Введение к работе
Актуальность прблемн. im,К-АТФаза (ІГа -насос) (К..3.6. I.Заявляется объектом интенсивного изучения и играет (Тундамен-тальную роль в клеточной физиологии, а также в развитии различных заболеваний, в том числе сердечной недостаточности. Несмотря на важность понимания для клеточной биологии нормальной регуляции и патологии Пп-насоса, мало известно о его регуляции на мембранном уровне* Имеются указания на то, что ингибирование На,К -АТФ-азной активности миокарда ацетилхолином, возможно, связано со стимуляцией мускариновък холинорецепторов (м-ХР). 3 силу того, что мускариновые холинорецепторы функционально сопряжены в плазматической мембране с регуляторними ГТШ-связывающиш белками (G-белками), полно предполагать участие этих белков в опосредовании модуляции ИаД-АТФазной активности агонистами ыускарнновых. холинорецепторов. В этой связи,' исследование роли ГЙ-связываще-го белка в регуляции ко.к-АТФазной активносги сарколеммы миокарда, опосредованной активацией мускаринового холинорецептора, представляется актуальной проблемой. Для решения этого вопроса плодотворным будет использование мембранных препаратов сарколеммы, представляющих собой физиологическую модель процессов возбудимости клетки миокарда.
Цель и задачи исследования. Целью работы было: исследовать мембранный механизм ингибирования їїв.к-АТФазной активности сарколеммы миокарда кролика и собаки холинёргическими агониста-ми через ГТФ-связывайщий белок» Исходя из поставленной цели, бы- ' ли сформулированы следующие задачи:
I) исследовать влияние холинергических агонистов на актив-іость гта.к-АТФазы и-ее Частной реакции, уабаин-чувствительной ^-активируемой 4-нитрофенилфосфатазной активности (К-п-НФФази) препаратов сарколеммы желудочков сердца собаки и кпог-иия „ =—-
2 вить зависимость их эффекта от гуаниловых нуклеотидов ; .
-
выяснить влияние различных модуляторов ИФ-связывающих белков (гуаниловых нуклеотидов, и-этилмалеимида, лы^ и коклюшного токсина) на активность Иа,К-АТФазы и К-п-ШФазы сарколеммы миокарда ;
-
провести иммунохимическую идентификацию сх-субъединицы ингибиторного РТФ-связыващего белка ( а^белка) в препаратах сарколетш микарда ;
-
доказать существование в мембране функционального сопряжения между м-ХР, ГТФ-свяэывающим белкой и 1:а,К-АТФазой путем реконструкции этой системы из отдельных компонентов сарколетш микарда.
Научная новизна. Установлено, что активация мускарщовых холинорецепторов в везикулярных препаратах сарколеммы миокарда собаки и кролика, с нарушенной аламетищшом проницаемостью мембраны, вызывает ингибирование активности Ка,К-АТФазы в результате функционального сопряжения в мембране фермента с ГТФ-свя-зыващим белком, йнгибирущий эффект ацетилхолина проявляется только в присутствии ГТф или его стабильных аналогов. Снижение їїа,к-АІФазной активности может быть вызвано стабильным аналогом ПФ даже в отсутствие ацетилхолина. С помощью коклюшного токсина, специфических антисывороток и метода реконструкции функционального сопряжения между Ыа.к-АТФазой и ПФ-связываю-щим белком с использованием очищенных белковых препаратов из сарколеммы миокарда, показано участие ГТФ-связывающего белка в передаче сигнала от муёкаринового холинорецептора на їГа,к-АТФа:
Разработана система подходов для регистрации ингибирующе-го и активирующего эффектов холщергических агонистов на На,к-АТФазную активность препаратов сарколеммы миокарда желудочков.
Разработан методический подход для анализа агонист-стиму-
лируемого связывания гуашілових нуклеотидов с ГП-связызающим белком по изменению активности На,к-АТазы в условиях нативного мембранного окружения.
.Теоретическое и практическое значение работы. Р езультаты проведенных исследований дают новые представления о регуляции активности натриевого насоса в миокарде. Сочетание различных методических подходов, использованных в данной работе, может найти применение при исследовании регуляции других мембранных ферментов. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе рецептор-сопряжекноі* системы, включающей мускариновый холиноре-цептор, ГТФ-связнваюіциії белок- и No, к-АТЗгазу, будет способствовать развитию терапевтических стратегий для лечения ряда заболеваний сердца..
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Проведена идентификация ГТФ-связывакщего белка, осуществляющего передачу сигнала от ыускаринового холинорецептора на На,к -АТФазу.
-
Доказано существование в мембране функционального сопряжения мускаринового холинорецептора, ГТФ-связыващего белка и и»,х -АТФазы.
Апробация работы. Результаты работы'были доложены на III и ІУ Всесоюзных конференциях "Физиология и биохимия кедиатор-ных процессов" (Москва, I960, 1985), III и ГУ конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана (Душанбе,І98Г; Ашхабад,1986), I и II Съездах физиологов Казахстана (Алма-Ата,1988 ; Караганда, 1992), Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси,1989),
Публикации. По теме диссертации опубликовано II научных работ, полный перечень которых приведен з конце автореферата.
4 Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 308 источников. Работа изложена на страницах, содержит 3 таблицы и 24 рисунка.