Свободнорадикальный гомеостаз и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов крыс при гипотермии Аль-Рабии Мохаммед Али Мохаммед

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Влияние низкой температуры тела на интенсивность сво боднорадикальных процессов в тканях 12

1.2. Морфологические, физиологические и биохимические особенности эритроцитов 26

Глава 2. Материалы и методы исследования 35

2.1. Объект исследования 35

2.2. Постановка экспериментов 35

2.2.1. Искусственная гипотермия 35

2.3. Препаративные методы исследования 35

2.3.1. Получение плазмы крови, эритроцитов и их гемолиза тов 36

2.3.2. Выделение мембран эритроцитов 36

2.3.3. Выделение белка полосы 3 из мембран эритроцитов 36

2.4. Биохимические методы исследования 37

2.4.1. Определение содержания малонового диальдегида в плаз ме крови и эритроцитах 37

2.4.2. Определение окислительной модификации белков плазмы крови 38

2.4.3. Определение окислительной модификации белков мембран эритроцитов 39

2.4.4. Количественное определение SH-групп в в общих белках и в белке полосы 3 мембран эритроцитов 40

2.4.5. Определение содержания глутатиона в эритроцитах 40

2.4.6. Определение активности супероксиддисмутазы в эритроц тах 40

2.4.7. Определение активности каталазы в эритроцитах 42

2.4.8. Определение содержания белка в плазме крови и мембра нах эритроцитов 42

2.4.9. Определение содержания общего белка, альбумина, моче вины, мочевой кислоты, билирубина, глюкозы, триа цилглицеролов и холестерина в плазме крови 42

2.5. Биофизические методы исследования 43

2.5.1. Измерение собственной флуоресценции белков 43

2.5.2. Измерение микровязкости мембраны эритроцитов 44

2.5.3. Методы изучения морфологии и цитоархитектоники эрит роцитов 46

2.6. Физиологические методы исследования 46

2.6.1. Исследование гематологических параметров крови 46

2.6.2. Определения цитокинетических показателей эритроцитар ного баланса крови 47

2.6.3. Определение осмотической резистентности эритроцитов... 48

2.7. Статистическая обработка результатов 49

ГЛАВА 3. Основное содержание работы 50

3.1. Влияние гипотермии на биохимический состав плазмы кро ви 50

3.2. Свободнорадикальные процессы в крови крыс при умерен ной гипотермии разной длительности 57

3.3. Структурно-динамические свойства мембран эритроцитов в динамике умеренной гипотермии 69

3.3.1. Влияние гипотермии на флуоресцентные свойства белков мембран эритроцитов 69

3.3.2. Влияние гипотермии на микровязкость мембран эритроцитов 74

3.4. Морфологические особенности эритроцитов и топографии его мембраны при гипотермии 77

3.5. Функциональные особенности системы эритрона крыс в за висимости от длительности умеренной гипотермии 84

3.5.1. Влияние умеренной гипотермии разной длительности на показатели функционального состояния эритроцитов крови крыс 84

3.5.2. Влияние умеренной гипотермии разной длительности на цитокинетические показатели эритроцитарного баланса крови крыс 87

3.6. Осмотическая резистентность эритроцитов крыс гипотермии 88

Заключение 92

Выводы 104

Литература

• Морфологические, физиологические и биохимические особенности эритроцитов
• Определение окислительной модификации белков мембран эритроцитов
• Свободнорадикальные процессы в крови крыс при умерен ной гипотермии разной длительности
• Влияние умеренной гипотермии разной длительности на показатели функционального состояния эритроцитов крови крыс

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Выяснение молекулярных механизмов действия низких температур на гомойотермные организмы является одной из актуальных проблем современной экологической физиологии, биохимии и медицины (Тимофеев Н. Н., Прокопьева Л. П., 1997; Пастухов Ю. Ф. и др., 2003; Эмирбе-ков Э. З., Кличханов Н. К., 2011; Blagojevi D., 2014). Млекопитающие в ряде случаев находятся в потенциальной опасности переохлаждения при действии экстремальных климатогеографических факторов. При выполнении многих видов профессиональной деятельности человек может подвергаться риску развития экси-дентальной (непреднамеренной) гипотермии (Афанасьева Р. Ф. и др., 2006; Danzl D., 2012; Brown D. J. et al., 2012), а при выполнении обширных хирургических операций – интраоперационной гипотермии (Бердикян А. С., Марченко А. В., 2002; Sun Z. et al., 2015). В последнее время гипотермические воздействия часто применяют для защиты организма от травматических повреждений, восстановления функции органов и тканей после ишемии-реперфузии, для коррекции и лечения различных заболеваний животных и человека (Maier C. M., Steinberg G. K., 2004; Feitosa-Filho G. S. et al., 2009; Усенко Л. В., Царев А. В., 2009; Tang X. N., Yenari M. A., 2010; Sreide K., 2014). Основным эффектом гипотермии является снижение интенсивности обмена веществ во всем организме или в отдельных органах, что позволяет предупреждать гипоксию или риск ее возникновения.

Однако наряду с положительными эффектами гипотермия вызывает ряд нежелательных изменений. Снижение температуры тела сопровождается вазоспаз-мом и централизацией кровотока, за счет холодового диуреза и вытеснения жидкости в интерстиций возрастает вязкость крови, что способствует нарушению микроциркуляции (Sessler D. I., 2005; Луценко Д. Г. и др., 2008). Возникновение спазма периферических сосудов и сдвиг кривой диссоциации оксиHb влево приводит к тканевой гипоксии, нестабильности клеточных мембран, повышению травматизации форменных элементов крови (Глуткин С. В., Зинчук В. В., 2009). Отрицательными эффектами гипотермии также являются переход с глюкозного метаболизма на липидный, иммуносупрессия, смещение баланса в сторону избыточной генерации свободных радикалов и возникновение дефицита антиоксидан-тов (Torlinska T. et al., 2002; Hayashi S., 2005: Polderman K. H., 2011). В ряде работ показано, что при гипотермии, особенно на начальных стадиях снижения температуры тела и при умеренной гипотермии, происходит активация свободноради-кальных процессов (СРП) в тканях и снижение антиоксидантной защиты организма. Выраженность данных изменений зависит от глубины гипотермии (Дорохина Л. В., Зинчук В. В., 2004; Эмирбеков Э. З., Кличханов Н. К, 2011; Исмаилова Ж. Г. и др., 2012; Alva J., 2013; Blagojevi D., 2014). Это, в свою очередь, приводит к повреждению как растворимых, так и мембранносвязанных белков и липидов и деструкции клеточных структур. Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что наиболее часто для защиты головного мозга и сердца от последствий гипоксии, ишемии-реперфузии, инсульта и инфаркта, травм используют умеренную пролонгированную гипотермию (Усенко Л. В., Царев А. В., 2009; Tang X. N., Yenari M. A., 2010; Faridar A. et al., 2011). Про-

лонгирование умеренной гипотермии может изменить скорость генерации активных форм кислорода (АФК) и скорость их элиминации антиоксидантной системой тканей. Как изменяется интенсивность СРП в тканях при различной длительности умеренной гипотермии, не совсем ясно. Выяснение зависимости проокси-дантно-антиоксидантного баланса тканей и структурно-функционального состояния мембран клеток от длительности умеренней гипотермии позволит выявить специфические факторы, ограничивающие потенциальные возможности гипотер-мической терапии, что может способствовать усовершенствованию существующих и созданию новых способов погружения организма в искусственную гипотермию.

Цель исследования. Целью данной работы является выяснение особенностей изменения прооксидантно-антиоксидантного баланса эритроцитов крыс и структурно-функционального состояния их мембран в динамике умеренной гипотермии.

Задачи исследования:

1. Исследовать содержание в крови субстратов и метаболитов белкового, углеводного и липидного обменов, ионного состава и их вклад в обеспечение компенсаторно-приспособительных метаболических реакций в ходе пролонгированной гипотермии.

2. Изучить состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса в плазме крови и эритроцитах при умеренной гипотермии разной длительности.

3. Охарактеризовать структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов при гипотермии.

4. Оценить влияние длительности гипотермии на степень изменения морфологии эритроцитов, а также топографии и рельефа поверхности мембраны эритроцитов.

5. Изучить динамику показателей функционального состояния эритроцитов и цитокинетических показателей эритроцитарного баланса крови при гипотермии.

6. Исследовать взаимосвязь между осмотической резистентностью эритроцитов и уровнем тиоловых групп в белках мембраны эритроцитов при гипотермии.

Научная новизна исследования. Получены новые данные о зависимости уровня белков, мочевины, глюкозы, липидов, липопротеинов и ионов в плазме крови от длительности умеренной гипотермии. Установлена зависимость интенсивности СРП в крови от длительности умеренной гипотермии. В работе впервые обнаружено, что после снижения температуры тела до 30С и пролонгирования этого состояния до 90 мин в крови развивается окислительный стресс, приводящий к окислительной деструкции липидов, белков плазмы и мембран эритроцитов. Следствием этих процессов является изменение структурно-динамических характеристик мембраны эритроцитов и повышение осмотической хрупкости красных клеток.

Впервые показано, что пролонгирование умеренной гипотермии в течение 180 мин приводит к включению адаптивных механизмов, способствующих снижению интенсивности СРП в крови, нормализующих структурно-динамические характеристики мембраны эритроцитов и осмотическую хрупкость клеток. Впервые

с использованием метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследованы мор-фофизиологические особенности эритроцитов крыс при умеренной гипотермии разной длительности. Получены новые данные, которые свидетельствуют о том, что в динамике гипотермии происходит изменение как морфологии эритроцитов, так и структуры клеточной поверхности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили установить направленность метаболических реакций и выявить закономерности ряда биохимических, биофизических и физиологических показателей крови и эритроцитов от длительности умеренной гипотермии. Эти данные позволяют проследить пути перехода реакции повреждения в компенсаторно-приспособительные реакции. Полученные результаты обосновывают необходимость применения антиоксидантной терапии на начальных этапах умеренной гипотермии, которая должна быть направлена на усиление антирадикальной активности. Обнаруженные в работе ключевые универсальные механизмы повреждения мембран эритроцитов позволяют разработать патогенетически обоснованную стратегию восстановления функциональных свойств клеток при гипотермии.

Теоретические и практические результаты исследований используются в учебном процессе при чтении лекционных курсов «Свободнорадикальные процессы в биологических системах», «Биохимия крови», «Биохимия гипометаболи-ческих состояний позвоночных» в Дагестанском государственном университете.

Методология и методы исследования. Опыты выполнены на 238 крысах-самцах линии Вистар, массой 200-220 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Общую гипотермию вызывали наружным охлаждением в камере, в рубашке которой циркулировала холодная вода. Температуру тела равномерно со скоростью 0,23С/мин снижали от 37 до 30С (кратковременная умеренная гипотермия) в течение 30 мин. Достигнутый уровень гипотермии поддерживали в течение 90 и 180 мин (пролонгированная гипотермия). Контролем служили интактные животные с температурой тела 37С.

Тени эритроцитов получали после гипоосмотического гемолиза по методу Казенова А. Н. и др. (1984). Белок полосы 3 получали, как описано у Ямагучи и Кимото (Yamaguchi T., Kimoto E., 1992). Об интенсивности окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов судили по уровню таких маркеров, как малоновый диальдегид (МДА) (Кличханов Н. К. и др., 2012), карбонильные (Арутюнян А. В. и др., 2000; Venditti P. et al., 2004) и тиоло-вые группы (Habeeb A. F. S. A., 1972). Исследовали такие факторы антиоксидант-ной защиты, как мочевая кислота и билирубин в плазме крови, восстановленный глутатион (GSH) (Арутюнян А. В. и др., 2000), активность супероксиддисмутазы (Дубинина Е. Е. и др., 1988) и каталазы (Королюк М. А. и др., 1988) в эритроцитах. Содержание общего белка, альбумина, мочевины, мочевой кислоты, креатина, билирубина, глюкозы, триацилглицеролов, общего холестерина, холестерина ЛПНП и ЛПВП, натрия, калия, кальция, железа в плазме крови крыс определяли на биохимическом анализаторе UniCel DxC 800 PRO автомат (Beсkman Coulter, США).

Состояние белков мембран эритроцитов оценивали путем анализа собственной флуоресценции на спектрофлуориметре Hitachi F-7000 (Япония). Анализиро-

вали параметры спектров флуоресценции белков (l_макс и F_макс), а также их вторые производные, позволяющие разделить вклад тирозиновой и триптофановой составляющих в суммарный спектр (Онищенко Е. Н. и др., 2004).

Для анализа физико-химических свойств бислоя был использован флуоресцентный зонд пирен. Измерения микровязкости мембран эритроцитов проводили на сперктрофлуориметре Hitachi F-7000 (Япония). Микровязкость мембранных липидов оценивали по отношению интенсивности флуоресценции эксимерной (470 нм) и мономерной (393 нм) форм пирена, при максимуме возбуждения 334 нм, а микровязкость анулярного липида – при максимуме возбуждения 296 нм (Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е., 1980). Степень погружения белков в липид-ный бислой определяли по тушению флюоресценции белков пиреном – (F_о-F)/F_о, происходящему вследствие безызлучательного переноса энергии с триптофани-лов мембранных белков на пирен при максимуме возбуждения 280 нм. Полярность окружения зонда пирена в мембране оценивали по соотношению интенсивности флуоресценции двух его мономерных форм F₃₇₀/F₃₉₀ при максимуме возбуждения 337 нм и 280 нм соответственно (Добрецов Г. Е., 1989).

Форму эритроцитов, их размеры, а также топографию поверхности эритроцитов исследовали на свежевысушенных мазках крови с помощью атомно-силового микроскопа в полуконтактном режиме на установке NT-INTEGRA spectra (Зеленоград). Изображения получали в плоском формате и в формате 3D, которые использовали для изучения формы и размеров эритроцитов.

Гематологические параметры крови исследовали с помощью гематологического анализатора «Sismex KX-21» (Япония). Цитокинетические показатели эрит-роцитарного баланса крови крыс определяли по методике Липуновой Е. А., Скор-киной М. Ю. (2004, 2007). Осмотическую резистентность эритроцитов определяли по устойчивости клеток к гипотоническим растворам натрия хлорида по Идельсо-ну Л. И., Бриллиант М. Д. (1970) с изменениями.

Основные положения, выносимые на защиту:

7. Холодовой стресс, развивающийся при действии низкой температуры и снижении температуры тела крыс до 30С, приводит к развитию окислительного стресса в крови, проявляющегося дисбалансом про- и антиоксидантных систем.

8. Окислительная деструкция липидов и белков мембран эритроцитов, происходящая при кратковременной и 90 мин пролонгированной умеренной гипотермии, приводит к нарушению структурно-функционального состояния и наноструктуры мембран красных клеток, формы и размеров эритроцитов, повышению их осмотической хрупкости, а также активации эритропоэза.

9. Пролонгирование умеренной гипотермии в течение 180 мин способствует снижению интенсивности СРП в крови за счет активации антиоксидантной защиты плазмы и эритроцитов, что, в свою очередь, частично или полностью нормализует структурно-функциональные параметры мембраны эритроцитов и рельеф их поверхности, формы и размеров эритроцитов, осмотичическую резистентность клеток.

Апробация результатов работы. Результаты исследования обсуждались на 17-ой и 18-ой Международных конференциях «Биология – наука XXI века» (Пу-щино, 2013, 2014), 50-ой Международной научной студенческой конференции

«Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 50-летию биологического факультета ДГУ «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптаций растений и животных» (Махачкала, 2014), 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2015), IX Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2015), VI Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 255 литературных источников, из них 143 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 14 таблицами.

Морфологические, физиологические и биохимические особенности эритроцитов

Этот процесс запускается образованием АФК в митохондриях, которые стимулируют RhoA/Rho-киназную сигнализацию, мобилизацию а2с-адренергических рецепторов к поверхности гладкомышечной клетки, росту активности их а2-адренорецепторов. Оказалось, что этот эффект не опосредован как образующимися в эндотелии NO, так и NO-синтазой, что позволяет предположить участие супероксида в этом процессе (Bailey S. R. et al, 2005). Можно предположить, что образующиеся при этом АФК не только участвуют в вазоконстрикции сосудов, но и могут поступать в кровоток. Эти данные свидетельствуют о том, что на начальных этапах гипотермии (30С) продукция АФК в тканях существенно увеличивается. Об интенсификации образования АФК при гипотермии свидетельствует повышение уровня мочевой кислоты в плазме крови (Маяхи М. Т. Д. и др., 2012).

Мочевая кислота с генерацией супероксидного радикала образуется в ходе метаболизма пуриновых нуклеотидов под действием ксантиноксидазы. В тканях организма этот фермент представлен в основном в форме ксантиндегидрогеназы. Окислительный стресс и гипоксия способствует переходу ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу (Berry С. Е., Hare J. М., 2004). В результате этого характер катализируемой реакции изменяется, и одновременно с мочевой кислотой начинает образовываться О2 , а затем и Н2О2. Эти данные позволяют заключить, что уровень мочевой кислоты в плазме крови может являться маркером активации процессов образования АФК при гипотермии.

При кратковременной гипотермии 30 С в плазме крови крыс содержание NO возрастает на 70% относительно контроля (Маяхи М. Т. Д. и др., 2012). После 3-х часовой пролонгированной гипотермии уровень NO в крови уменьшается относительно кратковременной гипотермии 30С, но остается достоверно выше контрольного значения. Глубокая гипотермия также характеризуется высоким уровнем NO в плазме крови.

Скорость дыхания уменьшается во время легкой гипотермии, но парциаль 14 ное давление кислорода остается нормальным. Поскольку образование CO2 изначально значительно повышено из-за интенсивной дрожи, мягкий респираторный алкалоз сменяется ацидозом из-за снижения объемов образования CO2, низкой перфузии и оксигенации тканей, а также образования лактата (Alva N. et al., 2010; Глуткин С. В. и др., 2014). Это вызывает сдвиг кривой диссоциации оксигемогло-бина влево, что уменьшает доступность кислорода для тканей (Глуткин С.В., Зин-чук В. В., 2009). Метаболический ацидоз блокирует гликолиз и дестабилизирует лизосомы, которые высвобождают протеазы (Северина Т. Г., Кубарко А. П., 2009). Эти протеазы способствуют освобождению редокс-активных металлов, особенно железа, которые способствуют генерации АФК. Температура существенно не влияет на реакционную способность АФК. В то же время активность АОС может уменьшаться из-за влияния температуры на активность антиоксидантных ферментов и/или расходования низкомолекулярных антиоксидантов, таких, как аскорбиновая кислота и витамин Е в условиях окислительного стресса.

Таким образом, данные научной литературы свидетельствуют о том, что при гипотермии, особенно на ее начальных этапах, продукция АФК в тканях может существенно увеличиваться. Происходит ли при этом активация процессов окислительной деструкции биомолекул в тканях? Поскольку основное количество АФК в клетках образуются при функционировании дыхательной цепи митохондрий (Murphy M. P., 2009), можно предположить, что интенсивность СРП при холодовом воздействии будет иметь тканеспецифичный характер, отражающий как интенсивность аэробного метаболизма, так их роль в общем термогенезе. В связи с этим мы рассмотрим данные об интенсивности СРП в ходе снижения температуры тела в таких тканях, как мозг, сердце, для которых характерен высокий уровень аэробного метаболизма (Erecinska M. et al., 2003), а также бурая жировая ткань и скелетные мышцы, участвующие в термогенезе (Пастухов Ю. Ф. и др., 2003; Медведев Л. Н., 2002).

Интенсивность свободнорадикальных процессов в мозге при гипотер-мических состояниях. Метаболизм мозга значительно подавляется при гипотермии. Известно, что понижение температуры тела млекопитающего всего лишь на один градус понижает уровень потребления кислорода мозгом на 5% (Erecinska M. et al., 2003). В подтверждение данного факта уже в 2008 году немецкие ученые, исследуя пациентов с тяжелыми травмами головы, сообщили, что каждое понижение температуры тела на 1С приводило к сокращению потребления энергии на 5,9%. И тем самым они показали, что существует тесная линейная корреляция между температурой тела и основным обменом (Saur J. et al., 2008).

При гипотермии в мозге уменьшается скорость метаболизма, потребление кислорода и скорость кровотока (Walter B. et al., 2000; Ouchi T. et al., 2006). По мере снижения температуры тела млекопитающих электрическая активность мозга крыс снижается и при ректальной температуре примерно 20-18С электроэнцефалограмма становится плоской (изоэлектрической) (Тимофеев Н. Н., Прокофьева Л. П., 1997; Рабаданова З. Г. и др., 2014).

Микроглия новорожденных крыс, культивируемая при 30С, демонстрировала пониженный потенциал активации и пролиферации, снижение активности синтазы оксида азота и более низкие уровни образования супероксида и оксида азота. Культивируемые астроциты из коры головного мозга и фибробласты мозговых оболочек головного мозга сохраняли свой пролиферативный потенциал при низких температурах (Si Q. S. et al., 1997; Ekimova I. V., 2003). Это свидетельствует о преимущественном влиянии гипотермии на клетки микроглии.

На гомогенатах больших полушарий головного мозга крыс изучение интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в зависимости от глубины гипотермии выявило, что уже на начальном этапе (33-35С) снижения температуры тела повышается содержание малонового диальдегида (МДА). При умеренной гипотермии cодержание МДА еще больше увеличивается (30С), а при глубокой гипотермии снижается до контрольного уровня (Эмирбековым Э. З. и др., 1991; Эмирбеков Э. З., Кличханов Н. К., 2011). В инкубируемых in vitro пробах интенсивность ПОЛ (инкубация проб в течение 30 мин при 37С) увеличивалась на всех исследованных этапах гипотермии. При этом интенсивность образования МДА нарастала по мере углубления гипотермии.

Определение окислительной модификации белков мембран эритроцитов

Содержание МДА в плазме крови определяли по реакции с тиобарбитуро-вой кислотой (ТБК) (Кличханов Н. К. и др., 2012). К 0,2 мл плазмы крови добавляли 3,0 мл 1% Н3РО4, 1,0 мл 0,6% ТБК и 0,1 мл 0,28% раствора FeS04 (П). После инкубирования на кипящей водяной бане в течение 1 ч, к пробам добавляли 4,0 мл бутанола. Пробы центрифугировали, в бутанольной фазе определяли оптическую плотность при 515 и 532 нм против чистого бутанола. Содержание продуктов, реагирующих с ТБК, рассчитывали, используя коэффициент молярной экс тинкции МДА, равного 1,56-10 5 л/(Мсм) по формуле: с_ А-106-4 1,56-10 5-0,2 где С - содержание МДА в мкмоль/л; 4 - объем бутанольной фазы, мл; 0,2 - объем плазмы, взятый на анализ; Е = Е532-Е515.

В эритроцитах содержание МДА определяли следующим образом. 2 мл 5% гемолизата смешивали с 1,0 мл 17% раствора ТХУ, а затем добавляли 1,0 мл раствора ТБК. Пробы кипятили на водяной бане в течение 10 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и проводили определение, как описано для плазмы крови.

Об интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови судили по накоплению в них карбонильных групп, реагирующих с 2,4-динитрофенолгидразином (2, 4-ДНФГ) (Арутюнян А. В. и др., 2000). В белках плазмы крови определяли как исходное содержание карбонильных групп, так и их накопление in vitro в инкубируемых пробах в присутствии среды Фентона. Для анализа исходного уровня карбонильных групп в опытную пробу последовательно вносили 0,05 мл неразведнной плазмы, 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера рН 7,4, 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ, 1,0 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ вносили 1,0 мл 2 н. НCl.

Для анализа стимулированного средой Фентона накопления карбонильных групп в белках плазмы в пробирку вносили 0,05 мл разведнной в 7 раз плазмы, 0,75 мл фосфатного буфера, рН 7,4, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ свежеприготовленного сульфата железа (II) соотношении 1:1 и 0,1 мл 0,1 мМ Н2О2. После инкубирования проб в течение 15 мин при 37С в опытную пробирку добавляли 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20%-ного раствора ТХУ, а в контрольную пробирку вместо 2,4-ДНФГ вносили 1,0 мл 2 н. соляной кислоты.

После добавления ТХУ пробы оставляли на 1 час при 24С, перемешивая каждые 10 мин. Затем пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. Для отмывания белков от несвязавшегося 2,4-ДНФГ и липидов осадок промывали 3 раза 3 мл смеси этилацетат-этиловый спирт (1:1). Промытые осадки белков высушивали в сушильном шкафу при 40С, а затем растворяли в 8 М растворе мочевины. Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм. Уровень карбонильных групп рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции ДНФГ-производных, равный 22000 М-1 см-1 по формуле: А=Е оп-Е к 22000хС где А – содержание фенилгидразонов в нмолях на 1 мг белка; Еоп и Ек – оптическая плотность опытной и контрольной проб соответственно; С – содержание белка в пробе в граммах.

В качестве маркера окислительной модификации белков мембран эритроцитов определяли содержание в них карбонильных групп (Venditti P. et al., 2004). Пробы осаждали 20%-ым раствором ТХУ. После центрифугирования осадок мембранных белков растворяли в 0,1 мл 0,1 н. NaOH.

Определение исходного уровня карбонильных групп в белках. В опытную пробу вносили солюбилизированные мембраны эритроцитов, содержащие примерно 0,33 мг белка, 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ вносили 1,0 мл 2 н. HCl.

Определение содержания карбонильных групп в белках, стимулированных средой Фентона. В пробирку вносили солюбилизированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа 1:1 (готовили перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ H2O2. Пробы инкубировали 15 мин при 37С. После этого в опытную пробирку добавляли 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку вместо 2,4-ДНФГ вносили 1,0 мл 2 н. соляной кислоты.

Дальнейший анализ проводили как описано выше при определении карбонильных групп в белках плазмы крови. Уровень карбонильных групп рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции для ДНФГ-дериватов, равный 22000 М-1см-1 по формуле: 22000 где А – содержание фенилгидразонов в нмолях на 1 мг белка, Еоп – экстинкция опытной пробы.

Концентрацию SH-групп в мембранных белках измеряли колориметрическим методом, описанным Хабиб (Habeeb A. F. S. A., 1972). К 1,5 мл буфера рН 8,0 (0,08 моль/л фосфата натрия, 0,5 мг/мл Na2-ЭДТА, и 2% додецилсульфата натрия) добавляли 0,2 мл суспензии мембран, содержащей 120 мкг белка. После перемешивания к пробам добавляли 0,1 мл 5,5 -дитио-бис 2-нитробензойной кислоты (ДТНБ; 20 мг в 10 мл 0,1 моль/л натрий-фосфатного буфера, рН 8,0), и раствор снова перемешивали. Через 15 мин инкубации при 24С, оптическую плотность проб измеряли при 412 нм против контроля, содержащей вместо мембран эквиобъем воды. Концентрацию SH-групп в нмолях на миллиграмм белка рассчитывали, используя коэффициент молярного поглощения 13600 (М/л)-lcm-1.

Содержание восстановленного глутатиона (GSH) в эритроцитах определяли методом Эллмана (Арутюнян А. В. и др., 2000). Для осаждения белков 0,6 мл 10% гемолизата смешивали с 0,2 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Через 10 мин пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. К 2,55 мл 0,1 М трис-HCl буфера с 0,01% ЭДТА добавляли 0,2 мл супернатанта, а затем 25 мкл 0,4% метанолового раствора ДТНБ. Оптическую плотность проб измеряли против дистиллированной воды при 412 нм. Расчет производили с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием растворов восстановленного глута-тиона.

1988). Готовили исходный 1%-ный гемолизат. Для осаждения балластных белков к 1 мл 1%-ного гемолизата добавляли 0,3 мл этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь оставляли 30 мин на холоде, время от времени перемешивая, а затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге MR 23i. Верхний слой использовали в качестве источника фермента. Перед определением активности фермента готовили инкубационную смесь следующего состава: 26 мл 0,067 М фосфатного буфера рН 7,8, 1 мл 26,9 мкМ ЭДТА, 1 мл 4,04 мкМ ТНС, 1 мл 65 мкМ феназинаметасульфата, 1 мг желатина. В опытные пробирки, содержащие 2,85 мл инкубационной смеси, вносили по 0,1 мл супернатанта и 0,1 мл 1 мМ НАДН. В контрольную пробу вместо супернатанта вносили 0,1 мл 0,067 М фосфатного буфера рН 7,8. Пробы инкубировали в течение 10 мин при 25С в темноте. Реакцию останавливали освещением проб. Оптическую плотность измеряли при длине волны 540 нм против смеси, содержащей все компоненты инкубационной среды, кроме НАДН.

Свободнорадикальные процессы в крови крыс при умерен ной гипотермии разной длительности

При пролонгировании гипотермии содержание глюкозы в плазме крови снижается до уровня контроля. Повышение уровня глюкозы в крови на начальных этапах гипотермии, видимо, связано как с поступлением из печени, так и со снижением ее потребления тканями в связи со снижением уровня инсулина в крови и чувствительности рецепторов клеток к инсулину (Torlinska T. et al., 2002). В этой работа показано, что при гипотермии 28С существенно (на 50-80%) снижается также количество высокоаффинных рецепторов инсулина в печени и жировой ткани крыс.

Возможно, что увеличение концентрации глюкозы в нашем исследовании связано также с влиянием кортизола на процессы глюконеогенеза, т.е. является результатом активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (Stef-fens A. B., Boer de S. F., 1999). Мохаммед Т. Джабер Маяхи и Кличханов Н. К. (2012) обнаружили в крови крыс существенное повышение уровня кортизола при кратковременной гипотермии 30С и снижение ее уровня после пролонгированной 180 мин гипотермии 30С. Воздействуя на печень и поджелудочную железу глюкокортикоиды участвуют в регуляции уровня глюкозы в крови. Кортизол снижает аффинность рецепторов инсулина и подавляет его секрецию, усиливает секрецию панкреатического глюкагона и потенцирует его действие на гликогено-лиз и глюконеогенез в печени, что, в конечном счете, увеличивает содержание глюкозы в крови (Чернышова М. П., 1995). В гепатоцитах кортизол блокирует синтез липидов из глюкозы. Глюкокортикоиды участвуют в регуляции синтеза глюкозы de novo путем ускорения дезаминирования белков и увеличения пула свободных аминокислот. Это увеличивает количество субстратов для окисления и, соответственно, термогенез.

Увеличение уровня глюкозы соответствует короткой продолжительности гипотермии. При пролонгированной гипотермии мы можем ожидать утилизацию глюкозы и истощение запасов гликогена. Действительно, после пролонгированной гипотермии уровень глюкозы нормализуется (рис. 1).

Влияние гипотермии на содержание липидов в плазме крови крыс. Сразу после снижения температуры тела до 30С содержание триацилглицеролов в плазме возрастает на 28% относительно контроля (табл. 2). По мере пролонгирования гипотермии содержание триацилглицеролов в крови снижается до контрольного уровня.

В плазме крови триацилглицеролы находятся в основном в составе хило 54 микронов и ЛПОНП (Климов А. Н., Никульчева Н. Г., 1999). Поскольку кровь для анализа брали утром до приема пищи, то уровень триацилглицеролов определяется в основном содержанием в плазме ЛПОНП. При кратковременной умеренной гипотермии содержание ЛПОНП в плазме крови крыс возрастает на 36% (Маяхи М. Т. Д. и др., 2012). Повышение содержания триацилглицеролов при гипотермии, видимо, связано с торможеним рецептор-зависимого эндоцитоза клетками тканей ЛПОНП (Титов В. Н., 1999). В плазме крови крыс при гипотермии существенно увеличивается свободные жирные кислоты (Кличханов Н. К., Эмирбеков Э. 3., 2001). Показано, что свободные жирные кислоты ингибируют липопротеинлипазу эндотелия капилляров (Van Amersfoort Е. S. et al, 2003). Это, в свою очередь, может быть причиной снижения гидролиза триацилглицеролов в составе ЛПОНП.

При кратковременной гипотермии 30С на 23,5% повышается содержание холестерина в плазме крови (табл. 2), но после пролонгирования гипотермии его уровень нормализуется. Эти результаты согласуются с данными литературы (Маяхи М. Т. Д. и др., 2012). Повышение в той или иной мере уровня общего хо 55 лестерина крови при гипотермии и увеличение доли его свободной формы было обнаружено и другими исследователями (Богрицевич Ю. И., 1978; Эмирбеков Э. З. и др., 1995; Маяхи М. Т. Д. и др., 2012).

Повышение уровня холестерина при кратковременной гипотермии 30С у крыс происходит в основном за счет холестерина ЛПВП (r = 0.86). Нарастание содержания в плазме крови суммарного холестерина ЛПВП связывают с повышением активности лецитин-холестеринацилтрансферазы при умеренной (28С) гипотермии (Гурин В. Н., 1986).

Таким образом, при кратковременной гипотермии содержание холестерина увеличивается в составе ЛПВП. Эти липопротеины забирают избыток холестерин с плазматических мембран клеток крови и периферических тканей и доставляют в печень и другие ткани (Климов А. Н., Никульчева Н. Г., 1999).

При пролонгированной 3 ч гипотермии 23С методами флуоресцентного двумерного гель-электрофореза и масс-спектрометрии в печени крыс была обнаружена повышенная экспрессия белка аполипопротеина А-1 (Oda T. et al., 2012), который участвует преимущественно в транспортировке холестерина из тканей в печень. Нормализация уровня холестерина в крови при пролонгированной умеренной гипотермии, обнаруженная нами, возможно, также связана с увеличением его транспорта в печень при участии аполипопротеина А-1. В ряде работ показано (Gu S. S. et al., 2007; Shi N., Wu M. P., 2008), что аполипопротеин А-1 уменьщает повреждение ткани почек и миокарда при ишемии/реперфузии, а также подавляет образование воспалительных цитокинов и предотвращает активацию нейтрофи-лов у крыс.

Влияние гипотермии на ионный состав плазме крови крыс. При анализе ионного состава крови обнаружена тенденция к росту уровня натрия в плазме крови при кратковременной гипотермии (табл. 3). После пролонгированной гипотермии содержание натрия в крови достоверно снижается.

При кратковременной и пролонгированной 90 мин гипотермии содержание калия в плазме крови не изменяется (табл. 3). Достоверное снижение содержания калия в крови происходит после пролонгированной 180 мин гипотермии. Гипока 56 лемия была обнаружена у собак при умеренной (32С) краниоцеребральной гипотермии (Малыгина Н. А., 1985) и у людей, охлажденных до 31-30С при операциях на сердце (Мешалкин Е. Н., Верещагин И. Г., 1985). Считают, что гипокалемия связана с переходом экстраклеточного калия в клетки из-за изменения проницаемости мембран, а также снижения активности натрий-насоса (Koht A. et al, 1983). При гипотермии существенно снижается активность Na, К-АТФазы мембран эритроцитов (Маслова М. Н., 1994; Кличханов Н. К. и др., 2001). Кроме того, полагают, что при гипотермии потеря калия с мочой может составить значительную величину (Акимов Г. А. и др., 1977; Мешалкин Е. Н., Верещагин И. Г., 1985).

Влияние умеренной гипотермии разной длительности на показатели функционального состояния эритроцитов крови крыс

Анализ содержания глюкозы и липидов в плазме крови в динамике умеренной гипотермии свидетельствует о том, что в начале снижения температуры тела происходит стрессорное повышение их уровня в крови, а в ходе пролонгирования гипотермии адаптивная перестройка метаболизма способствует нормализации уг-леводо-липидного обмена.

Неспецифической реакцией стресса любой этиологии, в том числе и холодового, является активация свободорадикальных процессов в тканях (Эмирбеков, Кличханов Н. К., 2011; Исмаилова Ж. Г и др., 2012; Alva N., 2013; Blagojevi D., 2014). Поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса в плазме крови и эритроцитах при умеренной гипотермии разной длительности.

Интенсивность оксидативного стресса может быть оценена путем анализа концентрации продуктов реакции АФК с такими биомолекулами, как белки и ли-пиды (Villamena F. A., 2013). Следствием свободнорадикальной деградации ненасыщенных жирных кислот липидов является повышение концентрация МДА, а белков – карбонильных групп и снижение тиоловых групп.

Анализ содержания МДА в плазме крови и эритроцитах, а также карбонильных и тиоловых групп в белках плазмы крови и мембран эритроцитов однозначно свидетельствует об активации процессов их окислительной модификации в начале гипотермии и снижении этих процессов через 180 мин гипотермии. Это означает, что холодовый стресс в начале гипотермии стимулирует образование АФК. При действии холода и умеренной гипотермии основными источниками АФК в крови могут стать эндотелиальные клетки капилляров (Bailey S. R. et al., 2005). В цельной крови, О2 и Н2О2 поступающие в плазму могут легко диффун-. дировать в эритроциты: О2 может пройти через анионные каналы в мембране эритроцитов (Bogdanova A. Y., Nikinmaa M., 2001), а Н2О2 может пересекать клеточную мембрану путем простой диффузии (Fischer A. B., 2009). Другим источником АФК в крови являются сами эритроциты. Концентрации Hb в эритроцитах составляет около 5 ммоль/л, а концентрация железа гема составляет приблизительно 20 мМ (Olszewska M. et al., 2012). Цитоплазма эритроцитов богата кислородом, который в присутствие ионов переходных металлов, в основном, железа и меди, превращается в свободный радикал. При образовании комплекса кислорода и ионов железа (Fe+2) с дезоксиHb возможен переход электрона с внешней обо. лочки ионов железа (II) на кислород. Это приводит к образованию метHb и О2 , который атакует тиоловые группы Hb и белков цитоскелета. В результате образуются белковые агрегаты Hb и белков цитоскелета, связанные дисульфидной связью (Jollow D. J., McMillan D. C., 2001).

В связи с этим в эритроцитах имеется собственная, достаточно сбалансированная и логически обоснованная система антиоксидантной защиты, чего не наблюдается в соматических клетках различных органов и тканей (Сторожук П. Г., 2000; Ершова Л. И., Горбунов Н. А., 2004). Эритроциты действительно действуют как перехватчики АФК, поступающих в плазму (Oishi K. et al., 1999), по этой причине антиоксидантные ферменты эритроцитов очень важны для предотвращения АФК-индуцированного ПОЛ и в плазме крови. Среди антиоксидантных ферментов эритроцитов важнейшую роль в поддержании антиоксидантного статуса принадлежит СОД, которая осуществляет антирадикальную защиту и ингибирует ПОЛ на стадии зарождения цепи, а также каталазе, расщепляющей H2O2 (Zhou Z., Kang Y. J., 2000; Zelko I. et al., 2002). Несмотря на насыщенность клеток кислородом, липиды и белки эритроцитов лучше защищены от действия АФК за счет высокой активности СОД и каталазы (Бобырев В. Н. и др., 1994; Mueller S. et al., 1997). Для жизнеспособности клетки важно сохранить баланс между активностью СОД и скоростью разрушения H2O2: резкое повышение в клетке активности СОД без соответствующей активации каталазы, что обнаружено в наших исследованиях, может быть еще одной причиной накопления H2O2 в эритроцитах.

В нашем исследовании было обнаружено повышение активности СОД эритроцитов в динамике гипотермии. Особенно значительно возрастает активность СОД после 180 мин пролонгированной гипотермии. В эритроцитах обнаруживается исключительно цитозольная форма фермента (Kurata M. et al., 1993). После того как эритроциты поступают в кровь из костного мозга, они теряют ядро, рибосомы, митохондрии и по этой причине способность к делению, синтезу белка и связанные с митохондриями основные окислительные процессы (imen M. Y. B., 2008). Следовательно, безъядерные эритроциты не способны к синтезу, дополнительно необходимого им для защиты количества СОД.

Можно предположить, что при гипотермии имеет место химическая модификация молекулы СОД, приводящая к активации фермента. Обычно такие реакции носят регуляторный характер и осуществляются путем фосфорилирования-дефосфорилирования, при участии протеникиназ, а также редокс-регуляции, путем окисления и восстановления тиоловых групп белков (Дубинина Е. Е., 2006).

Поскольку молекула СОД имеет редокс-чувствительную тиоловую группу (De Beus, M. D. et al., 2004), то повышение активности СОД при гипотермии 30С, особенно при пролонгированной 180 мин гипотермии 30С, можно связать с восстановлением этой важной для катализа SH-группы глутатионом (r = 0,650). Повышение активности СОД в эритроцитах при кратковременной и, особенно пролонгированной гипотермии, очевидно, имеет адаптивный характер и направлено на снижение СРП в крови.

Оиши и сотр (Oishi K. et al., 1999) показали, что при иммобилизационном стрессе у крыс значительно увеличивается активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах. Одновременно уменьшается общее количество эритроцитов в крови. Авторы предположили, что одним из возможных механизмов таких изменений является лизис эритроцитов, имеющих низкую активность антиоксидант-ных ферментов, в результате чего остаются только клетки с высокой активностью ферментов.