Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Кальцинейрин 11
1.2. Мишени кальцинейрина и регулируемые им функции 20
1.3. Взаимодействие кальцинейрина с киназами и фосфатазами нейронов ... 24
1.4. Регуляторная роль кальцинейрина в синаптической передаче 30
1.5. Ритмическая активность периферических моторных синапсов и механизмы ее регуляции 33
1.6. Роль ферментов РКС, СаМКП, РКА и CaN в регуляции вызванной активности моторных синапсов 38
2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Объект исследования 43
2.2. Приготовление нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши 43
2.3. Электрофизиологическое исследование 43
2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных 46
2.5. Использованные в работе вещества 47
3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Влияние ингибиторов кальцинейрина (CaN) на спонтанную и вызванную 48 секрецию АХ в моторных синапсах мыши
3.2. Исследование эндогенных регуляторов активности CaN з
3.3. Кальциевые каналы L-типа и рианодиновые рецепторы (РиР) внутриклеточных кальциевых депо как мишени фосфатазной активности CaN..
3.4. Влияние «быстрого» и «медленного» Са2+-буферов ВАРТА-AM и EGTA-АМ на секрецию АХ в моторных синапсах мыши в условиях ингибирования активности CaN 74
3.5. Взаимодействие CaN и Са -зависимых протеинкиназ терминали 81
3.6. Антагонистические взаимодействия CaN и РКА в регуляции активности L 2+ 92
типа Са -каналов и секреции АХ
3аключение 105
Выводы 107
Список литературы
- Взаимодействие кальцинейрина с киназами и фосфатазами нейронов
- Роль ферментов РКС, СаМКП, РКА и CaN в регуляции вызванной активности моторных синапсов
- Электрофизиологическое исследование
- Кальциевые каналы L-типа и рианодиновые рецепторы (РиР) внутриклеточных кальциевых депо как мишени фосфатазной активности CaN..
Взаимодействие кальцинейрина с киназами и фосфатазами нейронов
Наиболее детально изучено влияние CaN на транскрипционные факторы семейства NFAT (Olson, Wihams, 2000; Musson, Smit, 2011) и CREB (Groth et al, 2003). В частности, любая, даже слабая активация NMDA-рецепторов глутаматом в гиппокампальных нейронах влечёт за собой деполяризацию постсинаптической мембраны и активацию расположенных там потенциал-зависимых Са -каналов L-типа. Вход Са именно по этим каналам приводит к активации кальцинейрина. CaN, предположительно, крепится к этим каналам при помощи якорных белков семейства АКАР, и его фосфатазная активность приводит к дефосфорилированию фактора NFATc4, перемещению его в ядро и началу транскрипции специфичных генов нейрона. При этом показано, что наряду с кальцинейрином, вход кальция по L-типу каналов активирует и Са -завивисимый фермент РКС, после чего оба фермента выполняют синэргичную роль в инициации транскрипции (Groth et al, 2003). Активность другого фактора - CREB также регулируется со стороны кальцинейрина, но опосредованно -через дефосфорилирование эндогенного ингибирующего белка (т.н. ингибитора-1 (И)), который в фосфорилированном состоянии подавляет другую фосфатазу - РР1. Кальцинейрин растормаживает активность фосфатазы РР1, которая в свою очередь, дефосфорилирует CREB и тем самым предотвращает его перемещение в ядро (Hagiwara et al., 1992; Groth et al, 2003).
Наряду с транскрипционными факторами, в нейронах и синапсах ЦНС мишенями CaN могут выступать ионные каналы и рецепторы нейронов, в частности, L-тип кальциевых каналов, рианодиновые рецепторы (РиР) и инозитол -1,4,5 - трифосфатные рецепторы (IP3R) внутриклеточных кальциевых депо, TRPVI-каналы, NMDA и АМРА-рецепторы (Cameron et al., 1995; Lin et al., 2000; Li et al., 2002; MacMillan et al., 2008; Por et al., 2010; Sanderson, Dell Acqua, 2011). 1.2.2.1. Кальцинейрин и потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа
На культуре пирамидальных нейронов гиппокампа была показана колокализация постсинаптических кальциевых каналов L-типа, РКА и кальцинейрина. По всей видимости, РКА и CaN оказывают антагонистическое влияние на потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа: в то время как киназное действие со стороны РКА потенцирует вход кальция по данному типу каналов, фосфатазная активность кальцинейрина препятствует этому (рис. 5). Причём для правильной работы этой функциональной связки необходимо прикрепление РКА и CaN к L-типу кальциевых каналов через якорный белок АКАР79/150 (Oliveria et al, 2007; Sanderson, Dell Acqua, 2011).
Антагонистическое влияние CaN (кальцинейрина) и PICA на L-тип (Cayl) кальциевых каналов в культуре нейронов гиппокампа (Oliveria et al., 2007). LZ- лейциновая застежка (место прикрепления АКАР79/150 к кальциевому каналу). Р - остаток фосфорной кислоты, связанный с одним из сайтов фосфорилирования L-типа кальциевых каналов. РКА (зелёная) и кальцинейрин (красный), находясь в непосредственной близости от L-типа кальциевых каналов за счёт их прикрепления к АКАР79/150, способны разнонаправлено влиять на один и тот же указанный сайт фосфорилирования этих кальциевых каналов. СаМ (синий) прикрепляется к С-концу L-типа кальциевых каналов и опосредует их кальций-зависимую инактивацию. Неизвестно, служит ли эта прикреплённая к L-типу каналов молекула СаМ для активации кальцинейрина, или же эту роль выполняет другая молекула СаМ. В недавних исследованиях на культуре гиппокампальных нейронов также показано участие CaN в регуляции активности потенциал-зависимых Са -каналов L-типа (Dittmer et al., 2014; Murphy et al., 2014).
В отличие от клеток гиппокампа и других нейронов, в сердце регуляция кальцинейрином активности L-типа каналов носит противоположную направленность: здесь кальцинейрин может напрямую (либо через якорный белок АКАР79/150) крепиться к а-субъединице L-типа каналов и, видимо, способствовать поддержанию этих каналов в открытом состоянии. При добавлении специфического ингибитора кальцинейрина - циклоспорина А - ток кальция по L-типу потенциал-зависимых каналов заметно снижается (Tandan et al., 2009).
Показано, что CaN принимает участие в регуляции активности кальциевых депо, а точнее, встроенных в их мембраны рецепторов - Са -активируемых рианодиновых рецепторов (РиР) и ГРЗ-рецепторов. Иммунофилин FKBP12 связывает кальцинейрин с рианодиновыми рецепторами и инозитол-3-фосфатными рецепторами (IP3R) нейронов (Cameron et al, 1995). Известно, что за счёт взаимодействия FKBP12 и IP3R происходит стабилизациия открытого состояния одиночного канала (добавление FK506, способного связывать FKBP12, к микросомам клеток мозжечка на 50% снижало заполнение Нечувствительного депо кальцием) и образование кластеров IP3R (Cameron et al, 1995; Dargan et al, 2002). В нейронах мозжечка также описана связь кальцинейрина с РиР через иммунофилин FKBP12 (Cameron et al., 1995). Взаимодействие кальцинейрина с РиР через FKBP12 нарушается ингибитором кальцинейрина FK506. Изучение кристаллической структуры комплекса кальцинейрин-РКВР12-иммуносупрессор FK506 выявило, что местом прикрепления комплекса FKBP12-FK506 является участок связывания CaN-A и CaN-B (MacMillan et al., 2008). В нейронах мозжечка крысы фосфатазная активность кальцинейрина подавляет работу IP3R и РиР, тем самым противодействуя активности РКС (Cameron et al., 1995). В скелетных мышечных волокнах ингибирование кальцинейрина циклоспорином сопровождается усилением вызванного кофеином выброса кальция из депо, то есть в мышце кальцинейрин также способен подавлять активность РиР. Такое взаимодействие кальций-зависимой фосфатазы и РиР саркоплазматического ретикулума скелетных мышц, является, скорее всего, одним из способов регуляции активности РиР за счет концентрации кальция в цитоплазме (Shin et al., 2002). Таким образом, на сегодня известны примеры участия кальцинейрина в регуляции 9+ -ж—ж Са - и других ионных каналов. При этом, всё чаще в описаниях регуляторной активности кальцинейрина присутствует факты синергичного или антагонистического действия на эти же мишени со стороны Са -зависимых и других киназ.
Роль ферментов РКС, СаМКП, РКА и CaN в регуляции вызванной активности моторных синапсов
Мыши умерщвлялись посредством быстрого обезглавливания. Декапитированную мышь закрепляли в препаровальной ванночке брюшной стороной вверх и проводили вскрытие брюшной и грудной полости так, чтобы удобно просматривалась диафрагмальная мышца. Затем отпрепаровывали веточку диафрагмального нерва, иннервирующую левую половину диафрагмы. Левую половину диафрагмальной мышцы изолировали из тела животного - для этого проводили разрез вдоль нижней линии ребер чуть выше уровня прикрепления диафрагмы и разрез вдоль срединного сухожилия. Изолированный нервно-мышечный препарат помещали в экспериментальную камеру объёмом 3 мл, перфузируемую физиологическим раствором Лайли для теплокровных животных (мМ): NaCl - 135,0, КС1 - 4,0, СаС12 - 2,0, MgCl2 -1,0, NaH2P04 - 1,0, NaHC03 - 16,0, глюкоза - 11,0. Раствор аэрировали карбогеном (95%02/5%С02), рН раствора доводили до 7,2-7,4.
Препарат растягивали и фиксировали на подложке камерки (Sylgard) с помощью энтомологических булавок. Такой препарат, с сохраненной целостностью мышечных волокон («интактный» нервно-мышечный препарат) использовали для исследования спонтанной активности синапсов. При регистрации вызванных потенциалов концевой пластинки дополнительно проводили рассечение мышечных волокон с целью предотвращения их сокращений в ответ на электрическую стимуляцию диафрагмального нерва (п. phrenicus) (Barstad, Lilleheil, 1968; Flink, Atchison, 2003). Для изготовления т.н. «рассечённого» нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши на расстоянии примерно 2 мм от места прикрепления мышцы к ребру и от сухожилия располагали по второму ряду тонких энтомологических булавок. Расстояние между булавками составляло не больше 2-3 мм, чтобы они могли поддерживать натяжение препарата. Далее скальпелем делали поперечный разрез мышечных волокон в двух местах: 1) на участке между рядом булавок, фиксирующих диафрагму совместно с небольшой частью рёбер, и ближайшим рядом тонких булавок, воткнутых непосредственно в мышцу и 2) на участке между булавками, фиксирующих сухожилие левой половины диафрагмы, и ближайшему к ним ряду тонких булавок. Сразу после поперечного рассечения мышечных волокон (до начала регистрации синаптических ответов) нервно-мышечный препарат непрерывно промывали при комнатной температуре на протяжении не менее 1 ч в значительном объёме (более 250 мл) раствора Лайли (Santafe et al., 2006).
В результате этой процедуры предотвращается возможное блокирование проведения потенциала действия по нерву в ходе эксперимента, а значение мембранного потенциала (МП) стабилизируется на сниженном (по сравнению с нерассеченными волокнами) уровне (Blake, Dretchen, 1980; Flink, Atchison, 2003; Santafe et al., 2006). Значения МП у мышечных волокон диафрагмы мыши после их рассечения и промывки варьировали в диапазоне от -38 до —45 мВ и оставались стабильными, не меняясь достоверно на протяжении 1-1,5 ч регистрации синаптических сигналов; соответственно отсутствовало и падение МП у мышечных волокон в течение эксперимента. Все эксперименты проводились при температуре 20-22С.
Для внутриклеточного отведения биопотенциалов использовали стандартную микроэлектродную технику. Регистрация проводилась с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных 2,5 М КС1 (сопротивление кончика микроэлектрода составляло 15-20 МОм). В стеклянный микроэлектрод вставляли отводящий электрод, представляющий собой серебряную проволочку, покрытую слоем хлористого серебра, что обеспечивало отсутствие поляризации входе эксперимента. Индифферентный электрод представлял собой аналогичную неполяризующуюся систему без микроэлектрода, которую помещали в омывающий мышцу раствор. В каждом исследованном синапсе приблизительно в течении 100 сек регистрировали спонтанную активность в виде миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП). Раздражение нерва проводили хлор-серебряными проволочными электродами сверхпороговыми электрическими стимулами длительностью 0,1 мс. В зависимости от выбранного режима раздражения нерва, проводили регистрацию вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП) либо при стимуляции нерва одиночными стимулами с частотой 0,3 Гц, либо короткими (1 секунда) ритмическими пачками импульсов с частотой 50 Гц.
При высокочастотной стимуляции нерва (50 Гц, 1 с) использовался отработанный нами режим работы с перерывами не менее 4 мин между стимуляциями. Такой режим работы синапсов диафрагмальной мышцы обеспечивал стабильность параметров ПКП, рисунка залпов ПКП и полностью предохранял от возможности закономерного падения амплитуд ПКП и МПКП у разных синапсов одной мышцы по ходу эксперимента за счет утомления синапсов или десенситизации мышечных никотиновых холинорецепторов.
Сигналы регистрировали при помощи усилителя Axoclamp2B (Molecular Devices, США) или Neuroprobe Amplifier Model 1600 (AM Systems, США) и записывали их с помощью аналого-цифровых преобразователей Е154 (L-Card, Россия) с интерфейсом PowerGraph на жесткий диск компьютера для последующего анализа в программе MiniAnalysis (Synaptosoft, США).
В контроле регистрировали МПКП и ПКП от 5 и более разных синапсов, после чего в перфузионный раствор в определенном порядке добавляли исследуемые вещества, и далее регистрировали активность разных синапсов на протяжении 1-2 ч. При этом постоянно проводился мониторинг мембранного потенциала на всем протяжении регистрации сигналов в каждом отдельном синапсе, при снижении значения мембранного потенциала более чем на 5 мВ регистрация прекращалась и сигналы от данного синапса не включались в выборку для дальнейшего анализа. В данной работе использовались также проникающие через клеточную мембрану ацетометокси-производные (-АМ) кальциевый буферов ВАРТА-AM и EGTA-AM. Попадая в цитоплазму, радикал -AM отщепляется от молекулы буфера неспецифическими эстеразами (Tsien, 1980). Для нагрузки терминали буферами мышцу инкубировали в течение 2-х часов в бескальциевом растворе (Са 0 мМ, Mg/+ 3,2 мМ), содержащем 50 мкМ ВАРТА-AM или 50 мкМ EGTA-AM. По истечении двух часов раствор заменяли на бескальциевый раствор, не содержащий буфер и в течении 15 минут проводили отмывку. Затем омывающий раствор заменяли на нормокальциевый (Са2+ 2,2 мМ, Mg2+ 1,0 мМ) и приблизительно через 20-30 после этого начинали регистрацию активности синапсов (Urbano, Uchitel, 1999).
В каждой серии экспериментов использовали не менее трёх нервно-мышечных препаратов. Амплитуду зарегистрированных ПКП корректировали на нелинейность суммации отдельных квантов в составе ПКП по формуле: Акорр=А/(1-(0,8 А/Е)) где Акорр - скорректированная в отношении нелинейной суммации амплитуда ПКП, А - некорректированная амплитуда ПКП, Е - мембранный потенциал (McLachlan, Martin, 1981; Flink, Atchison, 2003, Penssinotti, Uchitel, 2010; Gaydukov et al., 2012a).
На основе корректированной амплитуды ПКП и амплитуды МПКП также рассчитывали квантовый состав (КС) ПКП, используя прямой метод - Акорр(ПКП)/Аср (МПКП) (Del Castillo, Katz, 1954), где Аср (МПКП) - средняя амплитуда МПКП в данном синапсе. Для МПКП проводили оценку их частоты и временных параметров.
Электрофизиологическое исследование
ТМВ-8 приводил к достоверному снижению амплитуды ПКП в залпе почти на 20% по сравнению с контролем и данный эффект был выражен на протяжении всего залпа ПКП. Однако, КС ПКП при этом не претерпевал достоверных изменений по сравнению с контролем. Согласно нашим предположениям, это происходит за счет параллельного уменьшения амплитуды МПКП в результате постсинаптического действия ТМВ-8. При этом оказалось, что в присутствии ТМВ-8 ингибирование CaN циклоспорином А не приводит к увеличению амплитуды и квантового состава ПКП.
Амплитуда ПКП в залпе на фоне действия CsA в присутствии ТМВ-8 оставалась достоверно сниженной на 20%, а КС ПКП не менялся по сравнению с контролем - как это было и при действии одного ТМВ-8 (в контроле КС ПКП1 в залпе составил 32,33±2,69, на фоне действия ТМВ-8 он равнялся 33,32±1,94, а на фоне действия CsA в присутствии ТМВ-8 - 34,59±1,5) (рис. 21).
Таким образом, предварительное блокирование выброса Са из внутриклеточных Са -депо через РиР при помощи ТМВ-8 полностью предотвращает усиление вызванной активности, которое наблюдалось нами в предыдущих экспериментах при действии CsA.
Совокупность полученных данных позволяет заключить, что при таком (ранее не известном) способе растормаживания L-типа каналов - путём ингибирования CaN -происходит активация РиР и выброс депонированного кальция. Причём, судя по полученным результатам, увеличение амплитуды и КС ПКП происходит только при совместной активации L-типа кальциевых каналов и РиР, так как блокирование каждого из них по отдельности полностью предотвращало эффект растормаживания секреции медиатора при действии CsA.
Поскольку при ингибировании CaN активируются как каналы L-типа, так и РиР, формально нельзя исключить, что мишенью фосфатазной активности кальцинейрина могут быть не только Са -каналы L-типа, но и РиР Са -депо. В ЦНС известны примеры прямой сцепки CaN и РиР (Cameron et al., 1995), но ещё более широко описано заякоривание данной фосфатазы в непосредственной близости от L-типа Са -каналов при помощи белков семейства АКАР (Dittmer et al., 2014; Murphy et al., 2014). Считается, что в последнем случае близкое соседство с Са -каналами L-типа позволяет CaN узколокально дефосфорилировать данные каналы по определённым сайтам, и тем самым влиять на их активность (Dittmer et al., 2014; Murphy et al., 2014). В то же время, на кардиомиоцитах уже давно показано, что вход Са по L-типу Са 9+ каналов служит триггером для выброса Са из внутриклеточных депо через РиР, что и обеспечивает генерализованный подъём концентрации Са в цитоплазме. Данное 9+ 9+ явление получило название Са -зависимого выброса Са и обеспечивается функциональным сопряжением между РиР и каналами L-типа (Endo, 2009).
Подобная функциональная сцепка между РиР внутриклеточных Са -депо и L-типом каналов описана в настоящее время не только в мышечных клетках, но и в ряде нейронов (Chavis et al., 1996, Mouton et al., 2001; Welsby et al., 2006; Kim et al., 2007), в том числе, в терминалях моторных синапсов мыши при других способах растормаживания L-типа Са -каналов, не связанных с блокадой кальцинейрина (Gaydukov et al, 2009). Она позволяет сопрячь вход Са из внеклеточной среды по 9+ 9+ потенциал-зависимым Са -каналам с выбросом Са через РиР и модуляцией выброса медиатора. Нельзя исключить также и возможность прямой физической сцепки между РиР и Са -каналами L-типа, как это хорошо известно для РиР и дигидропиридиновых рецепторов скелетных мышечных волокон (Robin, Allard, 2012, Ни et al, 2015). Подобная физическая сцепка описана также между РиР и Са -каналами в нервных терминалях нейронов магноцеллюлярного ядра, и показано участие этой структурно и функционально сопряженной системы в усилении секреции медиатора (De Crescenzo et al., 2006).
Вполне вероятно, что и в случае активации L-типа Са -каналов при ингибировании CaN, вход Са по ним сам по себе не оказывает влияния на вызванную секрецию АХ, а служит лишь тригерром для активации РиР и выброса кальция через рианодиновые рецепторы депо, и именно этот кальций приводит к усилению Са -зависимого вызванного выброса АХ. Действительно, в настоящее время показано, что в моторных нервных терминалях диафрагмы мыши L-тип Са -каналов пространственно удален от активных зон и мест докинга везикул (в отличие от Са -каналов P/Q-типа) (Polo-Parado et al., 2001; Flink, Atchison, 2003). Поэтому, возможно, активация РиР и последующий выброс депонированного Са является необходимым условием для усиления вызванного выброса АХ в случае растормаживания работы L-типа Са -каналов.
Для оценки дистанции между разными входами Са и кальциевыми сенсорами используют экзогенные кальциевые хелаторы (буферы) с разной скоростью связывания кальция, но сравнимым аффинитетом. Кальциевые буферы способны угнетать синаптическую передачу, прерывая поток Са от кальциевого источника к сенсору, регулирующему экзоцитоз (Burnashev, Rozov, 2005). Степень угнетения синаптической активности зависит от концентрации буферов, скорости связывания кальция и расстояния между входом кальция и его сенсором. Если это расстояние мало ( 100 нМ), то только «быстрый» буфер, обладающий высокой скоростью связывания, будет эффективно влиять на секрецию медиатора. Если же расстояние между исследуемым источником Са и кальциевым сенсором экзоцитоза велико (сотни нм), то оба типа буферов - «быстрый» и «медленный» - будут эффективны (Eggermann, Jonas, 2011; Eggermann et al, 2011).
Установленная нами потенциальная мишень действия CaN - L-тип Са -каналов -находится, как считается, вдали от активных зон (Polo-Parado et al., 2001; Flink, Atchison, 2003), поэтому усиление секреции АХ при его растормаживании должно сниматься действием и ВАРТА-AM, и EGTA-AM.
В связи с этим мы задались вопросом, как скажется на эффектах блокирования CaN предварительная нагрузка терминалей экзогенными кальциевыми буферами: ВАРТА-АМ («быстрый») и EGTA-AM («медленный»). Согласно данным литературы, ВАРТА 75
AM в микромолярных концентрациях эффективно снижает концентрацию ионов кальция на расстоянии, близком от устья канала, причём ещё во время его открытого состояния (Muller et al., 2007; Parekh, 2008). EGTA-AM способен воздействовать на диффундирующее кальциевое облако лишь после закрытия кальциевого канала на расстояниях порядка 500-1000 нм (Ward, Kenyon, 2000). Основываясь на различиях в действии этих двух экзогенных буферов на кальциевые входы и образуемые ими кальциевые домены, можно выдвигать предположения о степени удалённости от активных зон места входа кальция или характере активации кальций-зависимых ферментов.
При выборе концентраций кальциевых буферов мы опирались на исследования их дозозависимого влияния на секрецию АХ, проведённые ранее в нашей группе, в рамках которых было установлено, что 2-х часовая загрузка ВАРТА-AM в концентрации 50 мкМ оказывает максимальный эффект на вызванную секрецию медиатора (Скитева и др., 2010).
Кальциевые каналы L-типа и рианодиновые рецепторы (РиР) внутриклеточных кальциевых депо как мишени фосфатазной активности CaN..
Отсюда следует, что активация А2А-типа рецепторов эндогенным аденозином имеет место в терминалях и необходима для растормаживания Са -каналов L-типа при ингибировании CaN и последующего усиления секреции АХ. Таким образом, мы не подтвердили общепринятое представление об активации эндогенным аденозином только тормозных А1-рецепторов при работе синапсов в условиях кратковременной высокочастотной ритмической активности (Perissinotti et al, 2010; Garcia et al, 2013; Tomas et al, 2014). Оказалось, что А2А-рецепторы также активируются эндогенным аденозином, так как при их блокировании не проявляется потенциация секреции АХ на фоне растормаживания входа Са по каналам L-типа.
Необходимо отметить, что действие антагониста А2А-рецепторов повторяло картину действия ингибитора РКА, то есть само по себе оно никак не сказывалось на секреции АХ, но предотвращало увеличение КС ГЖП при ингибировании CaN. Данный факт указывает на связь между активацией А2А-рецепторов и активностью РКА, направленной на регуляцию L-типа Са -каналов и секрецию АХ.
Аппликация экзогенного агониста А2А-рецепторов CGS-21680 (1 мкМ) приводила к достоверному увеличению КС каждого ГЖП в залпе на 18-20% по сравнению с контролем (для первого ГЖП в залпе КС составил 33,29±1,41 (п=19) в контроле и 39,42±1,81 (п=28, р 0,05) на фоне CGS-21680) (рис. 33, рис. 34). Иными словами, дополнительная активация рецепторов А2А-типа при помощи CGS-21680 способна привести к существенному усилению секреции АХ в ритмически активных нервно-мышечных синапсах мыши, несмотря на присутствие активности CaN в терминалях. В экспериментах с использованием меченного Н-АХ на нервно-мышечных синапсах крысы были получены созвучные данные, подтверждающие способность CGS-21680 усиливать выделение медиатора в ответ на стимуляцию нерва (Oliveira, Correa-de-Sa, 2005).
Модулирование активности А2А-рецепторов. Усреднённые записи ПКП1 в залпе А) в контроле (п=21) и на фоне 10 нМ ZM241385 (п=18) Б) в контроле (п=19) и на фоне 1 мкМ CGS-21680 (п=28). Нам предстояло выяснить, осуществляется ли данный эффект CGS-21680 благодаря усиленной активации РКА, преодолевающей тормозное действие CaN на L-тип Са -каналов и облегчающей их работу. Для этого мы исследовали действие CGS-21680 при селективном ингибировании РКА при помощи Н-89 или блокировании Са -каналов L-типа нитрендипином.
На фоне блокады РКА активация А2А-рецепторов при помощи CGS-21680 не приводила к увеличению КС ПКП в залпе (рис. 35, рис. 37). Помимо этого, прирост КС ПКП, наблюдаемый при аппликации CGS-21680, возвращался к контрольному уровню при добавлении 1 мкМ нитрендипина (рис. 36, рис. 37). То есть, в терминалях нервно-мышечных синапсов мыши присутствует следующий каскад: А2А-рецепторы— РКА— Ь-тип Са -каналов. В работах других групп также было показана роль CGS-21680 в усилении секреции АХ (Oliveira et al., 2004; Oliveira, Correia-de-Sa, 2005), но нами бьши впервые предоставлены электрофизиологические доказательства участия РКА и L-типа Са -каналов в потенциации секреции АХ при короткой залповой активности синапсов.
Как нами было показано ранее, L-тип Са -каналов может являться отнюдь не конечным звеном цепочки, приводящей к усилению вызванного выброса АХ в нервно-мышечных синапсах мыши. Неоднократно была продемонстрирована роль выброса депонированного Са через РиР в облегчении секреции медиатора, сопряженной с «демаскированием» Са -каналов L-типа (Gaydukov et al., 2009). В связи с этим, мы решили проследить участие внутриклеточных Са -депо в потенциации секреции АХ при активации А2А-рецепторов экзогенным агонистом.
В отдельной серии экспериментов мы показали, что блокирование РиР рианодином 3 мкМ также предотвращает вызываемое CGS-21680 облегчение секреции АХ (рис. 38).
Таким образом, дополнительная активация А2А-рецепторов и РКА приводит к сдвигу баланса воздействий на L-тип Са -каналов в сторону облегчающего влияния на них со стороны РКА, и это лежит в основе дальнейшей активации РиР, выброса депонированного кальция через РиР и усиления секреции АХ.
Следующая серия подтвердила наше предположение о равноценности двух способов растормаживания L-типа Са -каналов (и усиления секреции АХ): либо путем блокирования активности CaN, либо путем избирательного усиления активности РКА. Мы показали, что на фоне предварительного растормаживания входа Са по каналам L 100
Учитывая обнаруженный нами баланс тормозно/возбуждающих ферментативных воздействий на L-тип Са -каналов, становится ясным, что активность L-типа Са -каналов, скорее всего, находится под одновременным контролем сразу нескольких метаболических путей, запускаемых и контролируемых с участием разных пресинаптических рецепторов и ферментов. При этом баланс влияний на L-тип каналов может быть выражен по-разному. Действительно, в литературе в настоящее время описаны случаи, когда L-тип Са -каналов расторможен в моторных синапсах и может функционировать наряду с P/Q-типом Са -каналов. Например, на ранних стадиях постнатального созревания синапсов или при регенерации зрелых моторных синапсов в ходе реиннервации мышцы (Богачёва, Балезина, 2012; Sugiura, Ко, 1997; Santafe et al., 2001), а также при ряде патологических состояний синапсов, например, при синдроме Ламберта Итона (Nudler et al, 2003). Однако во всех этих случаях до сих пор не определена активность CaN и остается не известной его роль в модуляции активности L-типа каналов.