Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Структура нервно-мышечного синапса 12
1.1.1. Структура нервной терминали 12
1.1.2. Постсинаптическая область синапса 13
1.2. Брюшная нервная цепочка и иннервация соматической мышцы (дождевого червя) .13
1.2.1.Чувствительность к медиаторам мышечных клеток соматической мышцы дождевого червя 16
1.2.1.1.Ацетилхолин 16
1.2.1.2. Гамма-аминомаслянная кислота 17
1.2.1.3. Адреналин и норадреналин 17
1.2.2. Нервно-мышечные синапсы соматической мускулатуры аннелид (дождевого червя). 18
1.3. Механизмы секреции медиатора 19
1.3.1. Квантово-везикулярная гипотеза секреции медиатора 20
1.3.2. Экзо-эндоцитозный везикулярный цикл 21
1.3.3. Белки «молекулярной» машины везикулярного цикла 23
1.3.4. Кальциевые каналы пресинаптической мембраны. Роль Ca2+ 28
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 30
2.1. Объект исследования и растворы 30
2.2. Оптический метод изучения экзо-эндоцитозного цикла с применением эндоцитозных маркеров 30
2.4. Применение флуоресцентного зонда Dil, переносимого аксонным транспортом из тел мотонейронов в нервные окончания 32
2.5. Количественное определение содержания ацетилхолина в мышце оптическим методом 32
2.6. Иммуноцитохимическая идентификация Н-холинорецепторов, синтаксина 1, синаптотагмина 1, альфа 1В субъединицы Са-каналаN–типа методами конфокальной микроскопии 34
2.7. Использованные химические реактивы 35
2.8. Статистический анализ полученных данных 36
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 37
3.1. Изучение везикулярного цикла в нервных образованиях соматической мышцы37
3.1.1. Определение нервно-мышечных синапсов 37
3.1.2. Доказательства наличия связи между «синаптическими бутономи» и ганглиями брюшной нервной цепочки 39
3.1.3. Изменение МПП нервных окончаний при увеличении К+ в экстраклеточном растворе. 41
3.1.4. Изучение везикулярного цикла с помощью флуоресцентного эндоцитозного красителя FM2-10 44
3.1.5. Роль вне- и внутриклеточного Са2+ в экзо-эндоцитозном цикле 48
3.1.6. Заключение 50
3.2. Зависимость концентрации ацетилхолина в соматической мышце от интенсивности протекания везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах 50
3.2.1. Оптическое определение концентрации ацетилхолина в соматической мышце .50
3.2.2. Заключение 55
3.3. Иммуноцитохимическая идентификация Н-холинорецептора, синаптотагмина 1, синтаксина 1, Са2+ -канала N-типа в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мышцы 55
3.3.1.Определение Н-холинорецепторов в клетках соматической мышцы 55
3.3.2. Определение синаптотагмина 1, синтаксина 1, Са2+ -канала N-типа в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мышцы 60
3.3.3. Заключение 65
Глава 4. Заключение 66
Глава 5. Выводы 70
Список сокращений 71
Список иллюстративного материала 72
Список литературы 74
- Брюшная нервная цепочка и иннервация соматической мышцы (дождевого червя)
- Экзо-эндоцитозный везикулярный цикл
- Иммуноцитохимическая идентификация Н-холинорецепторов, синтаксина 1, синаптотагмина 1, альфа 1В субъединицы Са-каналаN–типа методами конфокальной микроскопии
- Роль вне- и внутриклеточного Са2+ в экзо-эндоцитозном цикле
Брюшная нервная цепочка и иннервация соматической мышцы (дождевого червя)
Известно, что низкие концентрации КХ (5х10"8 моль/л) вызывают увеличение МПП мышечных волокон у млекопитающих [14]. Однако, подобные концентрации в отношении потенциала покоя у червя оказались не эффективны [7]. Более высокие концентрации холиномиметиков, начиная с 5х10"6 моль/л, вызывают деполяризацию, приводящую в итоге, к мышечному сокращению. Присутствие мускарина в растворе не влияет на МПП мышечных клеток [7 ]. В то же время добавление в раствор классических Н-блокаторов, как d-тубокурарин, а-бунгаротоксин, или М-блокатора атропина не устраняет снижения МПП, возникающего под действием КХ [7].
Все вышеперечисленные блокаторы, взятые по отдельности, не влияют на МПП мышечных клеток. Предполагается, что АХ является основным претендентом на роль возбуждающего медиатора в двигательной нервно-мышечной системе дождевого червя [13, 169]. В то же время рецепторно-канальный комплекс мембраны мышечных клеток, по-видимому, представляет собой особый тип АХ-рецептора Н-типа, отличного от такового в скелетных мышечных волокнах позвоночных [7; 169]. 1.2.1.2. Гамма-аминомаслянная кислота
На основании имеющихся данных гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) вызывает увеличение трансмембранной разности потенциалов в клетках соматической мышцы дождевого червя через активацию работы Na/K-помпы [4]. Предполагается, что мышечная мембрана содержит ГАМК-ергические структуры, сходные с рецепторами А- и В-типа позвоночных [10]. При этом считается, что преобладают рецепторы В-типа, тогда как рецепторы С-типа полностью отсутствуют [10]. Активация активных ионных насосов происходит через следующую цепочку событий: активация В-рецепторов, открытие Са-каналов при посредничестве G-белков, активация входящим кальциевым током Са-акцепторных белков по типу кальмодулина [10].
Установлено, что ГАМК и баклофен, специфический аганонист В-типа рецепторов, утрачивают способность гиперполяризовать мембрану мышечных клеток дождевого червя в присутствии карбахолина. Предполагается, что карбахолин способен непосредственно ингибировать "уабаинчувствительную" составляющую Nа+, К+-насоса, препятствуя тем самым активирующему влиянию на последнюю ГАМК и баклофена [13].
Таким образом, можно думать, что потенциал покоя мышечных клеток дождевого червя находится под двойным влиянием, как со стороны холинергической иннервации, так и, в значительной степени ГАМК-ергической [13;169]. Последняя может претендовать на роль «тормозной» иннервации.
Медиатор норадреналин и гормон адреналин в физиологических концентрациях – влияют на потенциал покоя клеток мышечной стенки дождевого червя [5].
Норадреналин реализует свое действие через активацию работы активных ионных насосов [5]. Адреналин обладает аналогичным действием, однако в данном случае, прирост МПП по абсолютной величине выражен почти втрое меньше по сравнению с увеличением потенциала покоя под действием норадреналина. Данные препараты реализуют свое действие через адреночувствительные структуры альфа и бета-типа. При этом мембрана мышечных клеток дождевого червя содержит в основном адренорецепторы остипа, количество Р-адренорецепторов значительно ниже [5]. Способность норадреналина и адреналина увеличивать потенциал покоя мышечных клеток дождевого червя через активацию работы Nа+, К+-насоса при участии адренергических структур сарколеммы, носит выраженный Са-зависимый характер [5; 9]. Однако системы циклических нуклеотидов в этот процесс не вовлечены [9].
Нервно-мышечные синапсы соматической мускулатуры аннелид (дождевого червя) В кожно-мускульном мешке дождевого червя, начиная с головных сегментов и до хвостовых в состав брюшной нервной цепочки входят гигантские: вентральный, медиальный и латеральный нервные тяжи, соединяющиеся с нейронами сегментарных ганглиев с помощью синаптических контактов.
Известно, что данные структуры принимают участие в рефлекторной деятельности (рефлекс избегания) [113].
Нервно-мышечные синапсы аннелид (дождевой червь) имеют небольшие размеры (диаметр 1-2 мкм). [104; 63; 163]. Группа таких синапсов образуют кластеры «синаптических бутонов» [115]. Данные образования наблюдаются между аксоном гигантского волокна и двигательными нейронами вентрального нервного тяжа [27; 119].
В исследованиях последних лет, в периферической нервной системе червей было выявлено множество различных синаптических образований, отличающихся структурным разнообразием и, являющимися, «нестандартными» по сравнению с синапсами позвоночных [173].
Использование методики окрашивания эндоцитозным маркером FM1-43 позволило выявить в мышечной стенке дождевого червя синапсы мотонейронов, интенсивность окрашивания которых, менялась в зависимости от мышечной активности [148]. Так, механическая стимуляция мышечной стенки тела дождевого червя способствует выявлению флуоресцентных пятен (FM1-43). При этом интенсивность флуоресценции зависит от концентрации К+ и Са2+ в растворе [107, 115]. В то же время, более углубленные исследования в этой области не проводились.
С помощью внеклеточных электродов (работа с внутриклеточными электродами затруднена из-за спонтанной двигательной активности) в клетках мышечной стенки дождевого червя регистрируются миниатюрные возбуждающие синаптические токи (МВСТ). При этом, в одной синаптической зоне регистрируются три типа МВСТ - одноэкспоненциальные с т - спада 1,2 мс, одноэкспоненциальные с т - 8,0 мс и двухэкспоненциальные с т - 1,2 и 8,0 мс, соответственно. Высказывается предположение, что мышечные клетки дождевого червя содержат как минимум две популяции ацетилхолинчувствительных ионных каналов, различающихся временем открытого состояния [8].
Экзо-эндоцитозный везикулярный цикл
В экспериментах использовали флуоресцентные красители – FM1-43 и FM4-64 в концентрациях 2-3 мкмоль/л, а также FM2-10 в концентрации 22-24 мкмоль/л. Указанные красители обратимо связываются с поверхностными мембранами и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся везикул («загрузка») [23]. Загрузка красителя проводилась в основном растворе в течение 3 мин. В целях уменьшения фонового свечения после загрузки красителя препарат содержался в течение 10 мин в основном растворе без перфузии. Для определения динамики потери красителя, предварительно загруженные нервные окончания подвергали воздействию растворов с разными концентрациями К+ (0, 3, 10, 40 ммоль/л), регистрируя в течение 40-50 мин снижение интенсивности свечения. Для обеспечения диссоциации красителя от мембран применяли реагент ADVASEP-7 в концентрации 10 мкмоль/л. Каждую серию экспериментов проводили на 10-12 червях.
Флуоресценцию наблюдали с помощью CCD видеокамеры DP71 (Olympus, Германия) и микроскопа Olimpus BX51 (Япония), оснащенного объективом LUMPLFL 60 XW и конфокальной системой DSU. При работе с флуоресцентными маркерами использовали возбуждающий светофильтр – 470±10 нм и эмиссионный фильтр, пропускающий свет длинной волны более 515 нм. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах свечения пикселя (с применением программы Cell P и Image Pro). При работе с маркерами использовали следующий способ оценки флуоресценции. Значение фонового свечения определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 50 пикселей в участке изображения без нервного окончания. Флуоресценцию нервного окончания определяли после вычитания фоновой флуоресценции [129]. Интенсивность свечения оценивали как среднее свечение всех пикселей в контуре центрального участка (40 мкм) отдельной нервной терминали или как среднее свечение всех пикселей в контуре отдельных пятен (свечение пятен).
Оптический метод контроля за изменениями потенциала покоя нервных образований с использованием потенциалчувствительного флуоресцентного маркера DiABAC4 (3) Для регистрации изменения величины МПП нервных окончаний использовали потенциалчувствительный флуоресцентный маркер DiBAC4 (3), связывающийся с внутриклеточными белками цитоплазмы и светящийся в зеленом спектре [112]. В процессе деполяризации клеточной мембраны усиливается вход красителя в цитоплазму, что сопровождается увеличением интенсивности свечения. Гиперполяризация мембраны приводит к противоположному эффекту. После выделения мышечного препарата его помещали в ванночку для экспериментов с 2 мл бескалиевого раствора. После чего добавляли 0,5 мкл (2 мкмоль/л) DiBAC4 и выдерживали 40 мин.
Измерения интенсивности флуоресценции производили каждые 2 мин в диапазоне времени 2-10 мин. После чего последовательно производили замену раствора на следующий, содержащий соответственно 3, 10 и 40 ммоль/л К+ и повторяли процедуру измерения интенсивности флуоресценции в таких же временных интервалах.
Применение флуоресцентного зонда Dil, переносимого аксонным транспортом из тел мотонейронов в нервные окончания Для окрашивания нервных окончаний в ряде экспериментов применяли флуоресцентный мембранный зонд Dil, светящийся в зеленом спектре (возбуждающий светофильтр 470 – 500 нм, эмиссионный фильтр 530 – 570 нм).
Кристалл красителя накладывали на ганглии брюшной нервной цепочки. В дальнейшем системой антероградного аксонального транспорта и латеральной диффузией краситель распространялся из сомы нейронов по нервным проводникам и окрашивал нервные образования [123].
Количественное определение содержания ацетилхолина в мышце оптическим методом Оптическая детекция АХ [16] осуществлялась с помощью набора Amplex Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit (Molecular Probes, США). Применялись следующие концентрации реагентов: ацетилхолинэстераза 1 един. акт. / мл, холиноксидаза 1 един. акт. / мл, пероксидаза хрена 2 един. / мл, реактив AmplexRed 400 мкмоль/л. Для оценки неспецифического свечения связанного с генерацией экзогенной перикиси водорода в экспериментах использовали смесь из пероксидазы хрена и реактива Amplex Red. Для работы с Amplex Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit применялись: возбуждающий светофильтр 560±10 нм, эмиссионный, пропускающий свет с длинной волны более 590 нм. В случае применения набора Amplex Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit регистрировалось свечение в области 50 Х 50 мкм в районе, содержащем скопления «синаптических бутонов». Перерасчет единиц свечения в количественные показатели АХ в мкммоль/л проводили с помощью калибровочной кривой (рисунок 2).
Иммуноцитохимическая идентификация Н-холинорецепторов, синтаксина 1, синаптотагмина 1, альфа 1В субъединицы Са-каналаN–типа методами конфокальной микроскопии
Для статистической обработки полученных экспериментальных данных применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Поскольку данный метод можно использовать только в отношении совокупностей имеющих нормальный характер распределения предварительно строили гистограммы имеющихся данных с целью доказательства их нормального характера распределения. Метод Стьюдента позволяет определить достоверность разности средних значений двух несвязанных или попарно связанных совокупностей. Различия считали достоверными, если Р 0,05. Статистический анализ производили с помощью программы Origin 6.1 (Origin Lab Corporation, 1991-2000).
Ранее было показано, что применение флуоресцентного красителя FM1-43 выявляет светящиеся «пятна» в мышечной стенке дождевого червя. Последнее, по мнению авторов, предполагает возможность применения данного метода для визуализации процессов, происходящих в синаптических образованиях у аннелид, так же, как и у позвоночных животных [148].
Инкубация в течение 3 минут мышечного препарата в растворе с нормальным содержанием К+ в присутствии красителя FM1-43 приводила к появлению окрашенных структур, по форме напоминающих «гроздья винограда». При этом отдельная гроздь состояла из нескольких десятков пятен овальной формы 1-2 мкм в диаметре (рисунок 3, а). Скопления пятен располагались в строгом порядке, в непосредственной близости от утолщений брюшной нервной цепочки: в каждом метамере тела животного было обнаружены по два подобных скопления, лежащих симметрично по обе стороны от срединной линии.
Это согласуется с ультраструктурными исследованиями мионевральных синапсов соматической мускулатуры аннелид [61], а также данными по оптическому выявлению синаптических структур, с помощью флуоресцентных красителей, в мышце дождевого червя [115].
Поскольку известно, что диаметр синаптических бутонов нервных терминалей равен примерно 1 мкм, то можно предположить, что выявляемые нами светящиеся «гроздья винограда» представляют собой скопления или кластеры «синаптических бутонов», где отдельное пятно соответствует одной или, возможно, нескольким «синаптическим терминалям» [148]. Как показали опыты, свечение помеченных FM1-43 структур в течение 1-2 часов практически не менялось (рисунок 3, б). С одной стороны, загрузка FM1-43 свидетельствует о протекании в данных объектах процессов эндоцитоза, которые в пресинаптических нервных окончаниях следуют за экзоцитозом синаптических везикул. С другой стороны, выгрузка красителя из нервной терминали не наблюдается. Данный факт может говорить об отсутствии экзоцитоза, но данное предположение противоречит факту избирательной окраски синаптических везикул специфическим маркером. Более вероятным объяснением этого феномена может быть прочное связывание данного красителя с мембраной, и как результат в ходе экзоцитоза маркер не успевает освободиться от мембраны и повторно захватывается нервным окончанием. Последнее предположение подтверждается опытами с реагентом ADVASEP-7, ускоряющим отделение молекул красителя от наружного монослоя мембраны. Применение данного препарата позволило выявить снижение интенсивности флуоресценции окрашенных образований с течением времени (рисунок 3, в).
Роль вне- и внутриклеточного Са2+ в экзо-эндоцитозном цикле
Считается общепринятым, что в секреторных клетках протекание везикулярного цикла напрямую зависит от концентрации Са2+ как во внеклеточной, так и во внутриклеточной среде [180]. В безкальциевом растворе загрузка флуоресцентным маркером также происходила, хотя и заметно в меньшей степени (рисунок 9, а). Только после выдерживания препарата червя в течение 40 минут в растворе с 0.05 или 0.5 ммоль/л BAPTA (внеклеточный буфер Са2+) аппликация FM2-10 не приводит к появлению светящихся «пятен», что можно расценить как блокаду процессов экзо-эндоцитоза. Для изолирования внутриклеточного Са2+ был использован мембранопроникающий Са2+-буфер ВАРТА-АМ. Выдерживание препарата в течение 20 мин в растворе с его присутствием не прекращало окрашивание нервных окончаний (рисунок 9, б). И только при 40-60 мин инкубации наблюдалось полное прекращение загрузки FM2-10 (рисунок 9, в). То есть минимальные концентрации внеклеточного и внутриклеточного Са2+ требуются для протекания везикулярного цикла. Данные экспериментов свидетельствуют о высоком сродстве к Са2+ сенсоров, контролирующих экзо-эндоцитозный цикл в синаптических бутонах дождевого червя, которые, весьма вероятно, работают по принципу «все или ничего».
Таким образом, проведенные эксперименты позволяют прийти к следующему заключению. Применение эндоцитозных маркеров показало наличие в мышечной стенке дождевого червя светящихся «пятен», образующих структуры, напоминающие «гроздья винограда», которые, являются кластерами «синаптических бутонов, связанных с брюшной нервной цепочкой В данных образованиях интенсивно протекают процессы экзо- и эндоцитоза, даже в состоянии «относительного покоя». Данный везикулярный цикл: потенциал-, К+-и Ca2+ зависимый, причем, весьма вероятно, что кальциевый сенсор работает по принципу «все или ничего».
На 2-3 мин после смены раствора содержащего 3 ммоль/л К+ на раствор с 10 ммоль/л К+ происходит достоверное увеличения свечения «пятен» (рисунок 10). При увеличении концентрации К+ до 40 ммоль/л в этом же временном интервале интенсивность свечения продолжает расти, что можно трактовать как усиление процессов везикулярного рециклирования (рисунок 10). В без кальциевом растворе интенсивность свечения сопоставима с основным раствором (рисунок 10) и только при добавлении в этот раствор ВАРТА (0,05 или 0,5 ммоль/л) показатели свечения приближаются к фоновым, но только через 30-40 мин (рисунок 10). Последнее можно расценить как подавление процессов экзо 51 эндоцитоза. Для целью подтверждения факта деполяризации мембраны нервных образований при смене растворов с разной концентрацией К+ были произведены эксперименты с применением флуоресцентного потенциалчувствительного маркера DiBAC4(3). Увеличение концентрации К+ в растворе (3, 10, 40 ммоль/л) смещает соответственно величины свечения нервных образований в сторону больших значений (рубрика 4.3; рисунок 6).То есть, чем выше концентрация К+ в растворе, тем интенсивнее происходит деполяризация мембраны.
Поскольку метод регистрации уровня АХ во внеклеточной среде основан на определении перекиси водорода. Первоначально определяли свечение, которое возникает при инкубации препарата с пероксидазой хрена и реактивом Amplex Red. Уровень свечения не зависел от концентрации К+ и Са2+, а также присутствия Са2+ буфера BAPTA в наружном растворе и составил 40,1 +- 2,5, n=6 (фоновое свечение). В остальных экспериментах применялись все компоненты набора Amplex Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit.
В безкальциевом растворе с 0.5 и 0.05 ммоль/л BAPTA свечение было 40,2 +- 2,5 и 44,7 +- 2,7 (n=10) соответственно (данные приведены за вычетом неспецифического свечения), что практически соответствует фоновому уровню. При концентрации К+ в наружном растворе 0 и 3 ммоль/л существенного увеличения свечения не произошло (таблица 1).
Максимальная яркость флуоресценции наблюдалась при выдерживании препарата в растворе с 10 ммоль/л К+ (таблица 1). В растворе с концентрацией К+ 40 ммоль/л яркость свечения была несколько меньше, но не отличалась достоверно от показателей свечения при 10 ммоль/л К+ Но только свечение при К+ в 10 ммоль/л было достоверно выше по сравнению со значениями в основном растворе. В отсутствии Са2+ в среде показатели свечения были примерно такими же как и в основном растворе (таблица 1). При добавлении в такой раствор ВАРТА показатели свечения уменьшались и становились достоверно менее интенсивными по отношению к исходному раствору, но только при 40 мин. инкубации, однако и в этом случае не в столь выраженной степени (таблица 1).Таким образом, секреция АХ клетками червя усиливается при деполяризации мембраны нервных окончаний, однако достигает максимума уже при 10 ммоль/л К+. Дальнейшая деполяризация мембраны нервных терминалей при 40 ммоль/л К+ к увеличению определяемой концентрации медиатора не приводит. Отсутствие Са2+ в растворе сохраняет уровень АХ сопоставимый с исходным (3 ммоль/л) и лишь 40 мин. инкубация в присутствии ВАРТА приводит к его выраженному уменьшению (таблица 1).
Таким образом, увеличение деполяризации мембраны нервных элементов сопровождается синхронным убыстрением процессов экзо-эндоцитоза (предположительно усиление квантового выброса медиатора), а отсутствие Са2+ в среде, наоборот, замедляет эти процессы, что согласуется с данными литературы [180]. Однако, картина синхронного определения концентрации АХ в мышце не столь однозначна. Так можно отметить, что процессы экзо-эндоцитоза и выброс АХ, предположительно из нервных образований, достаточно интенсивны в состоянии покоя и даже в отсутствии Са2+ в растворе.
Деполяризация мембраны c увеличением концентрации К+ до 10 ммоль/л усиливает процессы как везикулярного цикла, так и повышает содержание АХ, но уже при концентрации в 40 ммоль/л К+ интенсивность экзо-эндоцитоза усиливается, а уровень АХ нет. В условиях, когда в среде без Са2+ при наличии ВАРТА свечение кластеров «синаптических бутонов» при окраске FM через 40 мин. достигало минимума, то снижение концентрации АХ в этом же временном интервале хотя и было достоверно меньшим, но не столь выраженным.
Можно думать, что наряду с квантовой секрецией АХ из нервных клеток существует «неквантовая» утечка, подобная той, что имеется в синапсах скелетной мускулатуры позвоночных. Весьма вероятно, что данная форма выделения АХ может быть очень значительной и быть как потенциал-, так и Са2+-независимой.
