Введение к работе
Актуальность темы. Начало искусственного осеменения было положено в СССР русским биологом И.И.Ивановым, который в 1907 г. описал получение потомства от искусственно осемененных лошадей. Его ученик В.К.Милованов развил широкие научные исследования и вместе с коллективом советских ученых разработал на этой основе технологи» искусственного осеменения сельскохозяйственных животных всех видов.
Открытие В.К.Миловаловым, И.И.Соколовской и И.В.Смирновым возможности сохранения генетического потенциала и биологической полноценности замороженного семени млекопитающих, внесенное в реестр открытий СССР эа Р 103, нашло широчайшее применение в животноводстве вообще, и в частности в скотоводстве, и стало основой современной технологии искусственного осеменения.
Эта технология стала характерной чертой современной зоотехнии и получила большое практическое распространение во многих странах в целях линейной и крупномасштабной селекции.
Искусственное осеменение может стать и станет мощным рычагом быстрого развития высокопродуктивного животноводства а республике Мали. Эта аграрная западно-африканская страна занимает площадь 1,2 млн.кв. км. и белее 40 валового национального дохода ее составляет животноводство. Таким образом, эта отрасль хозяйства имеет существенное значение в экономике страны. До настоящего времени животноводство Республики Мали характеризуется экстенсивным способом ведения.
В стране насчитывается около 5 млн. крупного рогатого скота и около 14 млн. овец и коз. Продуктивность местного крупного рогатого скота варьирует Ст 800,до 2500- кг молока в год на корову. Масса
тела местного скота составляет всего от 100 до 250 кг. Правитель-
— t -
Г-'.-'* -v . ;: { . . , t
ство Республики Маля приняло решение о всемерном развитии животноводства и ускоренном повышении продуктивности молочного и мясного скота, а также овец и коз.
Цель и задачи исследований. Дня достижения поставленной цели наибольшую перспективу имеет внедрение в Республике Мали искусственного осеменения, что позволит ускоренным темпом повысить породность животных путем широкого использования ценного генетического потенциала лучших племенных производителей выдающихся по продуктивности пород при параллельном развитии кормовой базы, а также значительно увеличит их продуктивность. На примере СССР видно,что разработка биологически обоснованных методов и широкое внедрение искусственного осеменения, организация крупных центров по накоплению и распределению семени выдающихся самцов-производителей,а также учету результатов осеменения дали возможность в краткие сроки поднять продуктивность скотоводства путем улучшения имеющихся и создания новых высокопродуктивных отечественных пород.
Для развития искусственного осеменения в Республике Мали должны быть решены вопросы наиболее приемлемого состава среды для хранения семени и степени его разбавления; методах замораживания и оттаивания; способах осеменения хоров; наборах инструментов для этих целей, а также о методах выявления стельности в ранние периоды после осеменения. Исследования а этих направлениях представляют материалы данной диссертации.
Научная новизна. 6 результате проведенных и описанных в данной диссертации исследований нами предложен новый, биологически обоснованный, технологически рациональный эффективный комплекс приемов искусственного осеменения коров и телок. Он включает: усовершенствование протектора для разбавления семени быков введением в его
состав более эффективных и дешевых компонентов, а также тотального
— 2 —
препарата задней доли гипофиза для активации сокращения матки; замораживание семени быка в соломинках, с частичным использованием БайсогальскоЙ технологии, в сконструированной нами специальной ванне; модернизацию визоцервикального метода осеменения с использованием светодроводного расширителя и изготовленных нами гели-коидных наконечников нашей конструкции; оттаивание семени в аэродинамическом оттаиаателе; стерилизации инструментов в ультрафиолетовых лучах в сконструированном нами портативном устройстве и применение в условиях промышленной фермы иммунологического метода раннего определения стельности по реакции нормальной сыворотки крови исследуемых коров с ксеногенными эритроцитами, нагруженными эмбриональным антигеном.
Практическая ценность проведенной работы состоят в усовершенствовании и одновременном удешевлении технологии искусственного осеменения; в замене дефицитных материалов дешевыми и доступными; в повышении гигиеничности и общей культуры труда. В частности» предлагаемая модернизация комплекса приемов и методов единственно приемлема для 'внедрения искусственного осеменения в Республике Мали с целью ускорить повышение породности и продуктивности скота. Особенно большое практическое значение при этом имеет модернизованный визоцервикальный метод» как единый для коров и телок и высоко результативный.
Реализация результатов исследования. Разработанный нами модернизованный комплекс приемов искусственного осеменения использован в совхозах "Путь Ильича" Подольского района Московской области, "Задивсний" Октябрьского района Волгоградской области, а также частично в Центре зоотехнических "исследований в городе Нионо /Республика Мали/ в опытах по искусственному осеменению телок.
~ 3 —
Апробация работы. Материалы диосертации доложена и обсуждены;
1/ на 32 к 33-й научных конференциях аопнраятов ВИКа /Дубро-вжав, 1979, 1980 гг./;
2/ на I Международном симпозиуме молодых ученых по иммунологии в София /Болгария/, 1979 г.;
3/ на П Всесоюзном симпозиуме по иммунологии воспроизведения, Москва, I960 г.і
4/ на научной конференции отдела биология воопроиаведеяжя н нскусствеявого осеменения сельскохозяйственных животных ВИЕа, 1981 г.
Объем раЗоты. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов собственных исследований, обсуждении результатов, выводов и практических предложений. Текст диссертации написан на русском языке объеиом 147 страниц машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами, 24 рисунками и фотографиями. Список использованной литературы вкяючает 278 источников, в том числе 184 на русском ж 94 на французском или английском язиках.
Материал и методика
Лабораторные исследования по теме проведены в Отделе биологии воспроизведения ВИКа на базе Лаборатории зоотехнической иммунологии; а полевые исследования в 1979-1980 гг. в двух совхозах: "Заливокид" Октябрьского района Волгоградской области и "Дуть Ильича" Подольского района Московской области. Всего в опыте было 933 коровы и телки.
для взятия семеня использовали быков Центральной станции искусственного осеменения Всесоюзного научно-производственного объединения МСХ СССР /пос. Виково Подольского района Московской об-
— 4 —
ласти/. Семя брали у быков по установленному на ЦСИО режиму 3 раза в течение каждых двух недель по 3 эякулята в день взятия. Изучали объем, концентрацию и подвижность живчиков, а также состояние акре— сом анрсскопическиы методом /по Й.И,СоколовсиоЯ/.
Усовершенствование протектора для разбавления семена быка
За основу протектора мы взяли в качестве неэлектролита сахарозу, а в качестве солевого компонента комплексную натрий-кальциевую соль ЭДТА. С целью улучшать условия миграции живчиков в тдовых путях коров при употреблении визоцервикального метода мы выяснила эффективную дозу оухого тотального препарата задней доли гипофиза /"адиурекрин"/. обеспечивающую максимальную переживаемоеть оемени после оттаивания*.
Для проведения опыта заранее готовили исходную среду, воторая служила также контролем* В среду того же состава добавляли адиу-рэкрий в развои концентрации. Дня итого ставили ряд .из 6 пробирок* в пробирку X внесли 10 ил среды исходного состава о добавлением в нее 100 мг препарата задней доли гипофиза. В остальные 5 пробирок влили по 5 мл походной среды. Затем в пробирку 2 внесли 5 мл из пробирки I и тщательно перемешали; в пробирку 3 внесла 5 мл из пробирки 2 и т.д. Пробирка 6 служила контролем. Таким образом, путем последовательного разведения мы получили 10; 5; 2,5; 1,25; 0,6 мг адиурекриаа на 1,0 мл среды. Наядой порцией ореды разбавляли в 10 раз по 0,5 мл сважевзятого семени быка: Одну серию лро-биро» сразу же поместили в термостат ври 39С, из второй аналогичной серии пробирок разбавленное семя того же быка рас фаоовыаали в Соломина», замораживали, используя елементи Байсогальекой технологии над поверхностью жидкого азота в его газообразной фазе,
_ 5 —
затем оттаивали при 40С. помещали в пробирки, инкубировали в термостате при 39. Результаты оценивали по абсолютному показателю выживаемости вне организма / S/, подвижности живчиков и состоянию их акросом акроскошчесхим методом. В опыте и контроле использовали всегда одни и те же эякулята.
Для оценки качества семени акроскопнческим методом семя разбавляли 10%-нш раствором стерильной, автоклавироваыной желатины /для инъекций/ в отношении 1:1, каплю семени помещали на предметное стекло, накрывали покровным и исследовали в микроскопе Jffibf-II, используя конденсор ОИ-Ю. Подсчитывали по 200 живчиков на образец семени, регистрируя порознь целые и поврежденные акросомы. Целыми считали акросомы с четким ярко светящимся контуром головки.
Долгосрочное хранение семени
Замораживание семени
Для этого опыта соломинки вместимостью 0,25 мл были любезно предоставлены нам профессором И.П.Пакенас. Определяли объем эякулята, подвижность живчиков и при помощи ФЭК - концентрацию. Семя разбавляли модифицированным нами протектором.
Приготовление протектора, разбавление и расфасовку семени проводили в стерильных условиях операционного зала в Лаборатории зоотехнической иммунологии воспроизведения Отдела биологии воспроизведения ВШа.
Для оптимизации процедуры замораживания нами совместно с Ю.Н.Трофимовым была сконструирована стальная прямоугольная ванна для замораживания семени. С наружной стороны по краям дна ванны для улучшения теплообмена были прикреплены бруски пенопласта. Внутрь ванны вставлен был специальный держатель, позволящий регулировать расстояние между медной пластиной для замораживания семени и поверхностью жидкого азота.
После 4-часовой выдержки соломинки вынимали ив холодильника н быстро помешали их на медный щит, расположенный в 3-4 см от поверхности жидкого азота. Ванну закрывали крышкой ж регистрировали время. Ровно через пять минут соломинки быстро опускали в жидкий азот, отвинчивая держатель. Затем соломивкж о замороженным семенем попето в марлевые мешочки и погружали в сосуд Дыоара, заполненный азотом.
Оттаивание замороженного семени
Свежевзятое семя разбавляли модифицированным и исходным /контроль/ протекторами в соотношении 1:10, выдергивали при температуре +4С в течение 4 часов, ааморахивали и через сутки оттаивали каждый вариант при 40С двумя способами: аэродинамическим /по Соколовской И.И./ ж гидростатическим. Эффективность определяли ш подвижности я выживаемости живчиков, оттаянных обоими методами, а также го сохранности герметизации, удобству работы и по результатам осеменения, независимо от примененного для введення семеяи метода*
Модернизация визоцервикальюго метода осеменения коров и телок и эффективность предлагаемого нами комплекса технологических приемов
Был испытан новый комплект инструментов для визоцерввкальиого осеменения, куда входили: светопроводный расширитель из органического стекла /по мялованову В.К. и Трофимову Ю.Н./ и соемеянтеяь-ный инструмент из полимерных материалов.
Принимая во внимание целесообразность глубокого введения семени в шейку матки нами были сконструированы и изготовлены геликоид-ные наконечники с разным числом витков /мвоговитховые и двухвнтко-вые, из пластмассы/с целью оптимального решения. Результат опре*
— 7 —
деляли по легкости и глубине введения инструментов в шейку матки коров. После выяснения лучшей конструкции использовали ее в опытах по осеменению коров и телок.
Эффективность использования модернизованного визоцервикального метода
Осеменение проводили визоцервикальным и ректоцервикалъным методами замороженным семенем от одних и тех же быков, используя норов-аналогов 4-6-члетнего возраста» черно-пестрой породы в Московской области и красной степной породы в Волгоградской области. Семя транспортировали в сосудах с жидким азотом из лаборатории, где проводили замораживание, на фермы.результаты определяли по стельности от осеменения в одну охоту в разные сроки после осеменения, по конечному результату с учетом повторных осеменений, по отелу и по длительности сервис-периода.
Раннее определение стельности Определение стельности иммунологическим методом
В основу иммунологического метода положено доказательство наличия в крови стельных коров фактора, вступащего в реакцию с антигенами эмбрионов вне организма. Эмбриональными антигенами /25-суточных эмбрионов/ нагружали отмытые ксеногенные эритроциты /барана/ и добавляли взвесь таких сенсибилизированных эритроцитов к сыворотке крови исследуемых коров. Кровь брали из яремной вены, начиная с 15 суток после осеменения, готовили ..- . v сыворотку. Реакцию проводили в пластине микротитратора. В каждую лунку мерной микропипеткой вносили 0,05 мл неразбавленной сыворотки исследуемых коров и добавляли по 0,05 мл взвеси сенсибилизированных
— 8 —
эритроцитов; несколько раз круговыми движениями перемещали пластины в горизонтальном направлении для перемешивания их содержимого. Накрывали лунки стеклом или другой пластиной и оставляли при комнатной температуре на 2-3 часа, после чего читали реакцию. Таким образом, в совхозе "Путь Ильича" исследовали 175 коров; стельными считали коров, сыворотки которых агглютинировали сенсибилизированные эритроциты барана.
Определение стельности ректальным методом
Этот методоснован на выявлении состояния матки, маточмнх артерий и самого плода путем прощупывания через стенку прямой, кишки. Эти исследования проводили через 60-90 суток после осеменения тех же коров» которых исследовали иммунологическим методом, причем при сопоставлении результатов исследования двумя методами, а также с данными отела строго учитывали сроки осеменения к не включали в окончательный анализ коров, повторивших течку.