Введение к работе
Трансплантация эмбрионов является одним из биотехнических приемов селекции в животноводстве, ускоряющий совершенствование стада в раде поколений. Программа трансплантации эмбрионов включает в себя метод замораживания и длительного хранения эмбрионов, что позволяет рационально и экономически эффективно решать острейшую проблему интенсификации животноводства и разведение высокопродуктивного скота.
Криоконсервирование - многоэтапный и кногофакторный процесс, в течение которого биологические объекты подвергаются действию различных физико-химических факторов, обусловленных изменениями температуры, составом компонентов и системы. Для достияеяия этой цели применяются искусственные среды, в состав которых входят специальные защитные вещества - криопрогекторы, а само охлаждение осуществляется программно.
Замораживание эмбрионов позволяет существенно удешевить и упростить программу трансплантации, внести элементы плановости и перевести ее на промышленную и коммерческую основу.
Актуальность. Криоконсервирование зародышей имеет большое значение как для практики животноводства, так и для фундаментальных исследований. С помощью этого метода возможно создание генетических банков, значение которых заключается в возможности сохранения инбредных, мутантных и рекомбинанткнх линий, которые представляют необходимый материал для экспериментальных биологических исследований:
в накоплении необходимого числа однородных эмбрионов для молекулярно -биологических и других исследований;
подбирать спонтанных реципиентов, соответствующих по половому циклу, возрасту эмбрионов и проводить пересадку в условиях ферм.
Для предохранения зародышей от холодового шока используют обогащенный фосфатно-солевой буфер, содержащий 1,4 М глицерина, другим криопротектором для защиты эмбрионов монет быть использован I,2-пропандиол.
На процесс успешного криоконсервирования оказывает большое влияние не только криопротектор, но, и совокупность охлаждающих скоростей, на основании которых выполняется программное замораживание эмбрионов. Режиму охлаздения должен соответствовать и
-г -
режим оттаивания.
Для повышения эффективности замораживания эмбрионов необходим поиск малотоксичних криопротекторов с целью внедрения в практику криоконсервирования эмбрионов метода витрификации.
Цель и задачи исследования. Цель исследований-заключалась в повышении жизнеспособности замороженно-оттаянных эмбрионов, путем совершенствования технологии криоконсервирования с учетом стадии развития и качества зародышей, сравнительных испытаний стационарных и мобильных замораживаталей, режимов охлаждения и отогрева, с применением высоких концентраций криопротекгора глицерина в сочетании 1,2-цропандиола и замораживании в газообразном азоте с неравномерным температурным полем, оттаивании и выведение криоцротектора из эмбриона с использованием сахарозы.
В задачу исследований входило:
изучить факторы, влияющие на жизнеспособность и приживля-емость замороженно-оттаянных эмбрионов;
определить влияние криогенных устройств, технологии замораживания и оттаивания на жизнеспособность эмбрионов;
сопоставить в сравнительном аспекте морфологическую оценку качества свежеполученных и замороженно-оттаяшых эмбрионов;
сравнить методику замораживания в газообразном азоте с традиционным методом замораживания;
выявить оптимальные режимы насыщения, криопротектором охлаждения и отогрева, определить влияние времени от получения до замораживания на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов;
разработать методику криоконсервирования эмбрионов с помощью высоких концентраций смеси криопротекторов глицерина с 1,2-пропандиолом на ФБС, путем прямого охлаждения в газообразном азоте;
исследовать метод оттаивания эмбрионов и выведения крио-консерванта с помощью раствора сахарозы.
Научная новизна работы заключается в определении влияния криогенных устройств на выживаемость эмбрионов, а также скоростей охлаждения и оттаивания, высокой концентрации смеси глицерина с 1,2-пропандиолом, усовершенствовании технологии криоконсервирования эмбрионов в газообразном азоте в неравномерном температурном поле и выведение криоцротектора сахарозой.
Практическая значимость работы состоит в усовершенствовании технологии замораживания эмбрионов крупного рогатого скота при использовании смеси криопрогекторов глицерина с 1,2-пропандио-лом на ФБС, что дает возможность сократить процесс криоконсер-вирования в 10 раз по сравнению с традиционным методом и исключить дорогостоящую аппаратуру.
Реализация результатов исследование
Результаты исследований внедрены в центре по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных клвотных (ВЖ) и подтверждены положительным решением по заявке на изобретение Js 4909691/13-13832 от 12 февраля 1991 г.
Апгобатая работы. Результаты исследований докладывались на ежегодных производственных совещаниях по трансплантации эмбрионов, на конференциях молодых ученых при Всесоюзном научно-исследовательском институте (Дубровный, 1989, 1990).
Объем работы. Диссертгшия--излояена-на -122 -страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, результатов и собственных исследований, выводов и практических предложений. Иллюстрирована 19 таблицами и 19 рисунками. Список использованной литературы включает 199 наименований, в том числе 138 иностранных.
Исследования по усовершенствованию технологии криоконсерви-рования эмбрионов крупного рогатого скота проведены в ВМе в период с 1988 по 1991 гг.
Эмбрионы получали от суперовулировавших коров, обработанных
гормональными препаратами ФСГ (США), ФСГ отечественного производ
ства - графолон, фоллитропин, фолликотропин (ЧСФР) и СЖК с анти
сывороткой нехирургическим методом. . .._
Морфологическую оценку проводили под лупой при 100-кратном
уВвЛИЧеНИЖ ИЛИ ПОД ИНВврТИрОВаНШМ МИКРОСКОПОМ "Photozooil"
при 400-кратном увеличении. Для криоконсервирования отбирали эмбрионы с неповреаденными равномерными по толщине ополесцирую-щими оболочками, клеточный комплекс которых соответствовал воз- .. расту от оплодотворения до извлечения (7-8 дней). Биологически полноценными считали эмбрионы, имеющие правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежденную оболочку,
одинакового размера бластомери с шіотннм межклеточным комплексом. Морфологическуи оценку жизнеспособности свежеполученных и заморояенно-оттаянннх эмЗрионов проводили по пятибалльной шкале,, разработанной в ВИЕе.
Эмбрионы замораживали в растворе криопротектора 1,4 М концентрации глицерина на замораживающих устройствах "Planer" R-204-, ГОІІ-І, РПЗ, ЗПЭ, ЗЭМ-I и в газообразном азоте. Так же в качестве криопротектора использовали глицерин в сочетании с 1,2-пропандиолом и замораживали в газообразном азоте. Все необходимые растворы готовили на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко (С).
В соответствии с методикой исследований эмбрионы были разделены на три группы. Первая группа - эмбрионы насыщали раствором 1,4 Ы концентрации глицерина в 4 этапа. Вторая - смесь криопротектора 25% глицерина + 25% 1,2-пропандиола и насыщали эмбрионы в два этапа. Третья - эмбрионы насыщали криопрогекторной смесью, состоящей из 20% глицерина + 40% 1,2-пропандиола в три ступени. Эмбрионы, насыщенные в растзоре 1,4 Ы глицерина, замораживали на программном замораживателе и в газообразном азоте. Скорость охлавдения - от,комнатной температуры до -7С была 1С/мин, кристаллизация и далее со скоростью 0,3С/мин до -36С, затем переносили эмбрионы в яидкий азот для хранения. Замораживание эмбрионов второй и третьей группы проводили методом витри-фякации, который осуществлялся в газообразном азоте. С помощьв температурного датчика укладку паетт с эмбрионами устанавливали в газообразном поле жидкого азота на уровне температуры -60-65С и наблюдали как криопротектор принимал стекловидное состояние, т.е. застывал без образования кристаллов, данное состояние наступало через 1,5-2 мин. В течение 10 мин выдерживали на данном уровне газообразного азота, а затем погружали в жидкий азот на хранение.
Оттаивание замороженных паетт с эмбрионами проводили в водяной бане при температуре +37С и +30С в течение 8-Ю секунд, это если биоматериал криоконсервирован в растворе криопротектора 1,4 М концентрации глицерина. Эмбрионы были замороженные в смеси растворов: 25% глицерина + 25% 1,2-пропандиола осуществляли отогрев при температуре +37С, 20% глицерина + 40% 1,2-про-
пандиола были оттаяны при температуре водяной бани +20С в течение 3-5 секунд.
Отогретые паетты освобождали от маркерной пробки с одного конца, а с другого отрезали пыж и ее содержшлое переносилось на часовое стекло, где проводили поиск и морфологическую оценку эмбрионов. Жизнеспособные, пригодные для пересадки эмбрионы, использовали для трансплантации.
Выведение криопротектора из эмбриона осуществляли с помощьв раствора сахарозы в 0,5 М (3-5 минут) и I М (5-Ю минут).
После отмывания эмбрионов от криопротектора и морфологически оцененных их помещали в паетты и пересаживали реципиентам. В качестве реципиентов использовали телок черно-пестрой породы в возрасте 16-18 месяцев с живой массой 350-380 кг. Телкам -реципиентам по спонтанной и синхронизированной охоте в день гормональной обработки вводили фронтально тетравит в дозе 5,0 мл.
Полученные" экспериментальные .данные.-,., подвергали- „статистической обработке по методике Мгрідаьевой Е.К. (1970) с помощью X2, предложенного К.Присоном.
Экспериментальную работу проводили в соответствии со схемой исследований.
Жизнеспособность и приживляемость эмбрионов крупного рогатого скота на разных замораживателях
Удаление криопротектора
Замораживание эмбрионов в газообразном азоте
жизнеспособность и при живляемость эмбрионов: стадия развития, качество, температура оттаивания
Дальняя транспортировка замороженных эмбрионов
R-204
У0П-І
ЗЭМ-1
ЕЛ.
Режимы охлаждения
Время хранения эмбрионов до криокон-сервирования
.Нитрификация
Состав криопротектора
Культивирование
Трансплантация