Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Морфофункциональные основы классификации клеточных элементов внутренней среды и системы циркуляции беспозвоночных животных 16
1.1.1. Общие принципы организации внутренней среды у беспозвоночных животньїхіб
1.1.2. Клеточные элементы системы циркуляции представителей типа Annelida 21
1.1.3. Гемоциты представителей типа Mollusca 29
1.1.4. Гемоциты представителей типа Arthropoda 36
1.2. Защитные реакции внутренней среды у беспозвоночных животных 44
1.2.1. Клеточные защитные реакции 45
1.2.2. Гуморальные защитные реакции 57
1.3. Осморегуляторные реакции внутренней среды и клеточных элементов системы циркуляции беспозвоночных животных 62
1.3.1. Регуляция объема и ионного состава внутренней среды в различных осмотических условиях 62
1.3.2. Регуляция объема гемоцитов и целомоцитов в различных осмотических условиях 67
ГЛАВА 2. Методология и методы исследования 73
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 96
3.1. Типология и морфофункциональные свойства гемоцитов и целомоцитов представителей типа annelida 96
3.1.1. Типология клеточных элементов циркулирующих жидкостей представителей типа Annelida 96
3.1.2. Морфофизиологические показатели ктнетоцитов в норме и при осмотической нагрузке 1 3.1.2.1. Морфометрические показатели и двигательная активность кинетоцитов в норме и при осмотической нагрузке 101
3.1.2.2. Показатели фагоцитарной активности кинетоцитов в норме и при осмотической нагрузке 107
3.1.2.3. Изменение объема и использование мембранного резерва кинетоцитами в условиях осмотической нагрузки 108
3.1.2.4. Энергетический статус кинетоцитов в условиях осмотической нагрузки
3.1.2.5. Упруго-эластические свойства поверхности кинетоцитов в условиях осмотической нагрузки 111
3.1.3. Морфофизиологические показатели адгезиоцитов в норме и при осмотической нагрузке 114
3.1.3.1. Морфометрические показатели и двигательная активность адгезиоцитов в норме и при осмотической нагрузке 114
3.1.3.2. Показатели фагоцитарной активности адгезиоцитов в норме и при осмотической нагрузке 119
3.1.3.3. Изменение объема и использование мембранного резерва адгезиоцитами в условиях осмотической нагрузки 121
3.1.3.4. Энергетический статус адгезиоцитов в условиях осмотической нагрузки 123
3.1.3.5. Упруго-эластические свойства поверхности адгезиоцитов в условиях осмотической нагрузки 124
3.1.4. Морфофизиологические показатели филоподиалъных амебоцитов в норме и при осмотической нагрузке 126
3.1.4.1. Морфометрические показатели и двигательная активность филоподиальных амебоцитов в норме и при осмотической нагрузке 126
3.1.4.2. Показатели фагоцитарной активности филоподиальных амебоцитов в норме и при осмотической нагрузке 130
3.1.4.3. Изменение объема и использование мембранного резерва филоподиальными амебоцитами в условиях осмотической нагрузки 132
3.1.4.4. Энергетический статус филоподиальных амебоцитов в условиях осмотической нагрузки 134
3.1.4.5. Упруго-эластические свойства поверхности филоподиальных амебоцитов в условиях осмотической нагрузки 135
3.1.5. Морфофизиологические показатели не фагоцитов в норме и при осмотической нагрузке 137
3.1.5.1. Морфометрические показатели и двигательная активность не фагоцитов в норме и при осмотической нагрузке 137
3.1.5.2. Изменение объема и использование мембранного резерва не фагоцитами в условиях осмотической нагрузки 141
3.1.5.3. Энергетический статус не фагоцитов в условиях осмотической нагрузки 142
3.1.5.4. Упруго-эластические свойства поверхности не фагоцитов в условиях осмотической нагрузки 143
3.1.6. Морфофизиологические показатели хлорагогенных клеток в норме и при осмотической нагрузке 145
3.1.6.1. Морфометрические показатели и двигательная активность хлорагогенных клеток в норме и при осмотической нагрузке 145
3.1.6.2. Изменение объема и использование мембранного резерва хлорагогенными клетками в условиях осмотической нагрузки 148
3.1.6.3. Упруго-эластические свойства поверхности хлорагогенных клеток в условиях осмотической нагрузки 150
3.1.7. Топография поверхности гемоцитов и целомоцитов в норме и в условиях осмотической нагрузки 151
3.2. Типология и морфофункциональные свойства гемоцитов представителей типа mollusca 173
3.2.1. Типология гемоцитов представителей типа Mollusca 173
3.2.2. Морфофизиологические показатели больших кинетофагоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 176
Ъ22.\. Морфометрические показатели и двигательная активность больших кинетофагоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 176
3.2.2.2. Показатели фагоцитарной активности больших кинетофагоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 180
3.2.2.3. Изменение объема и использование мембранного резерва большими кинетофагоцитами моллюсков в условиях осмотической нагрузки 181
3.2.2.4. Энергетический статус больших кинетофагоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 183
3.2.2.5. Упруго-эластические свойства поверхности больших кинетофагоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 184
3.2.3. Морфофизиологические показатели малых кинетофагоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 185
3.2.3.1. Морфометрические показатели и двигательная активность малых кинетофагоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 185
3.2.3.2. Изменение объема и использование мембранного резерва малыми кинетофагоцитами моллюсков в условиях осмотической нагрузки 188
3.2.3.3. Энергетический статус малых кинетофагоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 189 3.2.3.4. Упруго-эластические свойства поверхности малых кинетофагоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 190
3.2.4. Морфофизиологические показатели агрегатоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 191
3.2.4.1. Морфометрические показатели и двигательная активность агрегатоцитовв моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 191
3.2.4.2. Изменение объема и использование мембранного резерва агрегатоцитами моллюсков в условиях осмотической нагрузки 193
3.2.4.3. Энергетический статус агрегатоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 195
3.2.4.4. Упруго-эластические свойства поверхности агрегатоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 195
3.2.5. Морфофизиологические показатели прогемоцитов моллюсков в норме и при
осмотической нагрузке 197
3.2.5.1. Морфометрические показатели и двигательная активность прогемоцитов моллюсков в норме и при осмотической нагрузке 197
3.2.5.2. Изменение объема и использование мембранного резерва прогемоцитами моллюсков в условиях осмотической нагрузки 199
3.2.5.3. Энергетический статус прогемоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 200
3.2.5.4. Упруго-эластические свойства поверхности прогемоцитов моллюсков в условиях осмотической нагрузки 201
3.2.6. Топография поверхности гемоцитов моллюсков в норме и в условиях осмотической
нагрузки 202
3.3. Типология и морфофункциональньш свойства гемоцитов представителей типа arthropoda 218
3.3.1. Типология гемоцитов представителей типа Arthropoda 218
3.3.2. Морфофизиологические показатели амебоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке
3.3.2.1. Морфометрические показатели и двигательная активность амебоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 228
3.3.2.2. Показатели фагоцитарной активности амебоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 232
3.3.2.3. Изменение объема и использование мембранного резерва амебоцитами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 235
3.3.2.4. Энергетический статус амебоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 238
3.3.2.5. Упруго-эластические свойства поверхности амебоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 239
3.3.3. Морфофизиологические показатели гранулоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 241
3.3.3.1. Морфометрические показатели и двигательная активность гранулоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 241
3.3.3.2. Изменение объема и использование мембранного резерва гранулоцитами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 246
3.3.3.3. Энергетический статус гранулоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 249
3.3.3.4. Упруго-эластические свойства поверхности гранулоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 250
3.3.4. Морфофизиологические показатели прогемоцитов членистоногих в норме и при
осмотической нагрузке 253 3.3.4.1. Морфометрические показатели и двигательная активность прогемоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 253
3.3.4.2. Изменение объема и использование мембранного резерва прогемоцитами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 255
3.3.4.3. Энергетический статус прогемоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 256
3.3.4.4. Упруго-эластические свойства поверхности прогемоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 257
3.3.5. Морфофизиологические показатели агрегатоцитов членистоногих в норме и
при осмотической нагрузке 258
3.3.5.1. Морфометрические показатели и двигательная активность агрегатоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 258
3.3.5.2. Изменение объема и использование мембранного резерва агрегатоцитами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 262
3.3.5.3. Энергетический статус агрегатоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 264
3.3.5.4. Упруго-эластические свойства поверхности агрегатоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 265
3.3.6. Морфофизиологические показатели сферулоцитов членистоногих в норме и при
осмотической нагрузке 268
3.3.6.1. Морфометрические показатели и двигательная активность сферулоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 268
3.3.6.2. Изменение объема и использование мембранного резерва сферулоцитами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 270
3.3.6.3. Энергетический статус сферулоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 271
3.3.6.4. Упруго-эластические свойства поверхности сферулоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 272
3.3.7. Морфофизиологические показатели эноцитоидов членистоногих в норме и при
осмотической нагрузке 273
3.3.7.1. Морфометрические показатели и двигательная активность эноцитоидов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 273
3.3.7.2. Изменение объема и использование мембранного резерва эноцитоидами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 275
3.3.7.3. Энергетический статус эноцитоидов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 276
3.3.7.4. Упруго-эластические свойства поверхности эноцитоидов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 277
3.3.8. Морфофизиологические показатели веретеновидних клеток членистоногих в
норме и при осмотической нагрузке 278
3.3.8.1. Морфометрические показатели и двигательная активность веретеновидных клеток членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 278
3.3.8.2. Изменение объема и использование мембранного резерва веретеновидными клетками членистоногих в условиях осмотической нагрузки 282
3.3.8.3. Энергетический статус веретеновидных клеток членистоногих в условиях осмотической нагрузки 284
3.3.8.4. Упруго-эластические свойства поверхности веретеновидных клеток членистоногих в условиях осмотической нагрузки 285
3.3.9. Морфофизиологические показатели коагулоцитов членистоногих в норме и при
осмотической нагрузке 287
3.3.9.1. Морфометрические показатели и двигательная активность коагулоцитов
членистоногих в норме и при осмотической нагрузке 287 3.3.9.2. Изменение объема и использование мембранного резерва коагулоцитами членистоногих в условиях осмотической нагрузки 288
3.3.9.3. Энергетический статус коагулоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 289
3.3.9.4. Упруго-эластические свойства поверхности коагулоцитов членистоногих в условиях осмотической нагрузки 290
3.3.10. Топография поверхности гемоцитов членистоногих в норме и в условиях осмотической нагрузки 291
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 294
Выводы 322
Практические рекомендации 324
Список сокращений 325
Список литературы
- Клеточные элементы системы циркуляции представителей типа Annelida
- Типология клеточных элементов циркулирующих жидкостей представителей типа Annelida
- Морфофизиологические показатели гранулоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке
- Энергетический статус веретеновидных клеток членистоногих в условиях осмотической нагрузки
Клеточные элементы системы циркуляции представителей типа Annelida
Кровь у многощетинковых червей Paraonidae имеет красный или красновато-желтый цвет, лишена форменных элементов (Стрельцов В.Е., 1973) и выполняет как питательную, так и дыхательную функции (Ушаков П.В., 1955). Кровь Phyllodocemorpha (так же как у афродитид, глицерид и Syllidae) бесцветная и выполняет, в основном, трофические функции (Ушаков П.В., 1955, 1972, 1982). У остальных полихет кровь содержит гемоглобин и окрашена в красный цвет, а у некоторых (Serpulimorpha, Ampharetidae и Chloraemidae) - хлоркруорин и имеет зеленый цвет (Крепе Е.М., 2007; Озер-нюк Н.Д., 2006; Проссер Л., 1977; Ушаков П.В., 1955; Bonaventura J., Bona-ventura С, 1980; Bonaventura J., Wood S.C., 1980). У представителей Magelona papillicornis обнаружен гемэритрин, содержащий в пять раз больше железа, чем в гемоглобине (Житенева Л.Д., 2001). У нереид целомическая жидкость функционирует в качестве гидростатического скелета, участвуя также в дыхании и распределении питательных веществ (Хлебович В.В., 1996). Гемолимфа полихет сравнительно бедна клеточными элементами (Беклемишев В.Н., 1964). Целомическая жидкость у полихет содержит различные клеточные образования - фагоциты, лейкоциты, лимфоциты, элеоциты (Ушаков П.В., 1955).
Кровь у олигохет красная. Красный цвет крови у дождевых червей обусловлен наличием гемокруорина - вещества, очень близкого к гемоглобину крови позвоночных животных, но результаты ряда исследований свидетельствуют, что дыхательным пигментом олигохет является гемоглобин (Алякринская И.О., 1979; Вызова Ю.Б., 1972, 2007; Крепе Е.М., 2007; Bachega J.F.R. et al., 2011; Byzova Ju.B, 1974, 1975; Vinogradov S.N. et al., 1977, 1980, 1991). У червей гемокруорин содержится не в форменных элементах, а рас 22 творен в плазме (Чекановская О.В., 1960; Bachega J.F.R. et al., 2011), у Aelosomatidae, некоторых Naididae (Chaetogaster) и почти у всех Enchytraeidae кровь бесцветна, у большинства Naididae желтая (Чекановская О.В., 1962). Окраска крови обусловлена растворенным в ее плазме пигментом, очень близким к гемоглобину (Mendes E.G. et al., 1951). У представителей олигохет в крови встречаются только несколько типов бесцветных клеток аналогичных таковым клеткам крови у позвоночных (Чекановская О.В., 1960). В крови дождевых червей содержатся малые фагоциты, которые являются камбиальными клетками, за счет которых происходит возобновление в ходе онтогенеза животного других типов амебоцитов и всех клеточных элементов, населяющих опорную ткань (Беклемишев В.Н., 1964).
Целомическая жидкость олигохет может быть прозрачной, опалесци-рующей или желтоватой; тот или иной оттенок ее обусловлен присутствием разных количеств хлорагоцитов, капель жира и микробов (Чекановская О.В., 1962). Целомическая жидкость у отдельных видов олигохет ярко желтого цвета. У одного из представителей видов Lumbricidae (Eisenia submontana) полостная жидкость обладает способностью к свечению в темноте (Перель Т.С., 1979). В полости тела олигохет находятся крупные или мелкие целомо-циты (Семерной В.П., 2004).
В целомической жидкости олигохет обязательно содержатся целомоци-ты. Они могут быть разных типов у одного и того же червя и имеют разное строение в разных семействах олигохет. Основной формой целомоцитов являются амебоциты, способные к фагоцитозу. Для наидид характерны довольно крупные зернистые целомоциты с постоянной округлой формой. Они же типичны для некоторых родов тубифицид; у других тубифицид они заменены очень мелкими амебоидными клетками. На этом различии основывается разделение тубифицид на подсемейства. У энхитреид, кроме амебоидных и зернистых целомоцитов, имеются линоциты - плоские клетки с крупной вакуолью, содержимое которой превращается при соприкосновении с инородными телами в клубок нитей из желеобразного вещества. В этом семействе известны также безъядерные целомоциты. Для многих олигохет (особенно для почвенных) характерны элеоциты - целомоциты с гранулами жира (Че-кановскаяО.В., 1962).
При загрязнении почвы нефтепродуктами в гемолимфе дождевых червей встречаются двуядерные амебоциты. Такие амебоциты обычно представлены двумя типами: а) оба ядра в клетке имеют нормальную форму, б) одно ядро - нормальной формы, другое измененное. Такие явления могут быть результатом разных событий. Один вариант - это прерванный цикл митоза, так как митотическое деление, сочетающееся с задержкой цитокинеза, приводит к образованию клеток с множеством ядер. Второй процесс - это образование двуядерности при слиянии двух клеток (Козлов КС, 2003).
Существуют разные методологические подходы к способам типологи-зации циркулирующих клеток аннелид. Преимущественно при описании ге-моцитов и целомоцитов применяют морфологические, функциональные или иммунные критерии (Пигалева Т.А., 2015).
Учитывая существенную полиморфность клеток, у кольчатых червей выделяют две основные группы целомоцитов - амебоциты и элеоциты (Крепе Е.М., 1983; Stein Е.А., Cooper E.L., 1983а).
Амебоциты - это мобильные клетки, которые содержат разное число гранул и способны к осуществлению фагоцитоза (Крепе Е.М., 1983). Аграну-лярные или гиалиновые амебоциты дождевых червей варьируют по размерам от небольших форм (5-8дт) с малым объемом цитоплазмы и низкими значениями нуклеоцитоплазматического отношения, до больших клеток (30 дт в диаметре) с цитоплазмой. Гранулярные амебоциты различаются по размерам и численности, в зависимости от видовой принадлежности кольчатых червей. При этом абсолютно преобладают ацидофильные гранулы, но функции их пока не ясны. Представители некоторых видов олигохет содержат две субпопуляции гранулярных амебоцитов. Преобладающий тип гемоцитов называют «линоциты» или «лампроциты» (позднее получили название «мукоциты») (Hess R.T., 1970). Такие клетки не принимают непосредственного участия в сопровождении воспалительного процесса, их главной функцией является трофическая. У полихет, также как и олигохет, выявлены гиалиновые и гранулярные амебоциты. Морфологические особенности амебоцитов, также как и их относительное число, существенно отличаются у разных представителей аннелид (Dales R.P., Dixon L.R.J., 1981). Форма амебоцитов преимущественно овальная или круглая, но встречаются также и веретенообразные клетки (Baskin D.G., 1974; Dales R.P., Dixon L.R.J., 1981). Гранулоциты заполнены ограниченными мембраной электронно-плотными гранулами, которые Baskin (1974) идентифицировал как лизосомы. У пиявок амебоидные клетки небольшие (6-Ю дт в диаметре) в сравнении с остальными кольчатыми червями, но эти клетки менее изучены, чем у полихет и олигохет (Пигалева Т.А., 2015).
Типология клеточных элементов циркулирующих жидкостей представителей типа Annelida
Отобранную у животных гемолимфу или целомическую жидкость делили на четыре пробы (для представителей аннелид и моллюсков) и три пробы (для представителей членистоногих) по 20 мкл в каждой. К первой пробе добавляли 20 мкл изотонического раствора, ко второй - 20 мкл гипотонического раствора, к третьей - 20 мкл гипертонического раствора. Четвертую пробу у представителей аннелид и моллюсков анализировали без добавления растворов.
По истечении 30 мин инкубации осуществляли регистрацию изображений клеток с использованием программного приложения NIS-Elements (Nikon) инвертированного светового микроскопа Nikon Eclipse Ti-E. Анализ полученных изображений осуществляли при использовании комплекса аппаратно-программной визуализации морфологических препаратов, анализа и регистрации оптических и морфологических показателей «ВидеоТест-Размер 5.0» (Санкт-Петербург, Россия). На изображениях измеряли габаритные размеры клеток и ядер. Одновременно проводили исследование клеток с использованием атомно-силового микроскопа Интегра Вита NT-MDT с получением данных о размерах клеток в трёх измерениях.
При определении геометрических показателей клеток при помощи метода световой микроскопии допускали, что клетки характеризуются правильной сферической формой и осуществляли расчет объёма поверхности клеток по формулам для шара (Выгодский М.Я., 2006): V =(4/3)-(7r-R3), (3) где У- объём шара (дт3); ж - число пи; R - радиус клетки, равный половине диаметра (дт).
При изучении морфометрических показателей клеток методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии вычисляли площадь клеточной поверхности путём сложения площади кривой поверхности шарового сегмента (Выгодский М.Я., 2006) и площади его основания, представляющего собой проекцию клетки на подложку: S = 2-%-R-h + S , (4) где S - площадь поверхности клетки (цт2); S - площадь проекции клетки на подложку (цт2); ж - число пи; R - радиус клетки, равный половине диаметра (цт); h - высота клетки (шарового сегмента) (цт) (Зубарева Е.В., 2011).
При исследовании характеристик клеток членистоногих методом световой микроскопии допускали, что гемоциты имеют форму неравностороннего эллипсоида, поэтому осуществляли измерение большой, средней и малой осей. Применяя значения указанных линейных размеров, осуществляли расчет площади клеточной поверхности и объёма клеток по следующим формулам (Трасатти С, Петрий О.А., 1993): і S = 4л[(аРЪр+арср+Ърср)/3]Р, (5) где S - площадь поверхности гемоцита (цт2); а - большая полуось, т.е. S длины (цт); Ъ - малая полуось, т.е. S высоты (цт); с - средняя полуось, т.е. S ширины (цт); р=1,6015 - коэффициент К. Томсена; V=4/3(pabc), (6) где У- объём (цт3); а - большая полуось, т.е. S длины (цт); Ъ - малая полуось, т.е. S высоты (цт); с - средняя полуось, т.е. S ширины (цт). Используя значения площади поверхности, осуществляли оценку резервных возможностей мембраны целомоцитов и гемоцитов аннелид и моллюсков (СкоркинаМЮ., 2014): MR = —, (7) V где MR - абсолютный мембранный резерв (цт1); S - площадь поверхности клетки в аутологичной плазме (цт2), У- объем клетки в аутологичной плазме (цт3). Относительный мембранный резерв рассчитывали у клеток, помещенных в гипотоническую среду (Скоркина М.Ю., 2014): MR = - , (8) где MR - относительный мембранный резерв (цт1); Syz/m - площадь поверхности клеток в умеренно-гипотоническом / изотоническом растворе NaCl (um2), Sp - площадь поверхности клеток в аутологичной плазме (um2), Vp -объем клеток в аутологичной плазме (um3).
В связи с тем, что у представителей членистоногих объем плазмы в гемолимфе невелик, расчет показателя мембранного резерва осуществляли с использованием следующей формулы (Орлов С.Н. Новиков КН., 1996): AS = S(Cr)-S(M), (9) где AS - резерв плазматической мембраны (um2); S(CT) - площадь поверхности клетки, после инкубации в сильно гипотонической среде (um 2); S(M) -площадь поверхности клетки, после инкубации в изотонической среде (um2).
Для сравнения использования мембранного резерва клетками членистоногих разных видов определяли долю используемого мембранного резерва (MR) с использованием формулы (Орлов С.Н., Новиков КН.., 1996): MR = (AS/ S(Cr))100 %, (10) где MR - доля используемого мембранного резерва (%); AS - резерв плазматической мембраны (um2); S(CT) - площадь поверхности клетки, после инкубации в сильно гипотонической среде (um2). Интенсивность использования относительного мембранного резерва клетками в гипотонической среде оценивали, вычисляя процент относительного мембранного резерва, используемого клеткой от абсолютного мембранного резерва, принимаемого за 100% (Скоркина М.Ю., 2014). Определяли ядерно-цитоплазматический индекс как отношение площади ядра к площади поверхности клетки: JIIJH=SH/SK, (11) где Бя - площадь ядра клетки; SK - площадь поверхности клетки.
Морфофизиологические показатели гранулоцитов членистоногих в норме и при осмотической нагрузке
Клетки внутренней среды представителей типа Annelida циркулируют в сосудистой системе или населяют гемоцель. Когда они находятся в целоме, который отделен от кровеносных сосудов, их называют целомоцитам. Цело-моциты представляют собой лейкоциты, за исключением таких случаев, как у морского кольчатого червя Glycera, у которого среди целомоцитов есть и эритроциты. Терминология в данном вопросе не устоялась, и поэтому важно дать четкие функциональные определения. Термин лейкоцит используется для всех белых клеток крови позвоночных и беспозвоночных животных, а эритроцит - для красных клеток крови. Лейкоциты беспозвоночных и позвоночных животных чаще всего классифицируют по морфологическим признакам (Купер Э., 1980). До последнего времени не появилось единой схемы, приложимой к многочисленным гемоцитам и целомоцитам беспозвоночных животных.
Представители типа Annelida, подобно другим целомическим беспозвоночным, имеют в полости тела многочисленные дифференцированные клетки. Клеточный иммунитет у целомических животных встречается достаточно часто. У всех целомических животных имеются зернистые и незернистые мононуклеарные лейкоциты, принимающие участие в фагоцитозе, причем фагоцитоз - не единственная функция этих клеток. У дождевых червей целомоциты происходят из внебрюшинного эндотелия, что позволяет отнести их к ретикуло-эндотелиальной системе (Купер Э., 1980).
Клеточные популяции циркулирующих жидкостей представителей типа Annelida характеризуются существенной неоднородностью. При осуществлении типологизации форменных элементов учитывали уже существующее деление их на группы, но основным критерием выбран функциональный. Морфологические показатели не могут быть достоверными критериями классификации клеток крови и целомической жидкости, так как значительно варьируют у клеток одного и того же типа среди представителей различных видов.
Для представителей всех исследованных видов характерно наличие двух основных классов целомоцитов и гемоцитов - это амебоидные клетки, или амебоциты, выполняющие иммунную функцию, и элеоциты, участвующие в накоплении и хранении питательных веществ (Купер Э., 1980; Lieb-mann Е., 1942, 1946; Stein Е.А., Cooper E.L., 1983а). Абсолютное большинство изученных видов аннелид среди клеточных элементов внутренней среды содержат различные классы амебоцитов, обладающих разными показателями активности, адгезионной и поглотительной способности. Характерным является наличие нескольких типов элеоцитов, отличающихся количественными и качественными показателями гранул и вакуолей. Важной клеточной составляющей крови и целомической жидкости представителей типа Annelida являются хлорагогенные клетки и хлорагогенные гранулы. Хлорагогенные клетки не способны к фагоцитозу, но являются частью ткани, облегающей кишечник. Так называемые лимфатические железы, откуда происходят цело-моциты, погружены в эту ткань (Купер Э., 1980). На основе сказанного выше и осуществленных исследований, составлена единая классификация клеточных элементов циркулирующих жидкостей представителей типа Annelida.
Тип клетки (по Stein Е.А., Cooper E.L., 1983): амебоцит. Функциональные подтипы (по Пигалева Т.А., Присный А.А., 2011b; Пигалева Т.А., 2015; Присный А.А., 2012; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2012; Присный А.А., 2014; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015): 1) кинетоцит («большой амебоцит» (Пигалева Т.А., 2015; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015)) (КТ) - большая, подвижная клетка, в цитоплазме содержатся вакуоли и гранулы; клетки этого типа способны активно перемещаться в целомической жидкости, не адгезируют к подложке, способны к фагоцитозу; 2) адгезиоцит («средний амебоцит» (Пигалева Т.А., 2015; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015)) (АГ) - клетка, способная к адгезии к подложке и движению, в цитоплазме содержатся гранулы и вакуоли, способна к фагоци тозу; 3) филоподиальный амебоцит («малый амебоцит» (Пигалева Т.А., 2015; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015)) (ФА) - небольшая клетка, способная к образованию филоподий, к адгезии не способна, фагоцитоз не зафиксирован. Тип клетки (по Stein Е.А., Cooper E.L., 1983): элеоцит. Функциональные подтипы (по Пигалева Т.А., Присный А.А., 2011b; Пигалева Т.А, 2015; Присный А.А., 2012; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2012; Присный А.А., 2014; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015): 1) не фагоцит («не амебоцит» (Пигалева Т.А., 2015; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015)) (НФ) - клетка с четкими краями, не способна к движению, адгезии и фагоцитозу, цитоплазма заполнена некоторым количеством гранул; 2) хлорагогенная клетка (Пигалева Т.А., 2015; Присный А.А., Пигалева Т.А., 2015) (ХЛ) - крупная клетка, цитоплазма заполнена большим количеством бурых гранул, клетка нестабильна, способна к саморазрушению, встречаются две разновидности - способные образовывать филоподий и вообще не образующие ложноножки. Хлорагогенные клетки обнаружены только в целомической жидкости представителей подкласса Oligochaeta.
Соотношение численности гемоцитов разных типов у представителей подкласса Hiradinimorpha представлено на рисунке 10.
КТ и АГ выявлены у всех изученных представителей подкласса Hiradinimorpha. Количество КТ колеблется в пределах 16-19 % от общей численности гемоцитов. АГ, выполняющие функцию фагоцитоза, являются преобладающим типом клеток в крови Н. medicinalis. ФА отмечены только у Н. sanguisuga и Е. octoculata и составляют значительную часть популяции гемоцитов. Гемоциты, не относящиеся к амебоцитам, обнаружены только у Я. medicinalis и Е. octoculata. При этом элеоциты Е. octoculata морфологически напоминают хлорагогенные клетки олигохет. У Н. medicinalis гранулы элео-цитов морфологически отличаются от хлорагогенных.
Соотношение численности целомоцитов разных типов у представителей подкласса Oligochaeta представлено на рисунке 11. Пять типов целомоцитов обнаружены у представителей всех изученных видов олигохет, кроме Е. nordenskioldi. У червей данного вида выявлены только три типа целомоцитов: КТ, АГ и ФА. У всех изученных олигохет три типа амебоцитов по своей численности преобладают над элеоцитами. Из амебоцитов наибольшее количество в це-ломической жидкости отмечено АГ и ФА. Целомоциты, принадлежащие к группе КТ по численности почти всегда находятся на третьей позиции. Среди элеоцитов у представителей рода Eisenia всегда (за исключением Е. nordenskioldi) преобладают ХЛ, а у представителей рода Lumbricus - чаще НФ.
Энергетический статус веретеновидных клеток членистоногих в условиях осмотической нагрузки
Использование методов атомно-силовой микроскопии позволяет оценить изменение показателей упругости мембраны (табл. 16) и силу адгезии (табл. 17) АГ к нанозонду в условиях осмотической нагрузки.
Определены параметры упругостных свойств АГ Е. octoculata в условиях измененной осмотичности раствора. При воздействии на гемоциты ги-поосмотической нагрузки жесткость мембраны клеток увеличивается. Сила адгезии к нанозонду мембраны АГ увеличивается в гипотонической среде и снижается в гипертонической. У АГ Е. rosea значения показателя упругости мембраны широко варьируют, как в пределах одной клетки, так и среди различных целомоцитов. Наивысший показатель силы адгезии зафиксирован у амебоидных клеток, у которых отмечена и наибольшая жесткость клеточной мембраны.
В результате проведенных исследований можно отметить высокий показатель силы адгезии и жесткости клеточной мембраны СА Е. fetida. Сила адгезии мембраны клеток к нанозонду снижается при воздействии осмотической нагрузки. Для С А Е. nordenskioldi характерны высокие показатели жесткости мембраны. У целомоцитов Е. tetraedra отметили высокий показатель упругости и адгезии клеточной мембраны к зонду. В условиях гипертонической и гипотонической нагрузки выявлено снижение значений модуля упругости плазмалеммы целомоцитов L. terrestris.
При инкубации в гипоосмотических условиях установлено увеличение размеров и объема целомоцитов L. castaneus. Жесткость клеточной мембраны уменьшается в гипотонии и существенно снижается в гипертоническом растворе, сила адгезии мембраны к нанозонду также падает при осмотической нагрузке. - статистически достоверные различия между значениями параметров в изотонических условиях и в условиях осмотической нагрузки по t-критерию Стьюдента при р 0,05. В целом для гиперосмотической нагрузки характерно уменьшение значений модуля Юнга. В гипотоническом растворе, по сравнению с изотоническим, повышается упругость АГ, что, возможно, связано с увеличением активности этих клеток.
В гипотонических условиях наблюдали изменение активности целомо-цитов О. complanatum. Более сложное строение приобретает микрорельеф клеток. Значения упругости целомоцитов увеличиваются при любом изменении осмотического давления. Сила адгезии клеток к нанозонду в условиях осмотической нагрузки не меняется.
Морфометрические показатели и двигательная активность филоподи-альных амебоцитов в норме и при осмотической нагрузке ФА - клетки округлой формы размером от 2 до 7 дт (табл. 18). Ядро большое, располагается центрально. Цитоплазма характеризуется гомогенностью, в ней отсутствуют вакуоли и гранулы. Клетки не осуществляют актив 127 ного перемещения, формируют 1-2 длинные филоподии, не адгезируют к стеклу. ФА не обнаружены у Я medicinalis. ФА Е. octoculata после инкубации в гипотонических условиях увеличиваются в объеме, округляются и теряют способность образовывать псевдоподии. При повышении осмотичности раствора установлено уменьшение линейных размеров ФА на 33 %. Клетки сохраняют способность образовывать ложноножки, часто отмечают выпячивание 1-2 филоподии.
ФА Я sanguisuga - круглые клетки, линейные размеры которых существенно варьируют. ФА формируют филоподии, достигающие до 6 цт в длину. Гемоциты этого типа могут активно передвигаться, за счет деятельности псевдоподий. ФА не адгезируют к стеклу. В условиях гипотонии происходит формирование мембранных складок, занимающих как дорсальное, так и латеральное положение. Некоторые гемоциты распластываются на субстрате и образуют циркулярную ламеллоплазму. Гиперосмотическая нагрузка приводит к снижению двигательной активности гемоцитов. Клетки становятся угловатыми, происходит вакуолизация цитоплазмы.
ФА Е. rosea - клетки, ядро которых расположено по центру. ФА способны адгезировать к подложке, формируя при этом множество коротких филоподии. В прозрачной цитоплазме ФА содержится 2-4 небольшие вакуоли. Целомоциты этого типа могут объединяться в агрегаты, которые состоят из 5-20 клеток. При снижении осмотического давления поверхность ФА равномерно покрывают короткие филоподии. Отдельные клетки адгезируют к субстрату. В условиях гиперосмотической нагрузки амебоциты приобретают неправильную форму, мембрана формирует небольшие выпячивания нерегулярной формы.