Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования, посвященные адаптации организма к гипотермии, приобретает все большую актуальность в связи с развитием медицины экстремальных состояний и применением в клинике искусственной гипотермии для предотвращения негативных последствий гипоксии, а также разработкой методов холодового наркоза и краниоцеребральной гипотермии (Бабийчук и соавт., 1990; Сумбатов и соавт., 1981; Sessler, 1995; Selden et al., 1994).
Значительное снижение температуры тела гомойотермних животных приводит к существенным сдвигам в функционировании головного мозга, а возврат к нормотермии не обеспечивает полного восстановления деятельности центральной нервной системы и компенсации нарушенных функций. Поэтому в исследованиях, посвященных разработке методов коррекции нарушений, вызываемых глубоким охлаждением, перспективным является изучение физиологических эффектов веществ, участвующих в механизмах зимней спячки гибернирующих животных. Наличие у гибернантов специфических механизмов адаптации к гипотермии позволяет им не только безболезненно переносить неблагоприятные условия при температуре тела 3-5С, но и достаточно быстро выходить из состояния гибернации. Показано, что во время выхода из спячки в тканях зимосгепцих животных индуцируется образование веществ, стимулирующих физиологические функции организма. Одним из таких соединений является выделенный из мозговой фракции гибернирующего длиннохвостого суслика Citellus undulatus нейропептид неокиоторфин (НКТ) (Сухова и соавт., 1990; Игнатьев и соавт., 1990).
В последние годы, для коррекции различных функциональных сдвигов все шире используют эндогенные нейропептиды, обладающие выраженными регуляторными свойствами. Антистрессорное действие дельта-сон индуцирующего пептида (ДСИП), а также его способность повышать сопротивляемость организма к различным неблагоприятным факторам среды были продемонстрированы в ряде работ (Иванов, 1984; Судаков, 1988; Менджерицкий и соавт., 1994). Этот пептид обнаружил широкий спектр действия на функциональное состояние мозга. Показано, что адаптивные свойства ДСИП реализуются посредством модулирующего действия на механизмы синаптическои пластичности, создавая состояние преадаптации к различным по этиологии стрессорным воздействиям (Кураев и соавт., 1991; Менджерицкий и соавт., 1993; Povilattite et al., 1996).
Особенности морфофункциокальных механизмов пептидной регуляции, позволяющие в одних случаях повысить общие адаптивные возможности ЦНС к патологическим воздействиям, а в других - увеличить резистентность нейронов
центральной нервной системы к действию низких температур, остаются в настоящее время практически неизученными.
В этой связи целью работы являлось сравнительное изучение влияния НКТ и ДСИП на температуру тела крыс, пластичность ультраструктуры нервной ткани и систему биогенньк моноаминов в условиях гипотермии и после процесса самосогревания.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
1.Изучить влияние НКТ и ДСИП на изменение температуры тела крыс в условиях нормотермии, при длительном холодовом воздействии и в процессе выхода из состояния гипотермии.
2.Изучить влияние НКТ и ДСИП на ультраструктуру III-V слоев сенсомоторной коры головного мозга крыс в условиях нормотермии, при гипотермии и после самосогревания. При помощи компьютерной морфометрии количественно оценить ультраструктурные альтерации аксосоматических и аксошипиковых синапсов.
3.Исследовать действие НКТ и ДСИП на систему биогенных моноаминов в коре головного мозга для оценки функционального состояния синаптической передачи в условиях нормотермии, при гипотермии и после процесса самосогревания.
Научная новизна работы:
1. Впервые проведен сравнительный анализ действия НКТ и ДСИП в условиях
нормотермии, гипотермии и самосогревания, включающий изучение действия пептидов
на температуру тела, структурные и медиаторные изменения в коре головного мозга
крыс. Выявлены различия реактивных изменений синаптических структур неокортекса в
ответ на глубокое охлаждение при внутрибрюшинном введении пептидов.
2. На основе морфометрического анализа показана роль различных типов
синаптических структур в обеспечении организации компенсаторно-приспособительных
реакций к гипотермии при действии нейропептидов. Выявлены общие, а также
специфические для НКТ и ДСИП изменения ультраструктуры синаптического аппарата
неокортекса под влиянием низкой температуры на фоне предварительного введения
пептидов.
3. Показана возможность использования НКТ для ускорения выхода из состояния
гипотермии незимоспящих животных. Установлено, что действие пептида приводит к
значительному увеличению скорости самосогревания сразу после прекращения
холодового воздействия и сопровождается выраженными изменениями в ультраструктуре
сенсомоторной коры и появлением признаков повышения эффективности возбуждающих синаптических контактов.
^Продемонстрирована способность предварительно введенных пептидов предотвращать возникающие в результате действия низких температур перестройки ультраструктуры нервной ткани и деструктивные изменения синаптического аппарата неокортекса. Показано, что инъекция НКТ перед гипотермией предохраняет субклеточные структуры нейронов и глиоцитов коры головного мозга крыс, способствуя сохранности, главным образом, мембранных компонентов клеток. Эффекты ДСИП, обладающего кариотропным действием, направлены на усиление межклеточных взаимодействий и обеспечение сохранности энергетического аппарата клеток.
5.Получены доказательства вовлечения моноаминергической системы сенсомоторной коры головного мозга в механизмы реализации действия НКТ и ДСИП как в норме, так и после воздействия низких температур. Установлено, что инъекция НКТ обладает более выраженным по сравнению с ДСИП действием на содержание катехоламинов и серотонина в головном мозге.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящей работы имеют существенное значение для понимания механизмов действия нейропептидов, процессов регуляции синаптической пластичности. В работе представлены данные о способности НКТ и ДСИП участвовать в процессах пластических преобразований нейронов и межнейронных контактов коры головного мозга, определяя вариант развития компенсаторно-приспособительных реакций нервной ткани при гипотермии и в процессе самосогревания. Выявлены универсальные, а также специфические преобразования различных типов синаптических контактов во время гипотермии и после самосогревания при введении изучаемых нейропептидов.
Полученные данные имеют непосредственное практическое значение для медицины, так как могут быть использованы при разработке методов использования холодового наркоза при проведении оперативных вмешательств, а также для повышения устойчивости ткани мозга к гипотермическому воздействию.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Неокиоторфин и дельта-сон индуцирующий пептид обладают способностью
оказывать разнонаправленное влияние на температуру тела в условиях нормотермии, при
гипотермии и в процессе самосогревания.
2. Повышение адаптивных возможностей мозга к действию низких температур при
предварительном введении неокиоторфина сопровождается ультраструктурными
изменениями синаптического аппарата сенсомоторной коры, свидетельствующими о повышении эффективности возбуждающих аксошипиковых контактов. Адаптогенное действие дельта-сон индуцирующего пептида в отличие от неокиоторфина связано с преимущественным воздействием на аксосоматические синапсы, что свидетельствует об усилении тормозных влияний в коре.
3. Действие неокиоторфина и дельта-сон индуцирующего пептида на процессы
синаптической пластичности при гипотермии реализуется на уровне модуляции
моноаминергнческих систем мозга.
4. Морфофункциональные особенности действия периферического введения
неокиоторфина и дельта-сон индуцирующего пептида в условиях гипотермии и во время
самосогревания соответствуют развитию у строгих гомойотермов (крыс) различных
адаптационных стратегий - резистентной и толерантной.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XI Международной конференции по нейрокибернетике (г. Ростов-на-Дону, 1995), конференции молодых ученых «Физиологические исследования молодых ученых Северо-Кавказского региона» (г. Ростов-на-Дону, 1995г.), X Международном Симпозиуме Американского общества исследователей сна (г. Вашингтон, США, 1996), 8-ом Международном конгрессе Чешского и Словацкого нейрохимического общества (Мартин, Словакия, 1996), 11-ом конгрессе Международного общества нейробиологии развития (г. Тампере, Финляндия, 1996), 1-ой Финско-Российской Школе по нейронаукам (г. Твармине, Финляндия, 1997).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит 11 таблиц и 40 рисунков. Список литературы включает 195 источников, из них 101 иностранных авторов.
Материалы н методы исследования
Исследования проводили на 105 белых беспородных крысах самцах массой 120-150 г, содержавшихся на полном пищевом рационе в условиях вивария при температуре 18-20С. Для экспериментов использовали НКТ и ДСИП, синтезированные в лаборатории Химии пептидов Института Биоорганической химии им. ММ. Шемякина РАН, г. Москва, любезно предоставленные в.н.с. И.И. Михалевой. Пептиды вводили
внутрибрюшинно: НКТ - в дозе 500 мкг/кг за 1,5 часа до воздействия; ДСИП - в дозе 120 мкг/кг за 1 час до воздействия. Контрольным крысам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0.9% NaCl). Дозы пептидов и временные интервалы для изучения их действия были отработаны на крысах в предыдущих исследованиях (Менджерицкий и соавт., 1988, 1994; Зиганшин и соавт., 1994).
Гипотермию в течение 2,5 часов моделировали в камере-норке с охлаждаемой водяной рубашкой, позволяющей регулировать уровень охлаждения и непрерывно фиксировать термодатчиком ректальную температуру животного. Температура воды в водяной рубашке составляла 8С. Когда ректальная температура животного опускалась до 18С, ее поддерживали на постоянном уровне до извлечения крысы из камеры. После гипотермии в сериях с самосогреванием животных помещали в клетки, где они находились при комнатной температуре (20 С).
Были поставлены следующие серии экспериментов:
1. Влияние нейропептидов:
введение неокиоторфина;
введение дельта-сон индуцирующего пептида.
2. Действие гипотермии:
гипотермия;
гипотермия на фоне предварительного введения НКТ;
гипотермия на фоне предварительного введения ДСИП.
3. Действие гипотермии и последующего самосогревания:
гипотермия + самосогревание
гипотермия + самосогревание на фоне предварительного введения НКТ;
гипотермия + самосогревание на фоне предварительного введения ДСИП. Кроме того, было изучено совместное действие НКТ и ДСИП на ректальную
температуру крыс. Этим животным за 1,5 часа до помещения в камеру и охлаждения внутрибрюшинно вводили НКТ в дозе 500 мкг/кг и за 1 час - ДСИП в дозе 120 мкг/кг.
После декапитации, мозг извлекали на холоду и производили забор материала для электроиномикроскопического и биохимического исследований. Для обработки материала для электронной микроскопии использовали общепринятые методы (Robinson, Gray, 1990; Bozzola, Russell, 1992). Для выбора Ш-V слоев сенсомоторной коры изготавливали полутонкие срезы и изучали в световом микроскопе для прицельной заточки пирамиды перед приготовлением ультратонких срезов. Ультратонкие срезы получали на
ультрамикротоме Ultracut (Leica) и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе Philips ЕМ-208. Использованный электронный микроскоп оснащен автоматизированной системой ввода и анализа изображения - аппаратно-программным комплексом Analysis (Holland). Встроенная CCD TV камера (Gatan, USA) связана с компьютером, что позволяет считывать получаемое изображение и производить его запись в память ЭВМ.
Для объективизации выявляемых визуально изменений в строении синаптических контактов неокортекса крыс было проведено морфометрическое исследование аксосоматических и аксошипиковых синапсов с исходным увеличением хПООО и х5б000. Для получения адекватной характеристики изучаемых параметров применяли метод систематического случайного отбора (Mayhew, 1990).
Морфометрическому исследованию подвергалась ультраструктура пре- и постсинаптической частей контакта. Измерялись периметр, площадь, минимальный и максимальный диаметры, а также фактор формы пре- и постсинапса. Необходимость учета всех параметров связана с возможностью изменения формы измеряемой структуры (Автандилов, 1990). Аналогичные параметры рассчитывались для митохондриальных профилей в аксонных терминалях. Кроме того, производашся подсчет общего числа синаптических везикул в пресинаптических аксонных окончаниях, а также количество везикул вблизи активных зон. Рассчитывалось отношение числа везикул проксимального и дистального пулов (Pieribone et al., 1995; De Camilli, 1995). В каждом синапсе определяли число активных зон и суммарную протяженность профиля активной зоны контакта. Измерения ширины синаптической щели проводили только на синапсах с центральным срезом, где отчетливо визуализировалась двухслойная структура пре- и постсинаптической мембраны.
Для определения содержания биогенных моноаминов в коре головного мозга препараты анализировали, применяя обращенно-фазный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии /ВЭЖХ/ на установке Liquochrom (Венгрия). В качестве детектора использовали флуоресцентный спектрофотометр «Hitachi F-4010» (Япония) со встроенным процессором, с помощью которого производили расчет концентраций моноаминов в образцах (Krstulovic, Powell, 1979).
Статистическую обработку данных проводили на ШМ РС/АТ-486. Для сравнения выборочных средних использовали t-критерий Стьюдента (Тюрин, Макаров, 1995), достоверными считали различия с вероятностью р<0.05.