Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение механизмов пластичности нервных клеток, лежащей в основе нормального функционирования мозга, является одной из центральных проблем современной нейробиологии. Это базовое свойство нервной системы играет важную роль как в адаптивном поведении животных и человека, так и при нарушении функций мозга (Котляр, 1986).
Пластичность ШС наиболее выражена у развивающихся животных. В ходе развития происходит удлинение дендритов и аксонов, активная перестройка их разветвленных окончаний и образование синапсов. Эти процессы являются основными этапами дифференцировки нейронов и ведут к установлению функционально зрелых нервных связей. Те ке события (рост аксонов, синаптогенез) определяют успех или неудачу нервной регенерации, а также могут лежать в основе некоторых форм синапти-ческой пластичности взрослого мозга, одной из которых является длительная посттетаническая потенциация - широко известная модель для изучения клеточных и молекулярных механизмов обучения и памяти (Teyler, DiScenna, 1987; Matthies, 1989). В связи с этим изучение нейрональной пластичности развивающегося мозга может способствовать пониманию механизмов этого явления во взрослом мозге. Данное положение подтверждается одной из моделей памяти, в которой проводится аналогия между процессами, контролирующими дкфференцировку клеток, и механизмами, ответственными за приобретение долговременной памяти (Goelet et al., 1986).
Значительное внимание при исследовании молекулярных основ функционирования развиваипейся и взрослой нервной системы уделяется нейроспецифическим белкам (Штарк, 1985; Березин, Велик, 1990). Это связано с тем, что белки, являясь объектом многообразных форм регуляции, в свою очередь выполняют различные регуляторные функции и играют такім образом важную роль в морфофизиологических процессах. В последнее время появилось большое количество исследований, посвященных выяснению функций нейроспецифических белков в молекулярных механизмах пластичности взрослого мозгз. Эти работы касаются как изучения роли отдельных белков (например, белка S-I00 (Громов и др., 1991; Hyden et al., 1977)), так и новых идей
о том, что в основе нейрональной пластичности лекат такие общие свойства структуры белка, как его подвижность, существование дискретных конформационшх состояний и разнообразных видов супрамолекулярной белковой организации (Frledrlch, 1990).
Имеющиеся в настоящее время данные позволяют предположить, что существенную роль в пластичности развивакщегося мозга играют нейроспецифическив белки-маркеры отдельных клеточных типов, молекулы клеточной адгезии, факторы роста нервных волокон (Березин, Велик, 1990; Davies, 1988; Rutishauser, Jessel, 1988; Llnnemann,- Bock., 1989). Таким образом, исследование маркеров отдельных клеточных типов нервой ткани и специфических образований нейронов (аксонов, дендритов, синапсов) позволяет не только изучить процессы дифференцировки и специализации клеток в онтогенезе, но и приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования зрелых клеток.
Одним из методов, позволяющих решить эту задачу, является гибридомная биотехнология. Так, применение монокло-нальных антител (МКА) позволило идентифицировать антигены клеточной поверхности, экспрессия которых была ограничена по времени и/или регионально (McKay, Hockflell, 1982; Moskal, Scoaffner, 1986; Yamamoto et al., 1986; Stainier, Gilbert, 1989). С помощью МКА удалось также выявить антигены нейрональной поверхности, играющие важную роль в межклеточных взаимодействиях, процессах роста аксонов и синаптогенеза (Alcantara et al., 1992; Merkourl, Matsas, 1992; Wallls et al., 1992; Murakami et al., 1993).
Несмотря на значительное количество появившихся в последнее время подобных исследований, роль выявляемых молекул в пластичности развивающегося"и взрослого мозга . остается малоизученной: в большинстве работ отсутствуют данные о периодах появления этих белков в онтогенезе, практически не используются возможности МКА для изучения их функций (например, путем модификации или блокады функции белка в культуре ткани или физиологическом эксперименте), а заключение о функции белков чаще всего делается на основании электронно-микроскопических исследований об их локализации в пре-
»
или постсиналгических структурах или данных об их физико-химических свойствах (например, способности к связыванию с ионами кальция или принадлежности к классу гликопротеинов, опосредующих межклеточные взаимодействия). В настоящее время известны лишь единичные работы, . в которых изучено участие молекул, специфичных для определенных периодов онтогенеза, в функционировании взрослого мозга (Stanton et al., 1987).
Таким образом, представляется актуальным комплексное исследование, в котором обнаружение новых молекул, вовлечен-шшх в процессы дайэренцировки нзйронов, сочеталось бы с изучением их возможной роли в механизмах пластичности взрослого мозга.
В связи с этим целью работы явилось исследование участия нейроспецифических белков (антигенов) в механизмах нейрональной пластичности развивающегося и взрослого мозга крыс с использованием моноклональных антител, позволяющих идентифицировать новые молекулы, вовлеченные в эти процессы.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Получить банк гибридом, продуцирущих моноклональные
антитела к антигенам развивающегося гшшокампа крысы,
специфичным для ранних этапов постнатального онтогенеза.
-
Установить локализацию выявляемых моноклональнкки антителами антигенов в головном мозге крысы.
-
Изучить изменение локализации обнаруживаемых макромолекул в раннем шстнагальном онтогенезе.
4. Исследовать влияние моноклональных антител на
развитие гиппокампа в органотипической культуре.
5. Определить возможное участие данных нейроспецифичес
ких белков в механизмах пластичности взрослого мозга.
Основные положения, выносимне на заг^иту:
1. Метод гибридомной биотехнологии и иммунизация живот
ных с использованием циклофосфамида позволяют обнаружить
белки (антигены) нервной ткани, специфичные для ранних
этапов постнатального онтогенеза.
2. Экспрессия антигенов, выявляемых UKA 3G7-F8 и
6С4-С2, характеризуется высокой региональной и клеточной
специфичностью.
3. Представлены доказательства участия Оелка, обнаруживаемого МКА 3G7-F8, в механизмах пластичности развивакцего-ся и взрослого мозга.
Научная новизна работа. Впервые проведенная иммунизация развивающимся гишіокампом крысы с последущими инъекциями циклофосфамида позволила получить банк гибридом, продуцирующих МКА к "минорным" антигенам развивающегося мозга. С помодъю полученных МКА были обнаружены новые белки (антигены), специфичные для определенных типов нейронов и ранних этапов постнатального онтогенеза нервной ткани. Изучены особенности локализации обнаруженных антигенов в головном мозге крысы в процессе раннего постнатального онтогенеза. Установлено, что МКА 3G7-F8 оказывают влияние на развитие гиппокам-па In vitro. На модели длительной посттетанической потенциа-ции показано, что белки, специфичные для развивавшегося мозга, могут принимать участие в механизмах пластичности взрослого мозга.
Теоретическое и практическое значение. Полученные МКА могут быть использованы для типирования определенных групп .клеток в процессе постнатального развития мозга. Результаты, свидетельствующие о влиянии МКА на развитие органотипической культуры гиппокампа, имеют существенное значение для определения роли макромолекул в функционировании нервной ткани. Представлены и обобщены сведения о роли нейроспецифических белков в механизмах гластичности развивающегося и взрослого мозга. Совокупность полученных в работе данных подтверждает представление об общности механизмов нейрональной пластичности развивающегося и взрослого мозга.
Таким образом,-данная работа позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования нервной ткани и может представлять интерес для исследователей, работающих в области нейрофизиологии и нейрохимии. Полученные МКА могут быть использованы в клинической практике для обнаружения выявляемых ими антигенов в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных с патологией центральной нервной системы.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I съезде иммунологов России (Новосибирск,
1992); международном симпозиуме "Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга" -.(Санкт-Петербург, 1994); межинститутском семинаре Института медицинской и биологической кибернетики СО РАМН, Института физиологии СО РАМН и Конструкторско-технологического' института вычислительной техники СО РАН, Новосибирск.
. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы (29 -отечественных и 286 - иностранных источников). Работа содержит 3 таблицы и 29 рисунков.