5, n=8, p 0.05) или 64±3% (прекондиционирующая стимуляция совместно 24-гидроксихолестерином; n=8, p 0.05). Только совместное воздействие AP-5 и 24-гидроксихолестерина в сочетании с прекондиционирующей низкочастотной стимуляцией увеличивало скорость выгрузки FM1-43 по сравнению с контролем. После 3 мин стимуляции с частотой 20 Гц интенсивность свечения снижалась до 58±2% (n=8, p 0.05). В итоге, полученные данные свидетельствуют о том, что выделение эндогенного глутамата может противодействовать влиянию 24-гидроксихолестерина на экзоцитоз синаптических везикул и это, по крайней мере частично, зависит от NMDA рецепторов.
А – Сравнение кривых выгрузки красителя при обработке отдельно глутаматом и совместно с 24-гидроксихолестерином. Б – Сравнение кривых выгрузки красителя с применением низкочастотной стимуляции нерва («прекондиционирование»). Протокол эксперимента показан во вставке: нервно мышечные препараты предварительно загружены красителем FM (первый черный прямоугольник). Затем проводилась низкочастотная стимуляция (0,2 Гц, 20 мин) в присутствии 24-гидроксихолестерина и/или AP-5. После этого препарат выгружался высокочастотной стимуляцией 20 Гц и проводилась регистрация изображений (второй черный прямоугольник). Подавляющее действие экзогенного глутамата и глутамат-опосредованного ослабления эффекта 24-гидроксихолестерина было подтверждено регистрацией ПКП с помощью микроэлектродов (Рис. 3.12А-В). Применение только лишь глутамата или совместно с 24-гидроксихолестерином незначительно изменяло амплитуду МПКП. Хотя собственно глутамат не оказывал какого-либо влияния на амплитуду изолированных ПКП, он предотвращает увеличение амплитуды ПКП, вызванное 24-гидроксихолестерином (Рис. 3.12А). Рис. 3.12Б показывает, что глутамат ускоряет развитие депрессии амплитуды ПКП во время высокочастотной активности. Амплитуда снизилась до 37±3% (p 0.05, n=10) через 3 мин стимуляции. Кроме того, способность 24-гидроксихолестерина ослаблять снижение амплитуды полностью устраналась в присутствии глутамата. При данных условиях амплитуда снизилась до 47±3% (n=10, p 0.05, p#0.05) к 3 мин стимуляции. Анализ кумулятивных амплитуд позволяет предположить, что глутамат уменьшает количество освобожденных квантов медиатора во время 3-х минутной стимуляции с частотой 20 Гц на 16.3±2.6 % (p 0.05) в сравнении с контролем. При условии совместного применения глутамата и 24 гидроксихолестерина общая секреция была такой же, как в контроле, но по сравнению с применением только лишь 24-гидроксихолестерина снижалась на 25.7±2.2 % (p#0.05) (Рис. 3.12В).
Предполагаемый механизм действия 24-гидроксихолестерина
Учитывая тот факт, что 24-гидроксихолестерин положительно модулирует NMDA рецепторы в срезах гиппокампа [180] и NMDA рецепторы также представлены в холинергическом нервно-мышечном синапсе [142, 151], данные рецепторы могут быть мишенью воздействия 24-гидроксихолестерина в нервно мышечном синапсе. Удивительно, что оба антагониста NMDA рецептора (АР-5, МК-801) и 24-гидроксихолестерин обладают схожими эффектами на выгрузку красителя FM1-43, вызванную стимуляцией с частотой 20 Гц. Кроме того, применение антагониста NMDA рецептора потенцирует действие 24 гидроксихолестерина. В противоположность этому, экзогенный глутамат (в присутствии глицина) значительно ослабляет вызванные 24 гидроксихолестерином изменения как в выгрузке красителя, так и секреции нейромедиатора. Полученные данные свидетельствуют от том, что 24 гидроксихолестерин действует несколько другим путем, нежели как положительный модулятор NMDA рецептора и что активация глутаматных рецепторов фактически препятствует улучшению нейромышечной передачи, вызванную 24-гидроксихолестерином. Правдоподобная гипотеза, что 24 гидроксихолестерин при низкой концентрации (0.4 мкМ) напрямую не изменяет функцию NMDA рецептора [180], но 24-гидроксихолестерин и NMDA рецепторы могут использовать один и тот же сигнальный путь. Следует отметить, что эффекты 24-гидроксихолестерина остаются неизменными после ингибирования транскрипционного эффекта 24-гидроксихолестерина, путем блокирования печеночных X-рецепторов (с помощью 10 мкM GSK 2033, наши неопубликованные данные)
Тот факт, что антагонисты NMDA рецепторов обладают своими собственными эффектами повышает вероятность того, что происходит активация данных рецепторов во время синаптической передачи. Секреция предшественников глутамата из синаптических везикул может обеспечить последующую стимуляцию NMDA рецепторов в нервно-мышечных синапсах [244]. Поддерживает это то, что, действуя аналогично экзогенному глутамату, предшествующая стимуляция экзоцитоза синаптических везикул при низкой частоте подавляет влияние 24-гидроксихолестерина на последующую выгрузку красителя во время высокочастотной активности. Кроме того, данное угнетающее воздействие предшествующей стимуляции заметно ослабляется избирательным ингибированием NMDA рецепторов с помощью АР-5. Следует отметить, что экзогенный глутамат не оказывал влияния на освобождение нейромедиатора в ответ на одиночные раздражения, но значительно снижал экзоцитоз синаптических везикул во время высокочастотной стимуляции. Вероятно, использованная концентрация глутамата (25 мкМ) слишком низкая для угнетения экзоцитоза в нервно-мышечном синапсе. Однако в условиях повышенной синаптической активности эндогенно продуцируемый глутамат позволяет выявить угнетающее действие экзогенного глутамата. Согласно другому предположению, глутамат ослабляет экзоцитоз опосредованно, препятствуя пополнению готового освобождению пула. В нервно-мышечных синапсах грызунов, постсинаптические NMDA рецепторы регулируют образование оксида азота [141], что может подавлять вызванную секрецию нейромедиатора. При этом оксид азота функционирует как ретроградный мессенджер [187, 231, 264]. Вероятно, 24-гидроксихолестерин облегчает экзоцитоз синаптических везикул и рециклирование путем регулирования сигнального пути, зависимого от оксида азота. В соответствии с данным предположением, мы наблюдали, что 24-гидроксихолестерин подавляет рост интенсивности свечения DAF-FM во время высокочастотной активности, тогда как глутамат изменяет флуоресценцию маркера оксида азота в обратном направлении. К тому же, ингибирование NO-синтазы с помощью L-NAME изменяет экзоцитоз синаптических везикул схожим с 24-гидроксихолестерином образом и полностью нивелирует эффекты самого 24-гидроксихолестерина. Эффекты изоформ-специфичных ингибиторов NO-синтазы, кавтратина и TRIM, свидетельствуют о том, что 24-гидроксихолестерин влияет на образование оксида азота и выгрузку FM1-43, возможно за счет ингибирования эндотелиальной NO-синтазы. Следует отметить, что гемоглобин, акцептор внеклеточного оксида азота, эффективно предотвратил опосредованный 24-гидроксихолестерином рост скорости выгрузки FM1-43.
Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что механизм, благодаря которому 24-гидроксихолестерин модулирует нейромышечную передачу у мышей, связан с регулированием активности эндотелиальной NO-синтазы на участках за пределами пресинаптических нервных окончаний, но поблизости от NMDA рецепторов. В нервно-мышечном синапсе грызунов, распределение субъединиц NMDA рецепторов ограничивается постсинаптической областью [142, 151]. Общепринятое предположение о том, что постсинаптическая мембрана нервно-мышечного синапса богата нейрональной NO-синтазой, которая участвует в ретроградной регуляции пресинаптической функции [119]. Однако исследования электронной и конфокальной микроскопии указывают на отсутствие нейрональной NO-синтазы на постсинаптической сарколемме и что данный фермент в основном связан с пресинаптической мембраной в нервно-мышечном синапсе у мышей и крыс [181]. Данные противоречивые результаты показывают, что постсинаптическая активность NO-синтазы, по крайней мере частично, может быть связана с другой изоформой этого фермента. Мало известно о точном расположении эндотелиальной NO-синтазы в нервно-мышечном синапсе.
Эндотелиальная NO-синтаза широко распространена в цитоплазме мышечных клеток (с более высокой плотностью вблизи митохондрий) и в сарколемме [109]. Во многих типах клеток эндотелиальная NO-синтаза может быть вовлечена в липидные рафты посредством динамического взаимодействия с кавеолином. Кавеолин также необходим для закрепления NMDA рецепторов на мембране рафтов [81]. Кавеолин 3 имеет точное постсинаптическое расположение в нервно мышечных синапсах грызунов [34], где он может работать как каркас (скаффолд) и одновременно ограничитель активности сигнальных молекул [85]. Возможно, что кавеолины могут служить функциональным мостиком между NMDA рецептором и эндотелиальной NO-синтазой. В соответствии с этим предположением, активация NMDA рецептора стимулирует эндотелиальную NO-синтазу в эндотелиальных клетках в изолированных артериях мозга [124]. Главной мишенью оксида азота при регулировании пресинаптического везикулярного цикла в нервном окончании возможно является сигнальный путь гуанилилциклаза/цГМФ/протеинкиназа G [186, 231]. В таком случае, ингибирование сигнального пути оксида азота антагонистом протеинкиназы G будет маскировать эффекты 24 гидроксихолестерина на выгрузку FM1-43.
Последние исследования указывают на высокую чувствительность синаптической передачи к производным холестерина [102, 103, 136, 175, 180]. Несмотря на их структурное сходство, производные холестерина могут специфически регулировать синаптические процессы. 24-гидроксихолестерин активирует NMDA рецептор в ЦНС [180], тогда как 25-гидроксихолестерин является антагонистом данной положительной аллостерической модуляции [136]. Таким же образом, 5-альфа-холестан-3-он и структурно схожее с ним нейропротекторное соединение холест-4-ен-3-он оксим имеют противоположные эффекты на цикл синаптических везикул и целостность липидных рафтов в нервно 81 мышечном синапсе [93]. С другой стороны, различные производные холестерина могут вызвать аналогичные пресинаптические эффекты, воздействуя через различные механизмы. Как и в данном исследовании для 24-гидроксихолестерина было обнаружено, что синтетический глюкокортикостероид (метилпреднизолон, 0,3 мМ) усиливает освобождение нейромедиатора во время высокочастотной активности, вероятно, благоприятствуя освобождению везикул, принадлежащих к рециклирующему пулу, в нервно-мышечном синапсе крысы. Однако в отличие от 24-гидроксихолестерина данный эффект требовал относительно высокой концентрации метилпреднизолона и сильно зависел от активации пресинаптического пути аденозин А2А рецептор / протеинкиназа А [175]. Тогда как, действие 24-гидроксихолестерина тесно связано с постсинаптическими рецепторами и сигнальным путем: оксид азота / протеинкиназа G. В совокупности эти данные указывают на то, что различные холестерин-подобные структуры, действуя пре- и постсинаптически, способны изменять синаптическую передачу, влияя на специфические сигнальные пути.