Введение к работе
Актуальность темп. Дальнейшее повышение производства продуктов животноводства во многом зависит от интенсификации воспроизводства сельскохозяйственных животных на основе генотнпи-ческой селекции. Решение этой важной проблемы в значительной степени зависит от эффективности метода долгосрочного храпения сперш животных в глубокозаморокенном состоянии.
К настоящему времени достигнуты определенные успехи в области криоконсерзации спермы сельскохозяйственных -.нвотігах. Однако, в свиноводство и птицеводстве метод криопнеервации спермы производителе!'! еще не нашел широкого практического применения из-за нестабильности результатов искусственного осеменения самок и технологических сложностей. Поэтому задачей первостепенной важности в области фундаментальных и прикладных исследований по криобиологии спермы сельскохозяйственных животных и птиц является раскрытие особенностей криоповреядония спермиев на разных уровнях их организации и выявление на этой основе дифференцированных подходов в разработке эффективных способов криозащнти спермы применительно для конкретного вида.
В последние годы в лаборатории криобиологии Института физиологии АН РМ доказано, что в осново повреждения спермиев сельскохозяйственных животных при замораживании и оттаивании легат структурные нарушения биомембран и, в частности, плазматических, за счет развития термодинамических, фгтзикохпмячеекпх и биохимических процессов, которые предопределяются составом, свойством и соотношением основных структурных компонентов, каталитической активностью мембранносвязанных ферментов, уровнем порекпеного окисления лппидов и др. (Наук, 1987, 1991). Учитывая, что кркопов-роздення и криопротекция опермиев различных видов животных протекает неодинаково, особый интерес представляет изучение видовых особенностей структурно-функционального состояния плазмзтических. мембран спермиев и выяснение их механизмов в процессе криокон- : сервацни.
Исследование этого вопроса одновременно позволит более направленно и обосновашю подходить я разработке методов криокон-сервацни спермі различных видов животных.
Цель п задачи исследований. Целью настоящей работы, явилось выявление особенностей- структуры плазматических мембран я функ-
2 ционалыюй полноценности спермиев петуха и хряка при криоконсервации.
Для достижения цели намечалось решение следующих основных ' задач:
-
Выяснить функциональную устойчивость спершев петуха и хряка к температурному шоку и соотношение основных .структурных компонентов их плазматических мембран при криоконсервации. ?
-
Изучить лилидный состав мембран спермиев петуха и хряка в зависимости от состава синтетических сред при криоконсервации.
-
Определить аминокиолотный состав белков плазматических мембран, спермиев и плази спермы петуха и хряка при криоконсервации. '
-
Исследовать морфофункциональные показатели опермиев петуха в зависимости от введения в состав криозащитной среда аи-тиоксидантов и испытать оптимальные варианты в производственных условиях.
Научная новизна работы. Впервые определен аминокислотный и ляпидный соотав плазматических мембран спермиев петуха, а также индекс Фпиера и активность мембранносвязанных ферментов- Mg+2 (На+ + К+)-АТФазы и щелочной фосфатазы.
Доказано, что видовые особенности устойчивости спермиев петуха и хряка к действию низких температур обусловлены величиной белок:лиг.ид, холестерин:фосфолипиды и индексом Фишера, а также содержанием связанных аминокислот плазматических мембран спермиев и свободных аминокислот плазмы спермы.
Показано, что стабилизация морфологических и функциональных показателей сперми в петуха и хряка выше при введении в соотав криозащитних сред антиоксиданте Н-зид и использовании дифференцированных приемов технологической обработки сперш.
Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в раскрытии видовых особенностей структуры плазматичеоких мембран и функциональной активности спермиев, а таке в углублении представлений о структурной организации биомембран спермиев петуха и хряка. .
.Результаты исследования соотношения белок:липид и холесте-'рян:фосфояипида, активности мембранносвязанных ферментов, ли-.Ьиднрго и аминокислотного оостава плазматических мембран спермиев .петуха и хряка, а также выявленные взаимосвязи между этими 'показателями и устойчивостью спермиев к действию низких темпе-
ратур будут,использованы лри дальнейшем углублешш исолсдований структурно-метаболических и функциональных перестроек мембран спормиев и разработке более эффективных способов длительного храпения спермы производителей при -196С.
Полученные данные по стабилизации морфофункционалышх показателей спермиев петуха и хряка при криоконсєрваціш с использованием анткоксидантов, стабилизатора мембран и дифференцированных технолоппеских приемов обработки спермы, а такие результаты научно-производственного опыта по искусственному осеменению кур криоконсервированной спермой петуха свидетельствуют о возможности их использования в селекционно-племенной работе в свиноводстве и птицеводстве.
Основные полокения. выносимые на защиту.
-
Видовые особенности устойчивости спермиев петуха и хряка к действию низких температур предопределяются величиной белок: лииид, холестерин:фосфолипида и индексе:.! Фишера, о также содержанием связанных аминокислот плазматических мембран еяермп-ев и свободных аминокислот плазмы спермі.
-
Стабилизация морфофуккцночальких показателей опермпев петуха я хряка при кркоконсервацнк достигается введением в с состав синтетических сред антиоксидантов и использованием дифференцированных приемов обработки сперш.
Апробация работа. Материалы диссертационной работы доложз-нп ко Республиканской конференции "Пробяегз научного обеспечения кивотповодетва Молдавии" (Кишинев, 1900), 1У Есосопзмом сим-познуме "Стресс, адаптация к дисфункции" (Кишинев, IS9I), ежегодных заседаниях лаборатории криобиологии Института физиологии ЛНГМ (1939, I9S0, Ї99І), заседаниях Ученого совета Института физиологии АН Ш (IS89, 1990, ISSI).
Материалу диссертации ог.ублпкизапя з сєг:;і печатных работах.
Работа изложена па Ы(: страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц п II рисунков. Список использованной литературы включает 104 источника, з том числе 141 иностранных авторов.
Зкспериментслыке исследования выполнены в лаборатории криобиологии Института физиологии АН Ры, з центре автоматизации, и метрологии АН ?і"і и в лаборатории лкпкдкого обмена 'института биохпмп;; А/Т Республик;-! Узбекистан. Научно-производствен-
гае опиты проводили на базе вивария Иноїитута фивиологии АН РМ и опытного хозяйотва Украинского НИИ птицеводства. Опыты проведены с использованием спермы хряков нрупной белой и петухов родайланд-окой пород, а также на курах коллекционных пород Украинокого НИИ птицеводства.
Плазматичеокие мембраны выделяли по метод-ке Ivanov, Profi-rof (Г98І) в модификации В.А.Наука, Г.В.Борончукэ, Н.Г.Дмитрен-ко (1986).
Активность Kg+ (Na+ + К+)~АТФазы и Б -нуклеотидааы определяли по методике Ivanov, Profirov (1Э81). Акгивнооть щелочной фосфатази изучали по методике Боданокого, олиоанной А.Покровоким (1969). Определение неорганического фоофора проводили по Ohen et el. (1956).
Определение общего белка проводили по методу Lowry et ві. (1951).
ЭкСТраКЦИЮ ОбЩИХ ЛИПИДОВ ПРОВОДИЛИ ПО Bligh, Dyer (1959).
Содержание общих липидов в экстракте исоледовали по Bragdon (1951), описанному В.И.Скороходом, М.В.Стефанником (1983).
Аминокиолотный анализ проводили в Центре автоматизации и метрологии АН РМ при помощи аминокислотных анализаторов фирмы "Хитачи" (Япония) и "Бекман" (ФРГ).
Разделение липидов осуществляли при помощи тонкоолойной хроматографии в лаборатории липвдиого обмена Инотитута биохимии АН Республики Узбекистан. Содержание общих фосфолипидов и их фракции определяли по, лилидному фосфору методом Ваоильковокого, описанным Н.Е.Кучеренко, А.Н.Васильевым (I9B5).
Замораживание спермы петухов проводили в пайетах объемом 0,25 мл на программном замораживаюле биоматериалов, при использовании среды Schramm, Hubner (1989), содержащей 21$ ДИМеТИЛ-формамида (Терещенко, 1988).
Оценку качества оттаянной спермы петухов по подвижности спермиев проводили под микроскопом при 450-кратном увеличении, по десятибалльной шкале. Определение количества спермиев-с целыми и повреаденными мембранами головок проводили по методу На-langk, Bohnensock (1982), модифицированному (Терещенко, 1988) для анализа сперш петухов, на флуориметре о применением для окраски образцов флуорохрома-этидиум бромида.
Замораживание оперт хряков проводили по методу Всесоюзного института животноводства (Мнлованов и др., 19-74) о использованием криозащнтной среды этого яе института (Кононов, Голышев,
5 Нарижный, 1978) и стабилизатора мембран (Саатов, Исаев, 1989).
Искуоотвенное осеменение нур заморояенно-огтаянной спермой проводили в яйцевод на глубину 2 см. Первое и второе осеменение проводили о интервалом в одни сутки, а последующие - один рад в 3 дня. Сбор яиц проводили через день пооле второго ооеменения. Результаты ооеменения кур определяли по итогам инкубации яиц.
Биометрическую обработку подученных результатов проводили по Е.К.Меркурьевой (1964) и Г.Ф.Лакину (1980).'