Сосудистые эффекты андрогенов и их роль в механизмах стресса и адаптации Кассим Моханад Абдулилах

Содержание к диссертации

Введение

Глава I Обзор литературы 14

1.1 Половые особенности кардиоваскулярной стресс-реактивности 14

1.2 Роль андрогенов в регуляции сосудистого тонуса и кардиоваскулярной стресс-реактивности

1.3 Механизмы сосудистых эффектов андрогенов и их вклад в развитие артериальной гипертензии

Глава II Материалы и методы исследований 35

Глава III Результаты исследований 40

3.1 Влияние различных видов стресса на секрецию тестостерона и уровень артериального давления у крыс

3.2 Изменение экспрессии андрогенных рецепторов в мозге и висцеральных органах на фоне снижения секреции тестостерона в условиях стресс-индуцированного повышения артериального давления

3.3 Сравнение устойчивости к запредельному стрессу на фоне естественного и патологически низкого содержания тестостерона в крови у крыс

3.4. Ограничивающие эффекты андрогенов в отношении сосудистой стресс-реактивности и их механизмы

3.4. 1 Изучение холинергических механизмов регуляции сосудистой стресс-реактивности в условиях дефицита мужских половых гормонов и блокады андрогенных рецепторов

3.4.2. Влияние дефицита андрогенов на адренергическую гормональную активацию в условиях стресса на фоне нормального и патологически высокого уровня артериального давления

3.4.3 Влияние кастрации на активацию сигнальных молекул стресса (бета-аррестина-1) при различных состояниях организма

3.5. Оценка эффективности фармакологической коррекции 86

низкого уровня тестостерона в отношении устойчивости к развитию стресс-индуцированного инфаркта мозга у гипертензивных крыс

Глава IV Обсуждение результатов исследования 90

Выводы 101

Список литературы 103

• Роль андрогенов в регуляции сосудистого тонуса и кардиоваскулярной стресс-реактивности
• Механизмы сосудистых эффектов андрогенов и их вклад в развитие артериальной гипертензии
• Сравнение устойчивости к запредельному стрессу на фоне естественного и патологически низкого содержания тестостерона в крови у крыс
• Влияние дефицита андрогенов на адренергическую гормональную активацию в условиях стресса на фоне нормального и патологически высокого уровня артериального давления

Введение к работе

Актуальность. Тесная взаимосвязь между уровнем половых гормонов и
стрессом показана во многих исследованиях (King et al., 2005;

Шерстюк, 2007; Oskui et al., 2013; Semyachkina-Glushkovskaya et al., 2014).
Известно также, что половые гормоны оказывают мощное управляющее и
модулирующее влияние на стресс-реактивность и стресс- устойчивость
организма (Анищенко, 1993, Игошева, 2009, Семячкина-Глушковская, 2010,
Семенова, 2005). При этом женским половым гормонам отводят защитную роль
в отношении развития многих стресс-индуцированных сосудистых

заболеваний, в то время как мужские половые гормоны остаются вне поля зрения ученых (Мамбетова, 2000; Dubey et al., 2001; Deschams et al., 2010).

Кардиопроекторные эффекты андрогенов были впервые показаны в 1977 г. Профессором Jaffe (1977), который первым предложил лечить миокардиальную ишемию у мужчин с помощью тестостерона. Впоследствии применение тестостерона в кардиологической практике стало одним из направлений в терапии различных коронарных нарушений. Антиишемические эффекты андрогенов в миокарде были выявлены в исследованиях как с хроническим применением их синтетических аналогов pes оs в больших дозах (Wu, 1993) и подкожно (English, 2000б), так и при экстренной помощи с использованием внутривенных и внутрикоронарных инъекций (Webb, 1999а, 1999б). В экспериментах на приматах и кроликах, получающих в течение длительного времени дегидроэпиандростерон, была выявлена защитная роль андрогенов в устойчивости к развитию атеросклероза (Gordon, 1988; Eich, 1993; Christopher-Hennings, 1995).

Тот факт, что низкий уровень тестостерона сочетается с высокой смертностью от многих стресс-индуцированных заболеваний, таких как коронарные болезни, диабет, сердечная недостаточность (Araujo, 2011; Haring, 2010; Szulc, 2009; Laughlin, 2008; Khaw, 2007; Araujo, 2007; Shores, 2006; Smith, 2005), говорит о том, что нормальное содержание андрогенов критически необходимо для поддержания гомеостаза и сохранения резервных возможностей организма.

Предполагается, что в основе кардиопротективных эффектов андрогенов лежат их вазорелаксирующие эффекты, обнаруженные в многочисленных опытах in vitro на коронарных артериях, взятых у разных видов животных (Yue, 1995; Crews, 1999; Murphy, 1999; Deenadayalu, 2001). Кроме коронарных артерий, релаксирующие воздействия тестостерона были выявлены и на других типах артерий, включая грудную аорту (Yue, 1995; Honda, 1999; Ding, 2001), брыжеечные (Tep-Areenan, 2002), легочные (English, 2001) артерии.

Выдвигается предположение, что патологические сдвиги в андроген-
зависимых механизмах регуляции сосудистого тонуса могут лежать в развитии
артериальной гипертензии (АГ) и обеспечивать половые различия в данном
заболевании (Honda, 1999; Dubey, 2002; Khalil, 2005). Так, в опытах с
кастрацией показаны про- гипертензивные эффекты андрогенов

(Ganten, 1989; Chen, 1991; Rowland, 1992; Crofton, 1993; Reckelhoff, 2000).

С другой стороны, существуют работы, в которых выявлена

гипотестостеронемия у гипертензивных объектов (Fogari, 2002; Ishikura, 2008).

На фоне стресса показаны неоднозначные реакции со стороны андрогенов
в мужском и женском организме. Так, в клинических исследованиях выявлено,
что уровень тестостерона снижается при ежедневном воздействии

психологического стресса, причем наиболее выраженно это происходит у
мужчин по сравнению с женщинами среднего возраста (King, 2005). При этом,
в этих условия уровень кортизола, как основного гормона стресса, изменяется
менее выраженно по сравнению с тестостероном (Francis, 1981). В
экспериментах на крысах также показано, что хронический стресс

сопровождается подавлением секреции андрогенов, что влечет за собой снижение активности различных форм нитроксидсинтазы, ксантиноксидазы и NADPH- диафоразы (Шерстюк, 2007). Однако, не только в условиях хронического стресса, но и экстремальные кратковременные стрессы, такие как острые эмоции, которые испытывают молодые мужчины при прыжках с парашютом или с дельтапланом, также сказываются на функциях половых желез в виде снижения их секреторной деятельности (Chatterton, 1997).

Таким образом, научные сведения о продукции мужских половых гормонов и их регулирующих влияниях на сосуды нуждаются в более детальных исследованиях и структурированности для формирования более четкого видения роли мужских половых гормонов в процессах стресса и адаптации.

Вышеизложенное определило цель и задачи настоящих исследований.

Целью исследования явилось изучение роли андрогенов в механизмах регуляции сосудистой стресс-реактивности и стресс-устойчивости, а также изучение системных и молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние стресса на процесс образования тестостерона и установить взаимосвязь между секрецией гормона и стресс-индуцированными изменениями в уровне АД при использовании моделей легких физиологических, хронических и запредельных стрессов;

2. Исследовать стресс-индуцированные изменения в экспрессии андрогенных рецепторов в мозге и висцеральных органах на фоне хронически высокого АД и развития в этих условиях гипотестостеронемии с применением метода иммунофлуоресценции и модели АГ у крыс длительно проживающих в условиях социального стресса;

3. Выявить взаимосвязь между низким содержанием тестостерона в крови и устойчивостью к развитию стресс-индуцированных сосудистых «катастроф» в мозге с использованием моделей естественной и патологической гипотестостеронемии у новорожденных и взрослых гипертензивных крыс, соответственно.

4. Исследовать андроген-зависимые механизмы регуляции сосудистой стресс-реактивности у крыс с применением методов гонадэктомии и блокады андрогенных рецепторов на фоне фармакологической модуляции

холинергических влияний атропином;

5. Установить эффекты андрогенов в отношении регуляции интенсивности адреналового ответа при стрессе на гормональном и молекулярном уровнях, изучая эффекты дефицита мужских половых гормонов на секрецию адреналина и бета-аррестина-1 в крови;

6. Оценить эффективность фармакологической коррекции низкого содержания тестостерона путем введения сустанона в отношении устойчивости к стресс-индуцированому развитию инфаркта мозга у гипертензивных крыс.

Научная новизна. Впервые было изучено влияние различных видов
стресса на продукцию тестостерона у самок и самцов крыс. Новыми являются
уточняющие данные о том, что стрессы – хронические (для мужского
организма) и запредельные (для мужского и женского организма) являются
важными факторами в подавлении секреции тестостерона. Впервые с
применением оригинальных моделей естественного и патологически низкого
уровня андрогенов у крыс установлено, что низкий уровень тестостерона не
является прямым показателем снижения сосудистой стресс-устойчивости,
однако, подавление секреции гормона в динамике сопряжено с критическим
состоянием механизмов адаптации к стрессу и нарушением сосудистого
гомеостаза. В экспериментах на моделях легкого эмоционального,
хронического и запредельного стрессов впервые было выявлено, что
индуцированные стрессом изменения в уровне АД и содержании тестостерона в
крови не сопряжены напрямую друг с другом. Впервые на модели стресс-
индуцированной АГ установлено, что гипотестостеронемия в этих условиях
сопряжена со снижением экспрессии ядерных андрогенных рецепторов в
семенниках и церебральных сосудах, что свидетельствует о подавлении
регуляторных возможностей андрогенов в отношении процессов синтеза
мужских половых гормонов, а также ассоциируется с низкой устойчивостью к
развитию геморрагического инфаркта мозга. Оригинальными являются данные
о том, что сосудистые эффекты андрогенов заключаются в ограничении
интенсивности сосудистой стресс-реактивности опосредовано через

холинергические влияния, а также подавления адреналового представительства
на сосудах как со стороны гормонального звена (адреналин), так и сигнальных
систем стресса (бета-аррестин-1). Впервые выявлено, что фармакологическое
замещение низкого уровня тестостерона в крови путем введения сустанона на
фоне хронически высокого уровня АД не улучшает течение гипертензии и не
повышает устойчивость к стресс-индуцированному повреждению

церебральных сосудов, сопровождающих развитие интракраниальных

геморрагий. Показано, что лимитирующие эффекты андрогенов в отношении сосудистой стресс-реактивности проявляются как второстепенные запасные механизмы на фоне прямых процессов поддержания сосудистого гомеостаза.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют научные представления о роли андрогенов в сосудистой стресс-устойчивости и в механизмах адаптации к стрессу. На большом экспериментальном материале было показано, что сосудистые эффекты андрогенов определяются исходным состоянием организма,

проявляясь преимущественно в критические периоды стресса. Важным результатом явился тот факт, что изменения в секреции мужских половых гормонов не зависят напрямую от уровня АД, а строго определяются стрессогенным фоном. При этом, развитие АГ является фактором, провоцирующим подавление секреции андрогенов у мужских особей, но не у женских. Эти данные имеют важное значение для уточнения алгоритмов назначения гормон-заместительной терапии гипертензивным пациентам.

Яркими результатами явились данные по резкому снижению тестостерона в крови вне зависимости от пола на фоне запредельных стрессов при развитии геморрагического инфаркта мозга и язвенного кровотечения. При этом, предварительные исследования по возможности коррекции стресс-устойчивости церебральных сосудов при помощи фармакологического восстановления уровня андрогенов в крови не дали положительных результатов. Однако, было обнаружено, что андрогены выполняют функции «запасного аэродрома» при снижении адаптивных возможностей организма за счет проявления лимитирующих эффектов в отношении стресс-реактивности адренергической системы (адреналин) и активации сигнальных молекул стресса (бета-аррестин-1). Эти результаты могут быть «золотым ключиком» в открытии новых терапевтических подходов в восстановлении секреции мужских половых гормонов за счет модуляции экспрессии бета-аррестина-1. В условиях стресса, введение сустанона - синтетического аналога тестостерона, «не видится» организмом, несмотря на визуальное повышение содержания горомона в крови. Это означает, что в критических ситуациях на фоне запредельного стресса андрогены теряют доступ к механизмам регуляции сосудистой стресс-реактивности, возможно, за счет подавляющего воздействия бета-аррестина-1. ткрытиях последних лет показано, что модуляция активности бета-аррестина-1 оказывает выраженные терапевтические эффекты при стресс-индуцированных мутагенных изменениях в тканях, включая семенники. На основе этих данных, тестирование выдвинутой гипотезы о возможной коррекции секреции андрогенов с помощью блокады бета-аррестина-1 и повышения сосудистой стресс-устойчивости в клинических и экспериментальных исследованиях может явиться одним из основных векторов новых научных работ в этом направлении.

Выявлено, что андрогены оказывают лимитирующие влияния на прессорные эффекты стресса опосредованно через холинергические механизмы и ограничения адреналового доступа на сосуды. Эти факты являются важной теоретической основой для развития нового фармакологического направления в лечении сосудистых патологий с помощью гормон-заместительной терапии.

Интересным фактом, требующим детальных и дальнейших исследований, явилась «модель» низкого содержания андрогенов в крови у новорожденных крыс, но более высокой их устойчивости к запредельным стрессам по сравнению со взрослыми гипертензивными животными. Использование данной модели, в сравнении с половозрелыми особями, позволит понять какие механизмы выходят из строя в условиях тяжелых стрессов, требующих подключения «запасного аэродрома» в виде андрогенов.

Материалы и методы исследования

Исследования выполнены на 302 половозрелых, 22 новорожденных самцах и 73 самках белых беспородных крыс. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Регистрацию среднего артериального давления (ср.АД) у бодрствующих крыс осуществляли на компьютерно-вычислительном комплексе для прямой регистрации кровяного давления у мелких животных (PowerLab/400 ML 401, ID Instruments, 2002, Австралия) с программным обеспечением Chart 4, оснащенным датчиками кровяного давления (MLT0699, PowerLab, ID Instruments). С этой целью за сутки до экспериментов животным вживлялся полиэтиленовый катетер в аорту через левую ветвь сонной артерии под общей нембуталовой анестезией (0.40 мг/кг, ip). Стандартная операционная процедура по имплантации полиэтиленовых катетеров в сосуды подробно описана в следующих научных работах (Мурашев, 1992; Глушковская-Семячкина, 2002). В экспериментах использовались полиэтиленовые катетеры (ClayAdams, Parsippany, NewYersey), маркированные как BB31695-PE/1 (наружный диаметр - 0.61 мм, внутренний диаметр – 0.28 мм) и BB31695-PE/3 (наружный диаметр - 0.96 мм, внутренний диаметр – 0.58 мм).

Для постоперационного восстановления животные помещались в индивидуальные клетки (0.30.250.2 м). Эксперименты проводили спустя 24 часа после операции. Перед началом каждого опыта крысы адаптировались к экспериментальной обстановке в течение 30 мин. В этот период испытуемому животному через катетер вводили раствор гепарина для предотвращения тромбообразования на его стенках (Biochemi, Vienna/Austria 25000 ED/5ml) из расчета 1000 ED/0.2 мл гепарина в 0.8 мл физиологического раствора в объеме 0,2 мл раствора гепарина).

Способы моделирования ренальной и стресс-индуцированной

артериальной гипертензии подробно описаны в патентах РФ 68280, 2409872.

С целью изучения резервных возможностей сердечно-сосудистой
системы изучали структуру кардиоваскулярной стресс-реактивности в
условиях тяжелого стресса, провоцирующего развитие церебро- и

кардиоваскулярных повреждений (Анищенко, 1992; 1995). Моделирование тяжелого стресса, представляющего собой комбинированное воздействие иммобилизации и прерывистого звука 100 дБ в течение 120 мин, осуществляли по методу Т.П. Романовой (1989). У новорожденных крыс применяли модифицированную нами методику (Патент РФ 2505805).

Определение тестостерона, адреналина и бета-аррестина-1 в крови проводили иммуноферментным методом (Wilson, 1992) с использованием компьютерно-диагностического комплекса IMMULITE 2000 (США).

Определение экспрессии андрогенных рецепторов проводили с помощью иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного методов с применением специфических антител (AN1-15, Santa Cruz sc 56824) и конфокального микроскопа Leica TCS SP5X (2014). Морфологические исследования тканей мозга осуществляли с помощью стандартной процедуры проводки и заливания

парафином срезов тканей толщиной 4-5 мкм. Для окрашивания срезов исследуемых тканей применялись гистологические красители: гематоксилин и эозин. Оценку морфологических изменений в тканях осуществили с помощью микровизора Vizo-101 (ЛОМО).

С целью изучения роли половых гормонов в регуляции базального и стрессорного уровней АД проводили гонадэктомию нормотензивных и гипертензивных самцов в соответствии со стандартной методикой кастрации (Коган, 1980).

Для блокады андрогенных рецепторов применяли флутамид (10 мг/кг, per os), который применяли в течение 2-х недель.

Для изучения устойчивости к стресс-индуцированному инфаркту мозга в условиях низкого содержания тестостерона крысам вводили однократно Сустанон-250 (10 мг/кг) разведенный в стерильном оливковом масле, внутримышечно двукратно с перерывом в одну неделю.

Исследования гемодинамических параметров мозгового кровотока проводили с использованием 3D оптической когерентной томографии на установке OCS1300SS (США) и системы лазерной спекл-визуализации. Подробное описание этих методов изложено в следующих публикациях (Semyachkina-Glushkovskaya, 2013 а, б).

Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью пакета программ Statistica 5.0. Различия считались достоверными при р<0.05. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уровень тестостерона определяется силой и продолжительностью стресса. Снижение секреции гормона в динамике отражает критическое состояние адаптивных и резервных возможностей организма.

2. Сосудистые эффекты андрогенов выполняют функцию «запасного аэродрома» в адаптивных механизмах организма, проявляясь в виде второстепенных процессов «обороны» или сдерживания интенсивности сосудистой стресс-реактивности за счет модулирования холинергических влияний, а также лимитирования адреналового представительства на сосудах со стороны гормонов (адреналин) и сигнальных систем стресса (бета-аррестин-1).

3. Фармакологическое замещение низкого уровня тестостерона на фоне хронически высокого артериального давления не повышает устойчивость к стресс-индуцированным «сосудистым катастрофам».

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на
международной конференции по фотонике (Саратов, Россия, 25-26 сентября
2013 г. и 23-26 сентября 2014 г.); на международном конгрессе «Наука
будущего» (Санкт-Петербург, Россия, 17-20 сентября 2014 г.); на 6-й
международной конференции по фотонике и оптической электронике (Вухань,
Китай, 21-23 мая 2013 г.); на международной конференция по нелинейной
динамике детерминированных и стохастических систем (Саратов, Волжские
Дали, Россия,19-23 мая 2014 г.). Материалы диссертации докладывались и
обсуждались на открытом заседании кафедры физиологии человека и
животных федерального образовательного учреждения высшего

профессионального образования “Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского”.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Общий объем диссертации 124 страницы с 26 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы включает 192 источников, в том числе 24 отечественных и 168 иностранных.

Роль андрогенов в регуляции сосудистого тонуса и кардиоваскулярной стресс-реактивности

Женский организм имеет более выраженную устойчивость к разным неблагоприятным условиям, чем мужской , это проявляется в более высокой продолжительности жизни (Комфорт, 1967). Половые различия в стресс-реактивности и стресс-устойчивости сердечно-сосудистой системы (ССС), является важнейшей биологической проблемой, которая была еще сформулирована Ч. Дарвином. Однако, научной исследований в этой области крайне мало. Пик популярности среди ученых по изучению данной проблематики пришелся на 90 е годы прошлого столетия. Современные исследования в основном сконцентрированы на половых особенностях в молекулярных, и генетических аспектах, что не дает целостного представления о процессах, лежащих в основе данного феномена. (Ingalhalikar, 2014; Willis, 2014). Повышенная стойчивость женского организма по сравнению с мужским к неблагоприятным факторам проявляется уже в эмбриональном периоде и сразу после рождения. По данным Бедного М.С. (1979), смертность среди мальчиков выше,чем среди девочек на 12% в период зародышевого развития и на 30% в первые сутки после рождения. В критические периоды онтогенеза сердечно-сосудистой деятельности (6 лет и 12-14 лет) у мальчиков наблюдается более резкое, чем у девочек, ухудшение функциональных и адаптивных возможностей сердечной деятельности (Гринене,1990). Интересно отметить, что аналогичная тенденция наблюдается и среди животных. Так при отсутствии меди в пище, у самцов крыс по сравнению с самками в более резкой форме происходили биохимические изменения в крови (Kramer, 1988). В наше время данная проблема половых различий в выживаемости и продолжительности жизни приобретает высокую актуальность. Самым ярким примером является, что во многих странах мира продолжительность жизни у мужчин короче чем у женщин. В последние два десятилетия произошли изменения в структуре смертности и на первое место вышли, так называемые болезни цивилизации, к ним относятся такие болезни как: заболевания сердца и сосудов: инфаркт миокарда, гипертония, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз (Stoney, 1987, Федоров, 1991, Чазов, 1992, Судаков, 1992.). От сердечно - сосудистых заболеваний страдают больше мужчины, чем женщины. (Stoney, 1987, Tunstall-Pedoe, 1994, Lawler, 1995, Roger, 1998, Glyn,1999,). Поэтому половые различия в продолжительности жизни в настоящее время определяется прежде всего устойчивостью женщин и мужчин к стрессорным воздействия. Однако механизмы половых различий к стрессу исследованы недостаточно хорошо. Тем не менее в последние два десятилетия внимания многих ученых привлек вопрос о половых особенностях реакций ССС на различный стресс. Стрессовые влияния приводят к возникновению заболеваний системы органов коровообращения, что подтверждается многими исследователями.(Falkner, 1981, Dlin, 1983, Krantz,мManuck, 1984). Повышение уровня смертности среди мужчин от заболеваний сердца и сосудов объясняется предположительно отличиями у мужчин и женщин в реакции на стресс. (Stoney,1987).

У разных исследователей существует диаметрально противоположные мнения о причине повышения уровня смертности у мужчин от сердечно – сосудистых заболеваний по сравнению с женщинами. Некоторые исследователи, Не находят каких-либо гендерных отличий в базальных и стрессорных уровнях сердечных сокращений (Frankenhaeuser, 1976, Gotshall, 1994). Другие исследователи экспериментально доказали, что женщины по сравнению с мужчинами имеют более высокие базальные и стрессорные уровни ЧСС (Eiff, 1990, McAdoo, 1990, Allen, 1993).

У мужчин систалическое артериальное давление при стресс -индуцированной тахикардии нарастает в значительно большей степени по сравнению с женщинами. Все выше сказанное свидетельствует в пользу предположения о том, что с понижением базального уровня артериального давления у женщин снижается риск развития сердечно - сосудистых заболеваний вызванных стрессом.(Hastrup, Light, 1984, Van Doorner, 1986, Weidner, Helmig, 1991).Такие отличия объясняются особенностями энергетического обмена у мужчин и женщин так у мужчин потребность миокарда в кислороде выше чем у женщин, восполнение данной потребности происходит благодаря повышению работы сердца за счет увеличения уровня АД, У женщин потребность миокарда в кислороде решалось за счет возрастания ЧСС и минутного объема крови. (Меерсон Ф.З. (1984). Исходя из вышесказанного исследователи приходят к выводу, что при стрессвовых воздействиях в организме женщин создаются наиболее оптимальные условия, способствующие поддержанию уровня АД на относительно на невысоком уровне. Ведяев Ф П 1990. Женский организм за счет экономного типа гемодинамических реакций оказывается в юолее выгодных условиях по сравнению с мужским так как их коронарные сосуды защищены лучше этим и объясняется наиболее частое встречаемость ишемической болезни сердца у мужчин.(Tatchumalom2000). Мужской организм реагирует на стресс максимальной мобилизацией аппарата кровообращения, проявляющейся в максимальном напряжении механизмов регуляции АД, в отличие от женщин, в условиях эмоционально- стрессорного напряжения у них усиливается преимущественно центральное управление сердечным ритмом, что по мнению Бутяевой В.В. (1991), ухудшает адаптацию ССС к стрессу. Белова Е.В.,Голованова Г.Б. (1982) отмечают, более выраженные у женщин в отличие от мужчин хронотропные эффекты в условиях стресса указывают преимущественно на норадреналовое обеспечение эмоционального напряжения,что способствует максимальной оптимизации функционирования ССС и лучшей подготовке к экстренной мобилизации. В мужском организме гемодинамические изменения при стрессе имеют преимущественно адреналовое происхождение, что значительно снижает адаптацию ССС к стрессорному воздействию. Половые особенности проявляются и после стрессорного воздействия Girdler (1990) Возникшие у них отклонения кардиоваскулярной системы в ответ на действие физиологических стрессов сохраняются в период релаксации. У женщин после отмены стрессорного воздействия, почти все показатели гемодинамики возвращаются к исходным величинам.

Механизмы сосудистых эффектов андрогенов и их вклад в развитие артериальной гипертензии

Регистрацию среднего артериального давления (ср.АД) у бодрствующих крыс осуществляли на компьютерно-вычислительном комплексе для прямой регистрации кровяного давления у мелких животных (PowerLab/400 ML 401, ID Instruments, 2002, Австралия) с программным обеспечением Chart 4, оснащенным датчиками кровяного давления (MLT0699, PowerLab, ID Instruments). С этой целью за сутки до экспериментов животным вживлялся полиэтиленовый катетер в аорту через левую ветвь сонной артерии под общей нембуталовой анестезией (0.40 мг/кг, ip) (рис. 1). Стандартная операционная процедура по имплантации полиэтиленовых катетеров в сосуды подробно описана в следующих научных работах (Dworkin, 1980; FejesothG., 1984; Мурашев, 1992; Глушковская-Семячкина, 2002). В экспериментах использовались полиэтиленовые катетеры (производство ClayAdams, Parsippany, NewYersey), маркированные как BB31695-PE/1 (наружный диаметр - 0.61 мм, внутренний диаметр – 0.28 мм) и BB31695-PE/3 (наружный диаметр - 0.96 мм, внутренний диаметр – 0.58 мм).

Для постоперационного восстановления животные помещались в индивидуальные клетки (0.30.250.2 м). Эксперименты проводили спустя 24 часа после операции. Перед началом каждого опыта крысы адаптировались к экспериментальной обстановке в течение 30 мин. В этот период испытуемому животному через катетер вводили раствор гепарина для предотвращения тромбообразования на его стенках (Biochemi, Vienna/Austria 25000 ED/5ml) из расчета 1000 ED/0.2 мл гепарина в 0.8 мл физиологического раствора в объеме 0,2 мл раствора гепарина).

Имплантация полиэтиленового катетера в сонную артерию: 1-3 – лигатуры, фиксирующие катетер на сосуде, 4 – сонная артерия Способ моделирования ренальной гипертензии (Патент РФ 68280) В основе данного метода лежит создание с помощью определенных хирургических манипуляций искусственного стеноза ренальной артерии. С этой целью под общей анестезией вскрывали брюшную полость, находили ренальную артерию и отделяли ее от соединительной ткани (рис. 2а). Предварительно в соответствии с возрастными и индивидуальными особенностями животного вырезали клипсу, ширина которой составляла 1/5 от визуальной длины ренальной артерии, длина – от 1 мм (для животных с массой от 50-150 гр.) до 2 мм (для крыс с массой от 150-350 гр.). Клипсу изготавливали из алюминиевой тонкой пластинки (0.5 мм), покрытой окисным инертным слоем (рис. 2б). Установку клипсы производили путем простого подведения ее в открытом виде под ренальный сосуд (рис. 2в). С помощью технических щупов контролировали зазор клипсы, который составлял для крыс массой: от 50-100 гр. – 0.16 мм; от 100-150 гр. – 0.18 мм; от 150-200 гр. – 0.23 мм; от 200-250 гр. – 0.25 мм; от 250-300 гр. – 0.29 мм; от 300-350 гр. – 0.29 мм.

Фиксирование клипсы на сосуде осуществляли путем загиба с помощью плоских хирургических пинцетов одного более длинного краевого конца клипсы на другой более короткий (рис. 2г). Устойчивые высокие показатели АД наблюдали спустя 7 недель после наложения клипсы на ренальную артерию. Способ моделирования стресс-индуцированной артериальной гипертензии (Патент РФ 2409872)

Выполнение поставленной задачи достигалось путем содержания крыс в течение 4 месяцев в условиях социального стресса (перенаселение или изоляция). Для соблюдения правил содержания животных небольшими группами (Лабораторные животные. 1993. № 2.) крысы должны проживать в клетке в следующем соотношении площади и массы тела: см2/г массы тела=1. В данной модели использовали проживание животных в условиях высокой популяционной плотности, когда указанное соотношение было (см2/г массы тела = 0,3), то есть в три раза превышающее нормативы. А также проживание животных в одиночестве (площадь клетки 350 см2). На протяжении 4 месяцев у части животных проводились контрольные измерения уровня АД в соответствии со стандартной операционной процедурой прямой регистрации сигналов кровяного давления. Через 4 месяца проживания крыс в условиях социального стресса у 100% животных под анестезией (для исключения влияния психоэмоциональных факторов) отмечался повышенный базальный уровнь АД, который соответствовал гипертензивному уровню.

С целью изучения резервных возможностей ССС изучали структуру кардиоваскулярной стресс-реактивности в условиях тяжелого стресса, провоцирующего развитие церебро- и кардиоваскулярных повреждений (Анищенко, 1992; 1995). Моделирование тяжелого стресса, представляющего собой комбинированное воздействие иммобилизации и прерывистого звука 100 дБ в течение 120 мин, осуществляли по методу Т.П. Романовой (1989; 1990). У новорожденных крыс применяли модифицированную нами методику, описанную подробно в данном патенте (Патент РФ 2505805)

Определение тестостерона, адреналина и бета-аррестина-1 в крови проводили иммуноферментным методом (Wilson, 1992) с использованием компьютерно-диагностического комплекса IMMULITE 2000 (США). Определение экспрессии андрогенных рецепторов проводили с помощью иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного методов с применением специфических антител (AN1-15, Santa Cruz sc 56824) и конфокального микроскопа Leica TCS SP5X (2014).

Морфологические исследования тканей мозга осуществляли с помощью стандартной процедуры проводки и заливания парафином срезов тканей 4-5 мкм. Для окрашивания срезов исследуемых тканей применялись гистологические красители: гематоксилин и эозин. Оценку морфологических изменений в тканях осуществили с помощью микровизора Vizo-101 (ЛОМО).

С целью изучения роли половых гормонов в регуляции базального и стрессорного уровней АД проводили гонадэктомию нормотензивных и гипертензивных самцов в соответствии со стандартной методикой кастрации (Коган, 1980).

Для блокады андрогенных рецепторов применяли флутамид (10 мг/кг, per os), который применяли в течение 2-х недель.

Для изучения устойчивости к стресс-индуцированному инфаркту мозга в условиях низкого содержания тестостерона крысам вводили однократно Сустанон-250 (10 мг/кг) разведенный в стерильном оливковом масле, внутримышечно двукратно с перерывом в одну неделю.

Исследования гемодинамических параметров мозгового кровотока проводили с использованием 3D оптической когерентной системы лазерной спекл визуализации. Подробное описание этих методов изложено в следующих публикациях (Semyachkina-Glushkovskaya, 2013 а, б). Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью пакета программ Statistica 5.0. Различия считались достоверными при р 0.05томографии на установке OCS1300SS (США) и. Данные представлены как среднее+стандартная ошибка среднего.

Сравнение устойчивости к запредельному стрессу на фоне естественного и патологически низкого содержания тестостерона в крови у крыс

Бета-аррестин-1 определяли иммуноферментным методом. В качестве стресса применяли модель 2-х часовой иммобилизации. Кастрация вызывала снижение содержания тестостерона в крови на 69% (p 0.05), развитие АГ, индуцированное стрессом и окклюзией ренальной артерии, также сопровождалось подавление секреции гормона на 38% (p 0.05) и 45% (p 0.05), соответственно (4.51±0.06 нмоль/л в норме; 1.37±0.09 нмоль/л у кастрированных самцов; 2.82±0.05 нмоль/л у крыс со стресс индуцированной АГ; 2.48±0.04 нмоль/л у крыс с ренальной АГ). Базальные значения бета-аррестина-1 не различались между самцами с нормальным фоном андрогенов и в группах с дефицитом мужских половых гормонов (Таблица 8). Однако, стрессорная динамика в продукции бета-аррестина-1 существенно различалась между нормой и состоянием дефицита андрогенов (Рис. 26).. Так, если в норме секреция бета-аррестина-1 увеличивалась на 24% (p 0.05), то на фоне дефицита андрогенов – на 54% (p 0.05) в группе с кастрацией, на 97% (p 0.05) в группе со стресс-индуцированной АГ и на 87% (p 0.05) в группе с ренальной АГ. Таким образом, в условиях дефицита мужских половых гормонов стрессорный ответ со стороны активации молекулярных механизмов регуляции сосудистой стресс-реактивности, таких как синтез бета-аррестина-1, становится высоким, по интенсивности существенно превышающим таковой в норме. Снижение уровня тестостерона влечет за собой чрезмерную активацию процессов адренергического «доступа» к сосудам при стрессе за счет повышенного синтеза ко-фактора (бета-аррестина- 1), координирующего клеточные процессы фосфорилирования специфических белков при стимуляции бета-адренорецепторов адреналином. 3.5 Оценка эффективности фармакологической коррекции низкого уровня тестостерона в отношении устойчивости к развитию стресс-индуцированного инфаркта мозга у гипертензивных крыс

Как было показано в главе 3.1 подавление секреции тестостерона сопровождает процессы развития АГ и наиболее ярко проявляется при стресс-индуцированных сосудистых катастрофах, таких как мозговые и язвенные кровотечения.

Целью данного эксперимента был поиск ответа на вопрос, возможно ли гормон-заместительной терапией, поднимая уровень тестостерона в крови фармакологическим путем, повысить сосудистую стресс-устойчивость на примере развития геморрагического инфаркта мозга у гипертензивных крыс. Для этого, вызывали развитие ренальной АГ у самцов крыс (n=20) и после достижения устойчиво высоких показателей АД по истечении 2-х месяцев после окклюзии ренальной артерии половине крыс (n=10) вводили однократно Сустанон-250 (разведенный в стерильном оливковом масле) в дозе 10 мг/кг, внутримышечно двукратно с перерывом в одну неделю.

По истечению 14 дней после введения сустанона проводили исследования тестостерона в крови и определяли влияние сустанона на диаметр и скорость потока крови в различном типе сосудах (сагиттальный синус, сонная артерия, ренальная артерия, а также мозговые и брыжеечные артериолы) с помощью коммерческого оптического когерентного томографа, совмещенного с допплеровской системой и полнопольной лазерной спекл-визуализацией сосудов. Для мозговых и брыжеечных артериол считали среднее значение измеряемых показателей.

Далее всех гипертензивных крыс, получающих и не получающих сустанон, подвергали воздействию сильного звукового стресса (Романова, 1989) с целью изучения их устойчивости к развитию геморрагического инфаркта мозга. Результаты данных исследований следующие. Введение сустанона сопровождалось повышением уровня тестостерона в крови у всех гипертензивных крыс (4.73±0.3 против 2.17±0.05, p 0.05).

Оптические исследования крупных и микро-сосудов мозга и на периферии выявили различия между нормотензивными и гипертензивными особями только в диаметре и скорости кровотока сагиттального синуса (Таблица 9). Диаметр данного сосуда был увеличен у гипертензивных крыс на фоне снижения скорости кровотока в нем, что свидетельствует о нарушении оттока венозной крови из мозга при развитии ренальной АГ. Однако, по церебральной и периферической микроциркуляции, а также оптическим показателям состояния сонной и ренальной артерии не были найдены различия в указанных группах крыс.

Введение сустанона не оказывало эффектов на исследуемые сосуды ни у нормотензивных, ни у гипертензивных крыс, включая сагиттальный синус (Таблица 9). Патологические изменения в данном венозном сосуде мозга не были устранены путем повышения уровня тестостерона в крови у гипертензивных крыс.

У всех гипертензивных крыс, получающих и не получающих сустанон, звуковой стресс вызывал повреждение мозговых сосудов в равной степени. Как число, так и площадь геморрагий у крыс не зависели от приема сустанона. Таким образом, результаты данных исследований свидетельствуют о том, что фармакологическое замещение уровня низкого уровня тестостерона, сопровождающего развитие АГ, не может быть использовано в качестве терапевтического подхода для решения проблем риска возникновения «сосудистых катастроф» в мозге на фоне прогрессирования болезни.

Влияние дефицита андрогенов на адренергическую гормональную активацию в условиях стресса на фоне нормального и патологически высокого уровня артериального давления

Полученные данные позволяют заключить, что андрогены сдерживают интенсивность адреналового ответа на стресс при патологическом повышении уровня АД. В ряде экспериментальных работ показано, что андрогены обладают прямыми эффектами в ношении модуляции синтеза катехоламинов надпочечниками (Kumai, 1995). Показаны тестостерон-зависимые процессы высвобождения нейропептида У из окончаний симпатических нервов, (Zukowska-Grojec, 1995) и регуляция активности тирозингидроксилазы (Kumai, 1995, 1995а). В литературе практически отсутствуют данные по изучению влияния тестостерона на вегетативные механизмы регуляции. Полагают, что большинство центральных эффектов тестостерона реализуется через рецепторы эстрогенов после превращения этого гормона в эстрадиол (de Ronde, 2003). Однако механизмы, участвующие в регуляции этого процесса, остаются до настоящего времени малоизученными. Бета-аррестин-1 является один из ко-факторов в процессах трансформации нервного импульса при возбуждении адренорецепторов в активацию вторичных мессенджеров и фосфорилизацию специфических белков. В открытиях последних лет было доказано, что хронические стрессы при повышенном образовании адреналина приводят к нарушению системы бета-адренорецепторы-бета-аррестин-1-G-белок, что лежит в основе развития стресс-индуцированных сосудистых заболеваний, включая АГ (Hara, 2011). На фоне снижения резервных возможностей организма, к примеру, при развитии онкологии в семенниках, резко снижается концентрация тестостерона, но возрастает продукция бета-ррестина-1 в данном органе (Zhang, 2011).

На основании этих данных решалась задача по выявлению роли андрогенов в регуляции молекулярных механизмов стрессорного управления сосудами на основе изучения продукции бета-аррестина-1 в крови в условиях развития различны форм АГ. Результаты исследования показали, что в условиях дефицита мужских половых гормонов стрессорная активация синтеза бета-арретисна-1 значительно увеличивается по интенсивности по сравнению с нормой. Эти данные позволяют заключить, что снижение уровня тестостерона влечет за собой чрезмерную активацию процессов адренергического «доступа» к сосудам при стрессе за счет повышенного синтеза ко-фактора (бета аррестина-1), координирующего клеточные процессы фосфорилирования специфических белков при стимуляции бета-адренорецепторов адреналином. Таким образом, эффекты андрогенов на ССС проявляются в виде сдерживания интенсивности сосудистой стресс-реактивности опосредовано через холинергические влияния, а также ограничения адреналового представительства на сосудах как со стороны гормонального звена (адреналин), так и сигнальных систем стресса (бета-аррестин-1). Поскольку в исследованиях было обнаружено подавление секреции тестостерона при развития АГ, и особенно, в условиях стресс индуцированных сосудистых катастрофах, таких как мозговые и язвенные кровотечения, на следующем этапе решалась задача, возможно ли гормон заместительной терапией, поднимая уровень тестостерона в крови фармакологическим путем, повысить сосудистую стресс-устойчивость на примере развития геморрагического инфаркта мозга у гипертензивных крыс.

Результаты исследования показали, что фармакологические замещение низкого уровня тестостерона в крови на фоне хронически высокого уровня АД не улучшает течение гипертензии и не повышает устойчивость к стресс-индуцированному повреждению церебральных сосудов, сопровождающих развитие интракраниальных геморрагий. Эти данные позволяют заключить о том, что андрогены не выполняют прямой функции повышения стресс-устойчивости. Однако, на основании вышеприведенных данных о лимитирующих эффектах андрогенов в отношении сосудистой стресс-реактивности можно сделать вывод о том, что эти эффекты проявляются как второстепенные запасные механизмы на фоне прямых процессов поддержания сосудистого гомеостаза.

Отметим, что современные представления о гормон-заместительной терапии с применением синтетических аналогов тестостерона весьма противоречивые (Pongkan, 2015). Положительные результаты показаны в отношении коронарных заболеваний сердца (Basaria, 2010; Jaffe, 1977, Webb, 1999а, 1999б; Gordon, 1988; Eich, 1993; Christopher-Hennings, 1995).

В последнее время появляется все больше научных обзоров, отражающие негативные эффекты заместительной терапии тестостероном или ее неэффективность. Carol (2005) в исследованиях на 651 мужчинах больше 45 лет с гипотестостеронемией показал, что введение тестостерона не повышало устойчивость к развитию злокачественных образований в семенниках. Haddad (2007) не обнаружил снижения систолического и диастолического АД, улучшения липидного профиля у 808 мужчин. Fernandez-Barselles (2010) показал, что синтетические аналоги тестостерона не повышали устойчивость 1031 испытуемых мужчин к инфаркту миокарда, аритмии, коронарным процессам реваскуляризации и онкологии семенников. Gluech (2013) указывает на риск развития венозного тромбоза и легочной эмболии у пациентов, находящихся на гормон-заместительной терапии андрогенами.

В целом, результаты проведенных исследований показали, что секреция тестостерона определяется силой и продолжительностью стресса. Сосудистые эффекты андрогенов зависят от состояния организма и пола и проявляются как запасной механизм в процессах адаптации к стрессу. Мужские половые гормоны не обладают прямым доступом к сосудам, но активно вовлекаются в механизмы регуляции сосудистой стресс-реактивности и стресс-устойчивости за счет модуляции стрессорной активации холинергических и адренергических влияний на ССС. Нормальное содержание андрогенов необходимо для поддержания сосудистого гомеостаза, однако, фармакологические возмещение его уровня при гипотестостеронемии при АГ не оказывает положительных эффектов, что косвенно подтверждает вывод об опосредованном влиянии андрогенов на сосуды через прямые процессы регуляции сосудистого тонуса.