Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА I. Обзор литератур CLASS ы
1.1. Современные представления о строении эритроцитарных мембран б
1.2. Транспортные функции эритроцитарных мембран 16
1.3. Физиологическое действие желчных кислот и их влияние на клеточные мембраны 24
1.4. Синтетические поверхностно-активные вещества /ПАВ/ и их физиологическое действие 28
Экспериментальная часть
CLASS ГЛАВА 2. Объекты и методы исследовани CLASS й
2.1. Определение проницаемости эритроцитарных мембран для мочевины 33
2.2. Методика хронических опытов 36
2.3. Определение транспорта кислорода через эритроцитарные мембраны 37
2.4. Применяемые вещества 40
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Влияние желчных кислот и пальмитата натрия на проницаемость эритроцитарных мембран для мочевины 43
3.2. Проницаемость эритроцитарных мембран для мочевины в организме крыс при действии желчных кислот 57
3.3. Транспорт кислорода через эритроцитарные мембраны при воздействии желчных кислот 68
3.4. Действие синтетических ПАВ на проницаемость эритроцитарных мембран для мочевины 75
3.5. Влияние синтетических ПАВ на проницаемость мембран эритроцитов для мочевины в организме крыс 88..-
3.6. Изучение влияния синтетических ПАВ на транспорт кислорода через эритроцитарные мембраны 92
3.7. Обсуждение результатов 97^
Выводы 109
Практические рекомендации
Литература 112
- Современные представления о строении эритроцитарных мембран
- Транспортные функции эритроцитарных мембран
- Определение проницаемости эритроцитарных мембран для мочевины
- Влияние желчных кислот и пальмитата натрия на проницаемость эритроцитарных мембран для мочевины
Введение к работе
В Материалах ХХУТ съезда КПСС отмечено, что в области естественных наук одной из важнейших проблем является познание физиологических и биохимических процессов жизнедеятельности человека / I /. Большое внимание привлекает изучение мембранных процессов, представляющих собой исследования, проводимые на клеточном и субклеточном уровне. Важной задачей является поиск физиологически-активных веществ, которые могут модифицировать биологические мембраны. Среди физиологически-активных веществ все большее внимание привлекают поверхностно-активные вещества / ПАВ / организма.
В настоящее время имеется крайне мало работ физиологического плана, касающихся влияния ПАВ на те или иные функции организма. Между тем, эти исследования являются важными, так как к поверхностно-активным веществам можно отнести легочные сурфак-танты, стероидные гормоны, многие липиды, соли желчных кислот. Большое значение для понимания механизма действия ПАВ организма имеет изучение влияния желчных кислот на различные физиологические процессы. За последние годы появились работы, посвященные влиянию желчных кислот на обменные процессы, на нормальные и патологические функции организма. Обнаружено влияние малых концентраций желчных кислот на клеточные мембраны.
Поскольку желчные кислоты являются постоянными компонентами плазмы крови, то особый интерес представляет изучение их физиологического действия на эритроцитарные мембраны.
Так как желчные кислоты имеют дифильное строение молекул и относятся к эндогенным ПАВ, то можно предположить, что
Большинство имеющихся работ касается гемолитического действия больших концентраций ПАВ на эритроциты. Вопрос о влиянии малых концентраций ПАВ на эритроцитарные мембраны изучен недостаточно.
Целью нашей работы было: изучение изменений функциональ« ных свойств эритроцитарных мембран при действии малых концентраций желчных кислот и некоторых синтетических ПАВ. Для ИС« следования использована спосооность эритроцитарных мембран к транспорту кислорода и мочевины. Полученные данные позволяют выяснить роль желчных кислот организма в функционировании эритроцитарных мембран и наметить пути поиска новых физиоло*» гически-активных веществ для воздействия на транспортные функции эритроцитарных мембран
** Q *»
Современные представления о строении эритроцитарных мембран
Создание барьера для прохождения веществ и осуществление избирательного их транспорта в эритроциты, а также массопере-нос кислорода - важнейшие функции эритроцитарных мембран, которые обеспечивают поддержание клеточного гомеостаза в условиях больших различий химического состава цитоплазмы клеток и среды.
Проникновение веществ через мембрану может осуществляться с помощью различных механизмов на основе растворимости в липи-дах в виде пассивной /свободной/ диффузии, облегченной или катализируемой диффузии и активного переноса с затратой энергии.
Из-за большой плотности упаковки молекул липидов и наличия в бислое гидрофобной зоны макромолекулы не проникают через него, а низкомолекулярные гидрофильные вещества проникают чрезвычайно медленно / 5,63,126 /. Гидрофобные вещества, обладающие хорошей липидорастворимостью, относительно легко дифунди-руют через липидный бислой мембраны / 145 /. Диффузия гидрофильных молекул через липидную фазу мембраны связана с наличием в ней динамических пор / 165 /.
Позднее было установлено, что прохождение различных веществ через эритроцитарную мембрану зависит от размера их молекулы. Проницаемость мембран для некоторых малых молекул оказывается более высокой, чем это можно было ожидать на основании данных об их растворимости в липидах. В частности, такие гидрофильные вещества, как глицерин, мочевина, радиус молекул которых не привышает ЗЙ, хорошо проникают через мембрану. Однако, -проникновение малых молекул /вода, метанол и др./ через мембрану не соответствует их коэффициенту распределения между маслом и водой. Исходя из этого было высказано предположение, что мембрана имеет поры, заполненные водой. Перенос веществ по водным каналам, "выстланным" белком подчиняется законам диф-фузии / 125 /. Через эритроцитарные мембраны по белковым ка-налам могут проходить вода, низкомолекулярные неэлектролиты и некоторые другие вещества / 106,134 /. Увеличение размеров молекулы может снижать проницаемость несмотря на то, что при этом гидрофобность соединения может возрастать. Так, более гидрофобные молекулы метил- и этилмочевины проникают в клетки хуже, чем "обычная" мочевина / 155 /. Для производных мочевины с более длинной углеводородной цепью проницаемость вновь возрастает за счет прохождения их через липидные участки мембран / 76,150 /.
Медленное проникновение ионов объясняется наличием в порах мембран электрических зарядов. Преобладание положительных или отрицательных зарядов резко изменяет скорость поступления катионов и анионов. Обычно более быстро в клетку поступают ка тионы. Однако, через эритроцитарную мембрану анионы поступают быстрее катионов / 21,79 /.
Для объяснения высокой проницаемости эритроцитарных мембран по отношению к сахарам, аминокислотам и некоторым другим соединениям была выдвинута концепция, называемая облегченной диффузией. Эта гипотеза предусматривает наличие специфических переносчиков, связывающихся с транспортируемыми веществами и облегчающих их прохождение через мембрану.
В ранних работах под переносчиком подразумевали белок, при специфическом связывании с которым транспортируемого вещества происходит диффузия или вращение образовавшегося ком -плекса в мембране так, что вещество оказывается на стороне мембраны, противоположной связыванию. Свободный же переносчик диффундирует обратно к наружной поверхности мембраны, где соединяется с новой молекулой вещества. В последнее время выдвинуты возражения / 87 / против возможности функционирования подобных переносчиков в мембранах и высказано предположение о наличии пронизывающих мембрану белков, осуществляющих "внутренний" перенос субстрата посредством структурной перестройки / 163 /. В эритроцитах белки переносчики осуществляют транспорт Сахаров и анионов / 63 /.
Наиболее важной формой прохождения веществ через мембраны является активный перенос, при котором вещества накапливав ются в клетках в концентрациях, значительно превышающих их концентрации в окружающей среде / б /. Активный транспорт веществ в эритроциты связан с затратой энергии на разрыв водородных связей, образованных с водой, на поступление против градиента концентрации. Активный перенос происходит с использованием энергии АТФ. В эритроцитах с непосредственным расходованием энергии АТФ осуществляется перенос ионов Д/а+, К+, Са / 84 /. Примером активного переноса может служить натриевый насос, который "выкачивает" ионы И/а+ из эритроцитов, что эквивалентно непроницаемости мембран к наружному катиону. Проникающие же ионы распределяются согласно доннановскому равновесию / 52 /.
Транспортные функции эритроцитарных мембран
Проницаемость эритроцитарных мембран исследовали по методике В.Н.Колмакова / 41 /. Сущность этой методики состоит в том, что проницаемость эритроцитов определяется по степени их гемолиза в изотоническом /0,3 М/ растворе мочевины.
Степень гемолиза оценивается по изменению оптической плотности взвеси эритроцитов при красном светофильтре. Момент прекращения изменений оптической плотности взвеси считали окончанием процесса гемолиза. Время от момента добавления взвеси эритроцитов до прекращения гемолиза определяли как время гемолиза - величина, обратно пропорциональная проницаемости эритроцитов.
В наших исследованиях для более точной характеристики проницаемости эритроцитов определяли динамику гемолиза путем измерения оптической плотности взвеси эритроцитов на спектрофотометре СФ-4А при длине волны /\ тзнм через каждые 10 секунд в течение 120 секунд. Опыты ставили на эритроцитах крупного рогатого скота. Кровь брали на Черновицком мясокомбинате и разбавляли 5% цитратом натрия в соотношении 1:5. Ци-тратная кровь сохранялась в холодильнике при -йС. Исследования проводили при комнатной температуре /20-21С/. Кровь центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин. Эритроциты отмывали дважды 5-кратным объемом физиологического раствора
-Д/аСІ и готовили 50 взвесь эритроцитов в физиологическом растворе. Готовили 0,3 М раствор мочевины /ЧДА, Черкасского завода химреактивов/. В пробирку вносили 9 мл раствора мочевины, I мл взвеси эритроцитов и смешивали; замечали время и переносили смесь в кювету толщиной Ю мм. Каждые 10 с определяли экстинкцию Еб-г«г. Для проведения расчетов определяли исходную оптическую плотность смеси, содержащей 9 мл физиологического раствора и I мл 50$ взвеси эритроцитов. Определяли также оптическую плотность смеси эритроцитов в 0,3 М растворе мочевины при полном гемолизе эритроцитов, который вызывали добавлением 2-3 капель раствора аммиака. Нелчные кислоты и синтетические ПАВ добавляли к 0,3 М раствору мочевины в процессе ее приготовления. Конечная концентрация ПАВ в кювете составляла 10- 1 10 г/мл. Изменения проницаемости эритроцитарных мембран при действии ПАВ характеризовали по изменению динамики гемолиза эритроцитов по сравнению с контрольными опытами. % эритроцитов, гемолизированных в 0,3 М растворе мочевины, определяли по формуле: ЕН ЕУ Я гем = -- . 100, Ен - Ео где Е„ - исходная оптическая плотность суспензии эритроцитов; Е0 " оптическая плотность суспензии эритроцитов при полном гемолизе; Ev - оптическая плотность суспензии эритроцитов в определенное время / 10,20,30 с и т.д. /.
Так как степень гемолиза эритроцитов в 0,3 М растворе мочевины оценивалась по изменению оптической плотности, то представляло интерес выяснение вопроса о том, что являлось причиной этих изменений « объем эритроцитов в кювете или из -менения количества гемолизированных эритроцитов, связанное со сдвигами проницаемости эритроцитарных мембран для мочевины и изменениями количества проникающей вслед за мочевиной воды. Для этого были проведены измерения объемов эритроцитов / 40 /.
Так как изменения процесса гемолиза могут быть связаны и с изменением транспорта мочевины, и с изменением резистент- ности эритроцитарных мембран, то было проведено морфометри-ческое исследование эритроцитов, а также определение осмотической резистентности. Результаты исследований статистически обрабатывались по методу разницы / 65 /. РН раствора определяли с помощью рН-метра рН«121. Всего поставлено 630 опытов с 18 препаратами ПАВ, проведено около 8000 определений экстинкции.
Опыты ставили на 30-ти половозрелых крысах линии Вистар массой 180-210 г. В качестве секвестранта желчных кислот при« меняли холестирамин фирмы УЕВ, который увеличивает выведение желчных кислот с фекалиями и, нарушая таким образом кишечно » печеночный кругооборот желчных кислот, приводит к снижению их содержания в плазме крови. Холестирамин добавляли к рациону крыс в дозе 2% от массы корма на протяжении 10 дней. Исследования проводили на 5-й, 6-й, 8-й и 10-й дни скармливания холестирамина. Кровь брали из хвостовых вен крыс в количестве 0,2 мл и добавляли в кювету к 1,8 мл 0,3 М раствора мочевины. Проницаемость эритроцитов определяли на СФ-4А, как описано выше /стр.33/. На 6-й и 8-й дни скармливания холестирамина делали внутрибрюшинные инъекции растворов желчных кислот и синтетических ПАВ в дозе 10 мг/кг массы и затем определяли проницаемость эритроцитов. Кровь для исследования брали через 15, 30, 60, 120 и 240 мин после инъекции. Кроме этого, прово-дили контрольные опыты на интактных крысах /не получавших холестирамин/. Определяли проницаемость эритроцитарных мембран интактных крыс и ее изменения после введения желчных кислот и синтетических ПАВ, Препараты вводили внутрибрюшинно в той же дозе, что и в условиях скармливания холестирамина; кровь для исследования брали через 30, 60, 120 и 240 мин после инъекции. Результаты статистически обрабатывались по методу разницы / 65 /.
Определение проницаемости эритроцитарных мембран для мочевины
Изменения проницаемости эритроцитарных мембран определяв ли по скорости образования оксигемоглобина /ОрНв/ при оксиге-нации суспензии эритроцитов. Влияние ПАВ на транспорт кислорода эритроцитарными мембранами исследовали по модифицированной нами методике Рэфтона / 152 / Метод рэфтона заключается в том, что при помощи фотоэлектронной установки световой пучок расщепляется на два, которые проходят через фильтры с разными пиками трансмиссии при разной длине волны А . Так как гемоглобин и оксигемоглобин обладают разными спектрами поглощения, то наблюдается значительная разница световой адсорбции по мере того, как гемоглобин насыщается кислородом. Наша модификация заключается в том, что вместо специальной фотоэлектронной установки для определения динамики образования окси-» гемоглобина при оксигенации, использовали спектрофотометр СФ-26, вакуумный насос BH-46IM, ртутный манометр /вакууметр/, приспособление для аэрации суспензии газами.
Цитратную кровь крупного рогатого скота центрифугировали при 2000 об/мин на протяжении 10 мин и отмывали дважды физиологическим раствором /VaCI. Опыты ставили на взвеси эритроцитов в физиологическом растворе в соотношении 1:1000. Взвесь эритроцитов помещали в колбу Бунзена и производили откачивание воздуха до необходимого разрежения /20-25 мм.рт.ст./. Под контролем вакууметра низкое давление поддерживали на протяжении 1,5 часа. Для уравновешивания газовой среды над раствором колбу периодически встряхивали, затем, поддерживая по -Заниженное давление с помощью вакуумнасоса, пропускали аргон для образования бескислородной среды над суспензией эритроцитов и более полной отдачи кислорода гемоглобином. Суспензию эритроцитов с восстановленным гемоглобином набирали из колбы Бунзена под вазелиновое масло в шприц /2 мл/ и переносили в кювету, также под вазелиновое масло. Желчные кислоты /натриевые соли/ и синтетические ПАВ растворяли в физиологическом растворе в концентрациях 1 10 - 1 10 г/мл и добавляли в количестве 0,1 мл в кювету с 1,4 мл суспензии эритроцитов. Ко -9 6 нечная концентрация ПАВ в кювете составляла 1,5 10 -1,5 10 г/мл. Определяли рН раствора, находящегося в кювете, с помощью рН-метра рН-121. Затем проводили дозированную оксигенацию суспензии эритроцитов пропусканием Ор мелкими пузырьками при Р=5 мм.рт.ст. на протяжении 100 с. Через каждые 10 с прекращали аэрацию и определяли экстинкцию Е при Л 549им начала И ПОСЛЄ ОКСИГеНаЦИИ ОПредеЛЯЛИ ЭКСТИНКЦИЮ При AcgJIM. Для выяснения роли возможного взаимодействия ПАВ с гемоглобином ставили контрольные опыты с раствором гемолизированных эритроцитов. Кроме того, в части исследований проводили аэрацию суспензии эритроцитов и раствора гемолизированных эритроцитов аргоном. % насыщения гемоглобина 02 определяли по формуле / 44 /: % нас. = —US . юо, ХНв Х02Нв До где Хттв - чр /для исходных данных при полном восстановлении гемоглобина/; ХОрНв - -2 /для конечных данных при посто янном максимальном уровне полной оксигенации суспензии эри Д2 троцитов или гемоглобина/; X - - /для промежуточных данных А1 -при различной продолжительности оксигенации/; Ду - оптическая плотность Е при Лсьднм; Д2 - оптическая плотность Е при А5б нм. Результаты исследований статистически обрабатывались по методу разницы / 65 /. Всего поставлено 84 опыта с 9 препаратами ПАВ, проведено около 800 определений экстинкции. Разработанная модификация способа определения транспорта Ор испытана в производственных условиях и ее можно рекомендовать для использования при наблюдениях за животными, получающими ПАВ в качестве кормовой добавки, с целью контроля за состоянием организма и для предупреждения передозировки препаратов. Выбор ПАВ определялся таким образом, что исследовалось действие веществ как циклического, так и нециклического строения молекул / 178 /: натриевые соли желчных кислот, относящиеся к группе веществ с циклическим строением, синтетические ПАВ с нециклическим строением молекулы / твин-80, тритон Х-100 /. Кроме того, известно, что для близких по строению ПАВ, образующих гомологические ряды, наблюдается зависимость между их эффектом, а также способностью проникать через мембрану и величиной молекулярного веса / 179,180 /. Поэтому, нам казалось интересным исследовать зависит ли физиологический эффект ПАВ от строения, от того, на какие ионы вещества диссоциируют, а в ряду близких по строению соединений, от их молекулярного веса. Применялись, разные по химическому заряду, ПАВ - анионные / натриевые соли холановых кислот /: литохолевой / ЗОС-оксихолановой - ср4Нм)3 дезоксихолевой / 3 Х, 12 Х-диоксихолановой - CgJLgO /; хенодезоксихолевой / ЗОС, 70С-диоксихолановой - р ц в / Олайнского завода химреактивов /; холевой /3 0L, 701, І2аі триоксихолановой - CpJLn05 / / фирмы Ldix/so/i/; дегидрохолевой / получаемой искусственным путем и применяемой в качестве мочегонного препарата /.
Влияние желчных кислот и пальмитата натрия на проницаемость эритроцитарных мембран для мочевины
Данные о влиянии желчных кислот на проницаемость мембран эритроцитов представлены в таблицах І-УП. Литохолат натрия в концентрациях 1 КГ7 и І ЇО"6 г/мл / І,8 Кґб М / замедляет гемолиз эритроцитов в 0,3 М растворе мочевины / таблЛ /, Уменьшение концентрации до 1 10 г/мл приводит к резкому падению эффекта действия литохолата натрия. Сравнительно высокая концентрация этого препарата / 1 10 г/мл или 1,8 І0 М / достоверно снижает проницаемость только в первые 30 с опыта. Подобное действие на проницаемость эритроцитарных мембран оказывает хенодезоксихолат натрия, который в концентрации 1 10 г/мл / 2,4 10 М / не изменяет транспортную функцию мембран эритроцитов, а в концентрации 1 10 г/мл / 2,4 10 М / значительно снижает проницаемость / табл.П /. Количество гемолизированных эритроцитов уменьшается при этом на 6,2-12,6. Холат натрия замедляет гемолиз эритроцитов в концентрациях ПО"8- П0 б г/мл / 2,32 КҐ8- 2,32 Ю"6 М / / табл.Ш / Увеличение или снижение концентрации приводит к резкому уменьшению количества негемолизированных эритроцитов.
Наиболее выраженное задерживающее влияние на проницаемость эритроцитарных мембран оказывает дезоксихолат натрия / табл.ІУ /. Так, при действии этой желчной кислоты в концентрации 1 Ю" 8 г/мл / 2,4 ГО "8 М /, количество гемолизированных эритроцитов уменьшается на 6,4-10,0$, а при концентрации 1 10 г/мл - на 11,8-18,4$. Более высокие концентрации этого
Изменение количества эритроцитов, гемолизированных в 0,3 М растворе мочевины, под влиянием маяых концентраций холата натрия /средняя разница по сравнению с контролем и средняя ошибка средней разницы, в %t М т , п=7/ препарата оказывают нерезко выраженное действие, а меньшая концентрация I 10 г/мл недостоверно снижает гемолиз на 0,4-1,0 %. В таблицах У и Л представлены результаты исследова-ний по влиянию гликохолата и таурохолата натрия на проницае-мость эритроцитарных мембран для неэлектролита-мочевины. Влияние гликохолата натрия наблюдается при действии концентраций ПО 9- НО"5 г/мл / 2,0 КГ9- 2,0#10 5 М /. Достоверное снижение проницаемости наблюдается при действии максимально исследуемой концентрации / 1 10 г/мл /, и значительно уве личивается при воздействии концентрации I 10" г/мл / на 4 -9 % /. При дальнейшем уменьшении концентрации до 1 10 г/мл наблюдается нерезковыраженное снижение проницаемости. При исследовании динамики гемолиза надо отметить, что при влиянии гликохолата в концентрациях 1 10 , 1 10 и Г10 г/мл на блюдается нарастание эффекта действия во времени. Таурохолат натрия проявляет свое задерживающее влияние на проницаемость мембран эритроцитов в концентрации НО" 5 г/мл /І,56 КҐ5 М/ / табл. УІ /. При уменьшении концентрации до 1 10 г мл действие таурохолата натрия несколько снижается, общим для этих концентраций является то, что эффект действия нарастает по мере увеличения времени опыта / 30 -90 с /, Это говорит о выраженном влиянии таурохолата натрия на молодые эритроциты. Сравнительно ровное снижение проницаемости эритроцитарных мембран для мочевины вызывает это соединение холановой кислоты с таурином в концентрации ПО "8 г/мл / 1,56 ТО 8 М /. Вместе с тем, таурохолат натрия вызывает гемолитическое действие в концентрациях НО"9 и НО"7 г/мл на 10-ой с опыта. Затем, на 30 - 90 секундах опыта эти концентрации нерезко, но достоверно снижают гемолиз эритроцитов.
Изменение количества эритроцитов, гемолизированных в 0,3 М растворе мочевины, под влиянием малых концентраций гликохолата натрия /средняя разница по сравнению с контролем и средняя ошибка средней разницы, в %t МІщ , п=7/
Приведенные в таблице УП результаты указывают на снижение проницаемости эритроцитарных мембран для мочевины под влиянием малых концентраций дегидрохолата натрия, тогда как более высо-кие концентрации приводят к повышению проницаемости. Действие дегидрохолата натрия наблюдается при концентрации Г10 г/мл; достоверное снижение на 1,0 - 4,0 % количества гемолизирован-ных эритроцитов происходит на первых 60 с опыта. Наибольшее снижение количества эритроцитов, гемолизированных в 0,3 М растворе мочевины, наблюдается при действии препаратов концен —7 трации 1 10 г/мл / 2,0 9,7 % /. Наибольшая исследуемая концентрация дегидрохолата натрия / 1 10 г/мл / вызывает значительное увеличение /2,8-8,5$/ проницаемости мем -.9 бран эритроцитов. При действии его в концентрациях 1 10 и 1 10 г/мл наблюдалось недостоверное, слабо выраженное снижение гемолиза / 0,2 - 2,7 % /. Возможность гемолитического действия дегидрохолата следует исключить ввиду недостаточной концентрации, при которой даже дезоксихолат натрия не стимулирует гемолиза. Пальмитат натрия начинает достоверно снижать процент гемолизированных эритроцитов в концентрации 1 10 г/мл / на 0,6 -1,4 % / / табл. УШ / Значительное замедление гемолиза вызывает этот препарат в концентрациях 1 10 и 1 10 г/мл /2,2-10,2 % /, причем, действие первой в два раза сильнее, чем второй. Затем, при увеличении концентрации до 1 10 г/мл и с: 1 10 г/мл, эффект действия пальмитата натрия ослабевает и наблюдается нерезко выраженное снижение на 0,8 - 3,6 % количества эритроцитов, гемолизированных 0,3 М раствором мочевины.
