Теоретическое и экспериментальное исследование кинетики ионных токов двигательного нервного окончания Гафуров, Борис Шамильевич

Введение к работе

Актуальность. Изучение механизмов синаптической передачи является юй из фундаментальных проблем современной нейрофизиологии. Пере-іа возбуждения в нервно-мышечном синапсе представляет собой слож-й моногоэтапный процесс, который начинается с момента деполяриза-'Л пресинаптической мембраны распространяющимся потенциалом дей-ия (ГТД). Деполяризация мембраны нервного окончания (НО) приводит открыванию потенциалозависимых кальциевых каналов и входу ионов іьцня в НО, которые вызывают освобождение медиатора из нервных миналей. Установлено, что характер секреции медиатора из НО в зна-гельной степени определяется амплитудно-временными параметрами ПД itz, Miledi, 1965,1967,1969; Магазаник, 1979: Llinas et al ,1981,19S2; Зе-ров и др. 1984,1985,1987,1990; Van der KJoot, Molgo, 1994).

В то же время, экспериментальные методы изучения электрической ивности НО сопряжены с большими трудностями из-за незначительных імеров терминалей, которые позволяют производить только внеклеточ-о регистрацию реакции синапса на раздражение двигательного нерва, тютрируемый сигнал включает в себя как ответы мембраны НО :мбранный ток), так и ответ постсинаптической мембраны на выделив-[йся медиатор. При этом невозможно регистрировать ни сам ПД. возни-ощий в терминали ни конкретные ионные токи, и тем более кальцие-й ток, который слишком мал в нормальных условиях.

Известно, что по ходу НО форма регистрируемого электрического "нала претерпевает значительные изменения - от преимущественно элек-ютрицателыгой в претерминалыюй и проксимальных областях до элек-яюложительной в дистальных. Используя блокаторы ионных каналов ло обнаружено, что регистрируемые ответы образуются преимушествен-натриевыми, калиевыми, кальций-активируемыми калиевыми токами, сущими через соответствующие каналы в мембране НО (Mallart, 1985; риров и др., 1985). Однако, неизвестно каким образом меняется времен-й ход ионных токов вдоль НО. а также какова их связь с умень-іюшейся по ходу НО секрецией медиатора (Зефиров, 1983).

Ранее было предположено, что изменение ответа по ходу НО может ть связано с изменением проводимости мембраны для некоторых ионов 5менение плотности ионных каналов) от проксимальных к дистальным істкам (Mallart, 1985; Зефиров и др., 1985). Однако это предположение не ло экспериментально подтверждено. Ответить на этот вопрос можно с мощью моделирования всей совокупности ионных токов, существующих

ло.

Цели и задачи исследования: Целью настоящего исследования является зработка на основе существующих моделей нервных волокон модели ектрической активности НО холоднокровных и теплокровных животных.

С использованием этой модели объяснить изменения регистрируемого < вета по ходу НО лягушки и мыши.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Зарегистрировать и проанализировать ответы НО лягушки и мыши;

2. Разработать модель электрогенеза двигательного нервного окончан лягушки и мыши, учитывая наиболее характерные ионные токи нервн терминал ей животных и локальные токи;

3. Промоделировать различное распределение плотности натриевых, і лиевых, кальциевых, кальций-активируемых калиевых каналов в НО;

4. Воспроизвести картину электрофизиологачески регистрируемого otbs НО лягушки и мыши в соответствующих моделях;

5. В рамках моделирования ионных токов объяснить уменьшение секрец медиатора по ходу НО.

Новизна. Впервые разработана модель электрической активности I-теплокровных и холоднокровных животных, учитывающая натриевые, і лиевые, кальциевые, кальций-активируемые калиевые и локальные то НО. Проанализирована кинетика ионных токов терминали лягушки и м ши. Доказано уменьшение плотности ионных каналов по ходу НО и вы? лено распределение плотности каналов по ходу НО лягушки и мыл Вскрыты причины снижения секреции медиатора по ходу синапса. По* зано, что уменьшение кальциевого тока происходит без изменения каг циевой проводимости мембраны НО при уменьшении проводимости ме браны для ионов натрия и калия.

Положения выносимые на зашиту

6. Изменение ответа НО и секреции медиатора от проксимальных к п стальным отделам синапса, как холоднокровных так и у теплокровных ж вотных, связано с изменением плотности натриевых и калиевых канал по ходу НО. Плотность натриевых, потенциалозависимых и кальци активируемых калиевых каналов вдоль нервного окончания уменьшает по экспоненте;

7. Константы спада плотности натриевых и калиевых каналов в НО тепл кровных и холоднокровных животных различны и определяются прот женностью НО; -

8. Уменьшение квантового состава тока концевой пластинки по хс нервной терминали связано с уменьшением кальциевого тока за с¹ уменьшения плотности натриевых, потенциалозависимых и кальци активируемых калиевых каналов, при постоянной плотности кальциев каналов.

Научно-практическая ценность. Проведенное исследование имеет ф> даментальное теоретическое значение, поскольку позволяет раскрыть ис ные механизмы, лежащие в основе ответа мембраны НО, ПД и регуляц освобождения медиатора. Результаты проведенного исследовашія moj

ти применение в теоретической и экспериментальной нейрофизполо-, в исследованиях по моделированию нейронных сетей и процессов си-

тическои передачи... --

Апробашт работы. Основные положения работы доложены и обсуждена следующих конференциях: Всероссийский Съезд физиологов, щино,1994); Всероссийская научная конференция, "Растущий орга-м; адаптация к физической и умственной нагрузке", (Казань, 1994); кдународная зимняя школа молодых ученых по нейрохимии временные достижения в изучении метаболизма мозга", (С-Петербург, 5); IX Международный Симпозиум по холинергическим механизмам, йнц, Германия, 1995); Нейрохимическая школа, второй курс "От пере-і сигналов к экспрессии генов", (Оказаки, Япония, 1995). А так же на даний Татарского отделения всероссийского физиологического об-тва (Казань, 1995) и на заседании кафедры физиологии Казанского пе->гического университета (Казань, 1995).

Реализация результатов исаіедования. Материалы исследования отра-ы в 8 публикациях. Структура и объем. Диссертация состоит из введения, обзора литера->[. описания методик, результатов исследования и их обсуждения, заменил, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы. Список литературы со-кит 150 источников.

Электрофизиологические исследования

Эксперименты проводили на нервно-мышечных препаратах кожногру-ной мышцы лягушки и мышцы длинного поднимателя уха мыши, вно-мышечный препарат выделяли и помещали в ванночку из органи-сого стекла с рабочим объемом 3 мл. Для работы с холоднокровными ользовалл стандартный раствор Рингера следующего состава (в »ль/л): NaCl-118,0; КСІ-2,5; СаС1₂ -1,8; NaHC0₃ -2,4 для работы с теп-эовньши использовали раствор Кребса следующего состава (в >ль/л): NaCl-154.0; KCl-5,0; NaHPO₄-l,0; MgCb-1,0; СаС1₂-0,4; ІСОз-1,8: глюкоза-11,0 при температуре 22С, рН среды поддерживали 'ровне 7.2. До начала опыта раствор Кребса в течение 40-50 мин насы-и карбогеном (02-95%, С0₂-5%). Раствор аэрировали и во время экстента. В некоторых экспериментах для блокирования ПД мышечного экна (сокращения мышцы) в раствор добавляли тубо курарин (2x10"⁸ ь/л). Ответы НО отводили внеклеточно, используя стандартную микро-стродную установку под визуальным контролем (Зефиров и 984,1985; Добрецов,1990). Ответы НО регистрировали при помощи

стеклянных микроэлектродов с диаметром кончика 2-3 мкм, заполне. ми 2 моль/л раствором NaCl (сопротивление 2-5 МОм). Раздражение і гательного нерва производили прямоугольными электрическими имп; сами длительностью 0,2-0,3 мсек, сверхпороговой амплитуды. Злектрі ские сигналы после усиления усредняли (интервал измерения сигнале мксек) с помощью синхронного цифрового накопителя Ф-36 и регисі ровали на бумаге при помощи двух-координатного самописца.

Математическая модель _к

Система уравнений Ходжкина-Хаксли (Hodgkin,Huxley,1952) была ми использована для описания распространения возбуждения вдоль ] Распространение ПД вдоль немиелинизированного нервного волокна в описывается уравнением теплопроводности:

±^ = c^ _{+ S}/, (і).

R дх^г dt у '

/{-сопротивление аксоплазмы, К-потенциал, С-емкость мембраны, ионный ток, /-тип ионов. В случае немиелинизированного волокна ион токи описываются по закону Ома (Hodgkin, Huxley, 1952):

Ij=gj

в случае миелинизированных нервных волокон уравнением Голдм (Frankenhaeuser, Huxley,1971):

RT , (EF}

-ехр

(EF^

\rt)

Проводимость gj в уравнении(2) и проницаемость Pj ионов в ураї ний (3) мембраны зависит от констант активации и инактива, gj = g_Jm^tn', Pj - Pjm^kn^!, которые в общем случае зависят от мембрані

потенциала, и носят независимый характер, эти константы тип опи ваются уравнением релаксации:

^jp- = (1- Y(f))a_r (V) - Y(t)b_y (V) ,(4) at

где a(V)- и b(V)- скорости движения частиц к ионному каналу и него, соответственно (Hodgkin,Huxley, 1952). E=V-Vj, ^-равновесный тенциал, /"-постоянная Фарадея, Л-постоянная Больцмана, Г-абсолкл температура, ////^-концентрация ионов внутриклеточная и внеклеточ) Скорости a(V)- и b(V)- описываются эмпирическими уравнени: (Hodgkin,Huxley, 1952; Frankenhaeuser,Huxley,1971).

Для калиевых каналов инактивация очень медленная, поэтому ее не итывают; количество активирующих частиц необходимых для открыва-:я одного калиевого канала - четыре, т.е. /=4, для натриевых - три при ной инактивирующей, т.е. fc=l, /=3 (Hodgkin, Huxley, 1952; ankenhaeuser,Huxley, 1971).

Для воспроизведения реальной картины кинетики ионных токов НО в ;ше описанную модель мы включили кинетики кальциевых и калышй-тивируемых калиевых токов (Llinas et al, 1981):

j -_P єеМ'-MMw) _p _-_{p r5}

^/c' - ^P» If , _rr , „ (ezE\ ' ^P- ~ ^РиГ ' l.^Aexp:—.

Кальций-активируемые калиевые токи описывали согласно работе лдмана (Goldman,Tomas, 1989), что в принципе аналогично приведенім выше уравнениям Гольдмана и примененным Франкенхаузером rankenhaeuser, Huxley, 1971):

1-[Ся]_о*ехр^—J

Как било показано (Dodge, Cool 1946, Hodgkin,Huxley, 1952), разност-іе схемы позволяют решить с хорошеіі точностью систему уравнений (1-что допустимо и в случае нашей расширенной системы Ходжкина-.ксли. Уравнения интегрировали с помощью разностных схем методом ілера первого порядка (Турчак. 1981). Начальные и граничные условия я решения "задачи Коши" для уравнения теплопроводности мы взяли алогично с работой Ходорова и Тимина(1969), в которой распростране-е ПД происходит одинаково в обе стороны от стимулирующего перехва-, а на конце НО потенциал равен нулю. Начальные условия - нулевые тенциалы.

Описание локального взаимодействия

В отличии от существующих моделей общий мембрашгый ток из сег-нта мембраны полагали одновременно взаимодействующим не только со ежными участками, но и с более удаленными. Закон взаимодействия исывали согласно экспоненциальному спаду на основе решения одно-дного уравнения электрохимической диффузии (Рубин, 1969, Ходо-в, 1975), который описывает пассивное распространение деполяризации оль мембраны:

где Vo- деполяризация в точке х=0, /- постоянная длины мембра нервного волокна (в нашем случае НО).

Метод разностных схем Эйлера, первого порядка

Любое дифференциальное уравнение типа ^Y/. = F(Y,t) может бь преобразовано в алгебраическую систему уравнений:

y{t_M) = Y(t,)-F{Y(t_l),t,W,

здесь каждое последующее (І+І) значение функции находится предыдущего (і) (Турчак,1981). Аналогичным образом разрешаются ураві ния релаксации для констант т, п, h и г. Двойной дифференциал для ург нения (1) расписывается аналогичным образом:

d²Y Y(t,)-2Y(t_M) + nt_M)

dt¹ At¹

Для решения двухмерного уравнения (1)(искомая функция потении зависит от двух аргументов) теплопроводности необходимо применять : висимые от переменной разности. Пусть j- индекс по длине х, а /- инде по времени Г.

111 tl±±llt± = с -і- -J— + YKV')

Я Ах^{1 L} At ⁺ 2,'<";>>

отсюда можно выразить значение потенциала в сегменте j в /+/ м мент времени:

,,₊₁ _ A^fv wh^tl^ki'jkl л v

¹ с[^^ПУ/) RAx² )⁺ '

Зная потенциал в начальный момент времени во всех сегментах мож вычислить потенциал в сегментах мембраны в любой момент времени. Физическая и электрическая модель НО

Исходя из известных данных о строении нервно-мышечного синап лягушки и мыши (Birks et al., 1960,1966; McArdle et al., 1981; Angaut-Petit al., 1987; Diaz et al.,1988,1989; Dunia, Herrera, 1993) для проведения ко пьютерньгх экспериментов нами была принята следующая структурная о ма модели. Нервное волокно, имеющее три перехвата Ранвье длиной мкм, разделенных миелиновыми сегментами протяженностью 12 мкм, г реходит в безмиелиновое НО. Нерное окончание в модели состояло нескольких одинаковых веточек. Каждая из веточек представляла собі униформный цилиндрический кабель, длина которого у лягушки составл ла 100 мкм, а диаметр 2 мкм. В модели НО мыши по ходу каждой терм нали в трех местах производилось постепенное увеличение и уменьшен диаметра осевого цилиндра в три раза. Длина каждой ветви составляла мкм, диаметр 2 мкм (в местах расширения 6 мкм). Однако компьютеры моделирование показало, что распространение возбуждения в каждой веточек происходит одинаково, что соответствует материалам раб

Vndrietti, Peres, 1985), поэтому дальнейшее моделирование электрической стивности НО производилось по одной терминальной веточке.

В проксимальном участке терминали была расположена геминодаль-ія область протяженностью 2-3 мкм, аналогичная по своим электриче-сим свойствам перехвату Ранвье. Через мембрану перехвата текут натрие->ie, небольшой калиевый ток и ток утечки, а через мембрану НО- натрие-»ie, калиевые, кальциевые и кальций-активируемые калиевые токи.

Изменение гиютности ионных каналов мембраны

Изменение общего количества каналов изменяет максимальную про->димость сегмента мембраны. Следовательно, для изменения плотности энных каналов достаточно менять максимальную проводимость gj. В мо-:ли изменение плотности j -тых каналов производили изменением соот-

ітствуюшего типа gj. Итак, g_s -> g_s exp - — \, где х- расстояние вдоль мем-

)аны, If константа длины спада плотности каналов. Стабильность метода

Стабильность метода сохраняется при выполнении следующего нера-

нства: /?С<-^у, где D/ и Dx шаги интегрирования по времени и про-

ранству(Ои Fort,Frankel,1953). В терминали, по сравнению с нервным ътокном, нами было увеличено внутреннее сопротивление в 2-3 раза, что іравдьівается большим количеством органелл внутри нее .indgren,Moore, 1989). Это привело к уменьшению шага по времени в 5 із. Время счета уменьшилось и составило на IBM PC486/DX2-66 30 мин.