Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Таксономия и некоторые биологические особенности подсемейства \ \ настоящие пчелы (Apinae)
1.2 Развитие знаний о биологии пчелы медоносной 16
1.3 Филогения и подвиды пчелы медоносной Apis Mellifera L. 21
1.4 Характеристика пчел подвидов Apis mellifera mellifera L. и Apis mellifera carpathica A.
1.4 .1 Общая характеристика пчел среднерусского подвида , (Apis mellifera mellifera L. )
1.4.2 Общая характеристика медоносной пчелы карпатского подвида зо (Apis mellifera carpathica А.)
1.5 Строение пищеварительной системы пчелы медоносной 34
(Apis Mellifera L.)
1.5.1 Ротовой аппарат пчелы. Приспособление к питанию нектаром и 34 пыльцой
1.5.2 Строение пищеварительного канала пчелы медоносной (Apis mellifera L.) 38
2. Условия и методы проведения исследований 56
2.1 Жизненный цикл пчелиных семей в условиях Камского Предуралья 56
2.1.1 Климатические условия Предуралья и Пермского края 56
2.1.2 Особенности жизненного цикла пчелиных семей Apis mellifera L. 59
изучаемых подвидов
2.2 Территориальное расположение исследуемых пасек и особенности медосбора
2.3 Отбор материала 65
2.4 Методика морфометрических исследований 67
2.5 Методика фиксации 72
2.5.1 Корректировка временных промежутков при пробоподготовке 75
2.6 Микротомирование и окрашивание 82
2.7 Анализ препаратов
3. Морфометрические исследования пчелиных семей apis mellifera mellifera l. И apis mellifera carpathica a.
4. Анализ сезонных изменений средней кишки (ventriculus)
4.1 Годовые изменения вентрикулярного эпителия у Apis mellifera mellifera L. 107
4.2 Годовые изменения вентрикулярного эпителия у Apis mellifera carpathica А . 127
5. Сравнительный анализ сезонных изменении вентрикулярного эпителия
6. Заключение 161
7. Выводы 166
Предложения производству 168
Список литературы
- Филогения и подвиды пчелы медоносной Apis Mellifera L.
- Климатические условия Предуралья и Пермского края
- Корректировка временных промежутков при пробоподготовке
- Годовые изменения вентрикулярного эпителия у Apis mellifera carpathica А
Филогения и подвиды пчелы медоносной Apis Mellifera L.
Ареал Apis сегапа частично заходит в Палеарктику: в Северо-Восточном Китае, Японии и Южном Приморье, где она представлена северным подвидом - китайской восковой пчелой А. сегапа сегапа; (Песенко и др., 1989; Радченко, Песенко, 1994).
Apis сегапа Fabr. и недавно признанный легитимным вид Apis indica Fabr. — внешне более сходны с Apis mellifera L., эти насекомые также строят гнезда в дуплах деревьев или расщелинах скал из нескольких сотов, но отличаются меньшими размерами особей, уступая и по медовой продуктивности максимальное количество меда с семьи не превышает 25-3Окг. ( Лебедев, Билаш, 1991).
Лишь A. Mellifera интродуцирована практически повсеместно, в связи с сельскохозяйственной деятельностью человека и распространенна по всему миру. Медоносная пчела Apis mellifera L. завезена на все материки земного шара, кроме Антарктиды и имеет ряд подвидов или рас, с характерными морфологическими, этологическими и другими признаками. Необходимо отметить, что термин «раса» широко применяется как в отечественных, так и в зарубежных литературных источниках, кроме того, в сельскохозяйственной литературе употребляется термин «порода» в отношении тех - же таксономических единиц. Неоднозначность терминологии в литературе вносит некоторую неясность в инфравидовую структуру вида A.mellifera L. Многие исследователи отмечают неправомерность использования термина «порода», для всех инфравидовых групп Apis mellifera L. поскольку он подразумевает накопление характерных признаков в результате селекционной работы человека, а в отношении, например Apis mellifera mellifera L. и Apis mellifera carnica Pollmann это будет неверным. Перечисленные группы, согласно их положению в филогенетической структуре, являются географическими расами, т.е. результатом естественного эволюционного процесса (Чернышев 1996; Ильясов, Поскряков, и др., 2007-2009). В работах затрагивающих филогенез и внутривидовую структуру вида Apis mellifera используется именно этот термин. Автором термин «раса» также применялся во избежание противоречий, с большинством отечественных и значительной части зарубежных литературных источников по теме исследований. Согласно международному кодексу зоологической номенклатуры (МКЗН, ICZN) триноминальные латинские названия без явного указания на инфраподвидовую сущность приравниваются к подвидовым (П.45.6.1, 45.6.2 Международный кодекс зоологической номенклатуры, 2004). Таким образом, расовые и породные группы характеризующиеся в литературе триноминальными названиями в биологических исследованиях, по всей видимости, необходимо отождествлять с подвидами, при их валидности в современной систематике вида (Николаенко, 2005; Лебединский, 2016). В данной работе употребляется термин «подвид» согласно международному кодексу зоологической номенклатуры.
Медоносная пчела не только играет огромную роль в жизни и хозяйственной деятельности человека, но и составляет существенный элемент почти всех наземных экосистем, благодаря масштабному разведению. Этот вид привлекает внимание исследователей на протяжении многих столетий, и стал одним из самым изучаемых видов насекомых. В сложившейся ситуации значение апин и в частности Apis mellifera L. в жизни биоценозов сложно переоценить в связи с их чрезвычайно широким распространением. По сравнению с другими опылителями цветковых растений, такими как, например двукрылые (Diptera) и чешуекрылые (Lepidoptera) пчелы стоят особняком в связи с их общественной организацией. В результате этого достаточно эффективного приспособления противодействие многим неблагоприятным факторам среды обитания производится надорганизменной структурой - пчелиной семьей (колонией). Данная структура имеет ряд очевидных преимуществ, например способность рассредоточиться в достаточно крупной области пространства при этом полностью не теряя информационного единства, - рабочие пчелы способны обмениваться информацией как на биохимическом уровне (пахучие вещества выделяемые маткой, передаваемые при контактах рабочих особей, «след» пчел в воздухе) а также с помощью поведенческих актов - «танец» рабочих пчел (Лебедев, Билаш, 1991; Маннапов, и др., 2011).
Пчелиная семья характеризуется следующими признаками: относительной общностью происхождения — все пчелы являются потомками только одной матки (и одного из 15-30 трутней), трутни развивающиеся из неоплодотворенных яиц несут только гаплоидный набор хромосом матки; общностью выращивания большого количества расплода (забота о потомстве), кормления, защиты гнезда и регулирования его микроклимата; распределением работ между отдельными особями и отдельными группами пчел в зависимости от возраста и физиологического состояния их организма; неспособностью ни одного из членов сообщества к самостоятельному существованию; подчиненностью жизни и работы отдельных особей общим функциям всей семьи. За сутки матка способна откладывать до 2000 и по некоторым данным даже 3000 яиц, а за сезон 150000-200 000, количество особей в одной пчелиной семье в период наибольшего ее развития семье может достигать 70 тыс., а радиус полетов за кормом до 3 км. Пчелы из одной полноценной семьи способны посетить за день 40 - 50 млн. цветков гречихи, подсолнечника и др. (Лебедев, Билаш, 1991).
Упомянутые особенности позволяют пчелам и шмелям оказывать весьма существенное влияние на жизнь биоценозов, поскольку они являются исключительными насекомыми по эффективности в качестве опылителей (Козин, Голиков, и др., 1983; Козин 1986).
Климатические условия Предуралья и Пермского края
Характерным качеством пчел этих пчел является их миролюбие, позволяющее пчеловоду работать с ними без сетки и дымаря в течение всего сезона, а также достаточно спокойное поведение на сотах при осмотре гнезда. Вместе с тем, встречаются и менее спокойные популяции. От восковой моли свои гнезда защищают слабо. Тенденция к сбору прополиса практически не выражена.
Печатка меда в семьях карпатских пчел преимущественно белая, "сухая", однако, можно встретить и смешанную печатку. Отличаются хорошей предприимчивостью в отыскании новых источников медосбора, быстро переключаются на новые его источники (Кривцов, Сокольский, 2001). Способны использовать даже незначительные источники медосбора. И.А.Левченко (1976) отмечал уникальную способность карпатских пчел собирать нектар с низким (8%) содержанием Сахаров. Высокая мобилизационная активность и отмеченная выше способность к сбору нектара с невысоким содержанием сахара - следствие эволюционной приспособленности к горным условиям. Карпатские пчелы способны в более раннем, по сравнению с другими породами, возрасте включаться в активную фуражировочную деятельность. Мед складывают сначала в расплодную, а затем в магазинную часть гнезда. Могут интенсивнее среднерусских пчел опылять бобовые культуры.
Упомянутые поведенческие особенности, закреплены генетически на уровне инстинктов, и проявляются независимо от территориального расположения пчелиной семьи, что хорошо заметно при организации пасек, на которых содержатся карпатские пчелы (Харитонов,2013). Отличия А. т. carpathica от краинских пчел могут быть обусловлены продолжительными селекционными воздействиями на этот подвид, поскольку он является одним из самых распространенных, и районирован во многих регионах (Гайдар, Боднарчук, и др., 2001; Гайдар, 2001). Существуют несколько распространенных селекционных типов карпатских пчел, имеющих четко установленные морфо-этологические признаки: «Вучуковский», «Колочавский», «Говерла» (Гайдар, 2001). Сезонные биоритмы пчел карпатского подвида заметно отличаются от таковых например среднерусского, что сказывается на режиме метаболизма в период зимней диапаузы, сроках выращивания расплода, и как следствие расходе кормов (Мурылев, Петухов, и др., 2010,2012; Лаврский, Лебединский, 2011) . Ройливость карпатских пчел слабая, теснота в гнездах не провоцирует у них роевого состояния. Слабая ройливость - также следствие приспособленности к горным условиям с неустойчивым медосбором. При отсутствии источников медосбора после периода весеннего развития до 30% пчелиных семей могут приходить в роевое состояние, однако, в результате применения простых противороевых приемов или при появлении медосбора переключаются вновь в рабочее состояние (Кривцов, Сокольский, 2001).
Карпатским пчелам свойственна хорошая зимостойкость (хотя они и менее зимостойки, чем среднерусские) и сравнительно высокой устойчивостью к падевому токсикозу, нозематозу, европейскому гнильцу.
Плодовитость карпатских маток довольно высокая, и в период интенсивного весеннего развития пчелиных семей доходит до 1800 яиц в сутки, расплод располагается плотно. Воскопродуктивность довольно высокая, по этому показателю карпатские пчелы уступают только пчелам итальянского и среднерусского подвидов, выход воска от семьи около 2,4 кг (Губин, 1983).
Некоторые из экстерьерных признаков определяющих подвидовую принадлежность, например кубитальный индекс карпатских пчел, являются предметом дискуссии, согласно последним данным, стандартизированный показатель 45,7 % является несколько завышенным, и наиболее характерная для данного подвида величина находится в интервале 43 до 33% (Гайдар, Керек, и др., 2012). Рабочие пчелы серого цвета, длина их хоботка - 6,3-7,0 мм, условная ширина третьего тергита - 4,8 мм, а масса в возрасте одного дня - в среднем, ПО мг. Средняя масса неплодных маток - 185 мг, а плодных - 205 мг (Пилипенко, 1969; Кривцов, Сокольский, 2001; Кривцов, Лебедев, и др., 2007).
Корректировка временных промежутков при пробоподготовке
Такой способ зимовки подразумевает длительный период подготовки, сбор запасов кормов, подготовку гнезда, физиологические и биохимические изменения в организме насекомых, дрейф генераций рабочих особей. Не смотря на непрерывную активность, годичный цикл пчелиной семьи можно разделить на 2 периода:
1. Период зимовки, {середина октября - вторая половина / конец апреля) или безоблетный период, включающий репродуктивную диапаузу, от последнего облета осенью и формирования зимнего клуба, до первого очистительного облета весной. Безоблетный период нельзя отождествлять с репродуктивной диапаузой, так как закладка весенней генерации происходит ранней весной, до первого облета (заканчивается репродуктивная диапауза).
2. Период летной активности, когда пчелы явно покидают гнездо, для сбора фуража, облета, роения и т.д. Период летной активности в свою очередь делят на определенные фазы связанные с событиями в жизни пчелиной семьи: а) Период закладки и выращивания весеннего поколения рабочих особей, которые будут обеспечивать фуражировочную деятельность и ульевые работы {начало апреля - середина мая). Этот этап в жизни колонии обеспечивает плавную смену физиологически изношенных рабочих пчел зимующей генерации, и подготовку к быстрому росту пчелиной семьи выведению большого количества расплода. б) Выведение большого количества рабочих особей для работы в период главного медосбора {середина мая - вторая половина июня ). Эти рабочие особи, как правило, испытывают наиболее сильную физиологическую нагрузку, и живут сравнительно недолго (Лаврехин, Панкова, 1983). в) Главный медосбор - определяющая фаза годичного цикла пчелиной семьи, особенно в северных шщ)отах(вторая половина июня - конец июля / начало августа). От эффективности работ в этот период зависят последующие этапы жизни колонии, ее численность, подготовка к следующей зимовке, закладка генерации рабочих пчел, участвующих в ней. Для медоносных пчел разных подвидов пик фуражировочной деятельности может приходиться на разные сроки, или может быть растянут во времени, в зависимости от флороспециализации. г) Комплексная подготовка к зимовке, анатомо-физиологические и биохимические изменения в организме пчел, подготовка гнезда, выведение зимующей генерации, гибель значительной части летних физиологически изношенных рабочих пчел, имаго и переход в состояние зимнего клуба (конец июля / начало августа - первая половина октября).
Очевидно, смена фаз годичного цикла не приурочена к конкретным датам, поскольку определяется погодно-климатическими условиями. В отдельные годы даты начала зимовки и перехода в состояние клуба, а также первого очистительного облета, как и других явлений в жизни пчел, могут существенно сдвигаться из-за возвратных оттепелей осенью и заморозков весной, характерных климату Пермского края. Кроме того, сезонные биоритмы пчел разных подвидов имеют некоторые характерные различия, по всей видимости закрепленные на генетическом уровне. В том числе это касается изучаемых А. т. carpathica и А. т. mellifera являющихся продуктами эволюционного процесса протекавшего в разных климатических условиях (Колбина, 2010).
На территории Пермского края в малоактивном состоянии пчелы проводят достаточно долго - около 6,5 - 7 месяцев.
В ходе зимовки уровень активности медоносных пчел может диагностироваться физическими методами (измерение температуры в гнезде), биохимическими (измерение активности ферментов) а также косвенно, физиологическими методами - установление сухой и сырой массы пчел, каловой нагрузки, и т.д.
По результатам ряда исследований, для изучаемых подвидов пчел сроки смены фаз годичного цикла отличаются, не смотря на то, что пчелиные семьи находятся в одинаковых условиях (Фрунзе, Петухов, Максимов, Алакина, 2008; Фрунзе, Петухов, 2009; Мурылев, 2012; Брандорф, 2014; Лаврский, Лебединский, 2011-2014; Любимов 2014). Кроме того, установлено, что в условиях Пермского края, пчелосемьи А. т. carpathica и А. т. mellifera в течение зимовки имеют разную динамику каловой нагрузки и разную температуру максимального переохлаждения (ТМП), что вызвано отличиями биохимических и физиологических адаптациях, и, вероятно связано с качеством запасаемых кормов (Мурылев, Петухов, Паршаков, 2010; Мурылёв, 2011; Мурылев, Петухов, 2011,2012).
Пчелы карпатского подвида в целом больше времени проводят в активном состоянии, чем среднерусские (Гончаров, 2003). Им свойственно использование даже слабых источников нектара, в том числе при неблагоприятных погодных условиях, что может приводить к потерям рабочих особей, так были зафиксированы вылеты при вылеты из гнезда при температуре воздуха 8С и даже 6С (Гайдар, Левченко 2003). Они раньше начинают выведение расплода ранней весной, по свидетельству некоторых авторов, уже в конце марта, когда семьи А. т. mellifera еще не активны, карпатские пчелы выходят из состояния репродуктивной диапаузы (Гончаров, 2003; Черевко, Аветисян, 2004,2007).
Кроме того, в условиях Пермского края для А. т. carpathica характерно более позднее образование зимнего клуба. Повышенная активность и уровень метаболизма в безоблетный период ведет к более интенсивному потреблению кормов, повышенной каловой нагрузке на толстую кишку {rectum), что приводит к опонашиванию, и, как следствие ослаблению или гибели пчелиных семей (Кашковский, 1972; Мурылев, Петухов, 2011). Эти особенности карпатских пчел, как одного из южных подвидов, подтверждаются результатами биохимических исследований, которые показывают корреляцию активности ферментов класса каталаз с каловой нагрузкой. В содержимом ректума в период зимовки размножаются микроорганизмы продуктами деятельности которых является пероксид водорода, - сильный клеточный яд, нейтрализуемый этими ферментами.
Годовые изменения вентрикулярного эпителия у Apis mellifera carpathica А
Для получения срезов использовался санный микротом «МС-2», а также ротационный «Ротмик-1». Методика изготовления препаратов соответствует общей (Афанасьев, Баланчук, и др., 1967; Буданцев, 2008). В зависимости от вида монтирующей среды последний этап может отличаться.
Серии срезов, снятые с микротома помещались на предметное стекло, с предварительно нанесенным тонким слоем белкового клея. После чего стекло нагревалось до расплавления парафина, в целях надёжного приклеивания срезов к стеклу. Дальнейшая обработка срезов направлена на удаление из них парафина, и замену его водой, т.е. обратный переход к полярному растворителю, так как окрашивание срезов производится водорастворимыми красителями. Последовательность этих действий приведена в таблице 8.
В основном использовались красители гематоксилин Эрлиха и эозин -стандартная методика гематоксилин-эозин, применяемая для морфологических исследования. Кроме того, производилось окрашивание по методике Браше, в этом случае для реакции красителя необходим промежуток времени около 18 часов (Пирс, 1962).
В ходе работы были изготовлены срезы различной толщины, и было выяснено, что для анализа наиболее пригодна толщина 10 мкм. Это связанно с тем, что эпителиальные клетки имеют большую вертикальную протяженность (до 35-40 мкм и более), и при этом могут сильно изгибаться. В случае малой толщины среза, на нем присутствуют только фрагменты клеточных элементов и часто не попадают ядра, необходимые для анализа, либо их значительная часть вымывается при обработке в связи с нарушением целостности клеток. Кроме того, затрудняется учет крипт, в связи с относительно крупными их размерами, они могут попадать на несколько срезов. В качестве монтирующей среды использовался бальзам, и синтетическая среда «Glasseal».
Срезы изготавливались в разных плоскостях, - в продольной и поперечной. Продольные срезы кишечников позволяют анализировать структуру крупных поперечных складок, на поперечных же срезах производилась основная часть измерений - подсчеты клеточных элементов и измерения толщины эпителия, диаметра ячеек крипт и т.д.
Для исследования одного кишечника пчелы, изготавливались тотальные серии препаратов. Средний и задний отделы кишечника, принадлежащие одному насекомому, извлекались, фиксировались, и полностью подвергались микротомированию с монтированием на серию стекол. Каждое стекло серии маркировалось датой взятия пробы, номером пчелиной семьи, и буквой в алфавитном порядке. Такая методика даёт возможность исследовать интересующие отделы в любом участке, при анализе, в таблицу вносится координата среза на препарате, а также номер стекла. Координата среза выражается десятичной дробью, целая часть -характеризует номер серии, а дробная - номер среза в серии. Таким образам по таблице, полученной в результате измерения можно восстановить форму кишечника или его участка, и положение любых интересующих объектов, видимых на срезе. Такая методика позволяет полностью восстановить размеры нарезанного образца, так как известна толщина срезов, их количество в серии и серий на каждом препарате.
Применялась методика дублирующих серий, она подразумевает изготовление небольших серий (по 3-5 срезов) и помещение их поочередно на стекла. В последствии один препарат окрашивается гематоксилином и эозином, а второй по методике Браше (Пирс, 1962).
В результате каждая серия срезов на одном препарате имеет дублирующую, где те же структуры окрашены другим красителем.
Данный способ использовался при исследовании так называемых крипт - крупных многоядерных структур конической формы, лежащих на базальной мембране эпителия (Snodgrass, 1956; Таранов, 1968 Заварзин, 1976, 1985) которые учитывались при дальнейшем анализе.
На начальных этапах варьировалась температура нарезки, в результате чего была подобрана оптимальная для данного парафина, соответствующая наименьшим деформациям. Для гистологического парафина с температурой плавления 50С оптимальной для микротомирования при толщине Юмкм была установлена температура 12С.