Роль ERK 1/2 киназ в регуляции нигростриатных взаимодействий у крыс с повышенной судорожной готовностью Дорофеева Надежда Алексеевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Эпилепсия и эпилептиформные состояния 12

1.2. Система базальных ганглиев и ее роль в эпилептиформной активности мозга

1.2.1. Роль стриатума в системе базальных ганглиев. 15

1.2.2. Принцип регуляции моторной активности базальными ганглиями 19

1.3. Основные нейромедиаторные системы базальных ганглиев 21

1.3.1. Глутаматергическая система 21

1.3.2. ГАМК-ергическая система 24

1.3.3. Дофаминергическая система 27

1.3.3.1 Рецепторы дофамина 28

1.4. ERK1/2 киназы 31

ГЛАВА 2. Материалы и методы 36

2.1. Экспериментальные модели 36

2.2. Обработка материала

2.2.1. Иммуногистохимический метод 38

2.2.2. Иммуннофлуоресцентный метод 39

2.2.3. Вестерн-блот анализ

2.3. Морфофункциональный анализ материала 41

2.4. Статистический анализ результатов 42

Глава 3. Результаты 43

3.1. Анализ морфофункционального состояния нигростриатной системы крыс линии Крушинского-Молодкиной и крыс линии Вистар 43

3.1.1. Активность ERK1/2 киназы в нигростриатной системы крыс линии КМ 43

3.1.2. Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ 47

3.1.3. Морфофункциональный анализ ГАМК-ергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ 51

3.1.4. Морфофункциональный анализ дофаминергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ 54

3.2. Морфофункциональный анализ нигростриатной системы крыс линии КМ при воздействии специфическим звуковым сигналом 56

3.2.1. Изменение активности ERK1/2 киназ в ЧС и стриатуме крыс КМ, при предъявлении звукового сигнала 57

3.2.2. Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов стриатума и ЧС крыс КМ, при предъявлении звукового сигнала

3.2.3. Морфофункциональный анализ ГАМК-ергических нейронов нигростриатной системы крыс КМ, при предъявлении звукового сигнала 61

3.2.4. Морфофункциональный анализ дофаминергических нейронов нигростриатной системы крыс КМ, при предъявлении звукового сигнала 64

3.3. Морфофункциональный анализ нигростриатной системы крыс линии КМ при введении ингибитора активности ERK1/2 киназ 67

3.3.1. Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов стриатума и ЧС крыс линии КМ в ответ на введение SL-327 71

3.3.2. Морфофункциональный анализ ГАМК-ергических нейронов нигростриатной системы крыс КМ в ответ на введение SL-327 73

3.3.3. Морфофункциональный анализ дофаминергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ в ответ на введение SL-327 76

ГЛАВА 4. Обсуждение 79

4.1. Особенности нигростриатной системы крыс линии КМ в сравнении с крысами линии Вистар 79

4.2. Изменение состояния нигростриатной системы крыс линии КМ в ходе судорожного припадка 89

4.3. Влияние инактивации ERK1/2 киназ на состояние нигростриатной системы крыс линии КМ 96

Заключение 103

Выводы 105

Список сокращений 107

Список использованной литературы 108

• Глутаматергическая система
• Иммуннофлуоресцентный метод
• Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ
• Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов стриатума и ЧС крыс линии КМ в ответ на введение SL-327

Введение к работе

Актуальность проблемы. Эпилепсия - одно из распространенных неврологических заболеваний, которым страдают 0,5-1% мирового населения (Hauser, 1994). Эпилептиформные состояния обусловлены нарушением механизмов, которые обеспечивают баланс между возбуждающими и тормозными системами мозга - дофамин-, глутамат- и ГАМК-ергическими, в том числе, в базальных ганглиях. Нарушение взаимодействия этих систем может происходить на уровне нарушения синтеза нейромедиаторов, их рецепторного связывания и на уровне выведения за счет изменения в процессах экзоцитоза (Bradford, Peterson, 1987; Scharfman, 2007). Одним из координирующих механизмов влияния дофамина и глутамата на активность ГАМК-ергических нейронов стриатума является ERK1/2 сигнальный каскад (Valjent et al., 2000; Guerrero et al., 2002; Chen et al., 2004; Nateri et al., 2007). В настоящее время изучение ERK1/2 становится все более актуальным. Показан большой вклад этих киназ в этиологию многих заболеваний (Nozaki et al., 2001; Nateri et al., 2007; Xi et al., 2007; Li et al., 2010). На различных моделях было показано, что ERK1/2 киназы и связанные с ними внутриклеточные механизмы играют важную роль в формировании различных форм эпилепсии у человека и животных (O'Sullivan et al., 2008; Lindgren et al., 2009; Osterweil et al., 2010; Glazova et al., 2015). Большая часть этих данных была получена при анализе гиппокампа, коры и др. отделов ЦНС, и мы не обнаружили в литературе фактов, подтверждающих участие ERK1/2 киназ в регуляции активности нейронов нигростриатной системы при эпилептиформных состояниях. Однако показано, что связывание D1 рецептора дофамина вызывает активацию ERK1/2, что, в свою очередь, повышает активность NR2B субъединицы NMDA рецептора (Greengard, 2001; Lee et al., 2002). Стимуляция кортикостриатальных проекций вызывает активацию фосфорилирования ERK1/2 киназ в D2-позитивных нейронах стриатума (Sgambato et al., 1998; Gerfen et al., 2002; Kotecha et al., 2002; Bertran-Gonzalez et al., 2008), что позволило нам предположить участие киназ в регуляции как D1 зависимого - проэпилептического, так и D2 зависимого – противоэпилептического путей регуляции ГАМК-ергических нейронов черной субстанции (ЧС).

ERK1/2 киназы оказывают влияние на процессы биосинтеза нейромедиаторов. Например, они являются одним из факторов активации тирозингидроксилазы (ТГ), фосфорилируя ее по серину-31 (Haycock et al., 1992). ERK1/2 киназы могут регулировать не только интенсивность фосфорилирования ТГ, но и влиять на экспрессию гена ТГ, что приводит к усилению биосинтеза дофамина (DeCastro et al., 2005; Shah et al., 2006; Bjrklund, Dunnett, 2007). ERK1/2 киназы могут принимать участие в регуляции нейрональной активности также на этапе выведения нейротрансмиттеров за счет активации синтеза и/или активности белков экзоцитоза, в частности, фосфорилируя Synapsin I (Murray et al., 1998; Longuet et al., 2005; Vara et al., 2009; Benagiano et al., 2011). При этом показано, что белки экзоцитоза вносят существенный вклад в процесс эпилептогенеза (Yamagata et al., 1995; Garcia et al., 2004; Etholm, Heggelund, 2009; Fassio et al., 2011; Ketzef et al., 2011).

ERK1/2 является также важным компонентом, вызывающим индукцию

глутаматергической синаптической активности, которая определяется, в том числе, усилением экспрессии VGLUT2 (Doyle et al., 2010), одного из маркеров интенсивности выведения глутамата. Кроме того, известна связь между нарушением экспрессии VGLUT2 и повышенной судорожной активностью (Schallier et al., 2009). Однако, несмотря на все вышеприведенные данные, роль

Список сокращений: нБШ – наружний сегмент бледного шара, ГАМК - гамма-аминомасляная кислота, крысы КМ – крысы линии Крушинского-Молодкиной, ТГ – тирозингидроксилаза, ЧС – черная субстанция, кЧС – компактная часть черной субстанции, рЧС – ретикулярная часть черной субстанции, D1 – рецептор дофамина D1, D2 – рецептор дофамина D2, ERK1/2 - extracellular-signal-regulated kinases 1 and 2, GAD65/67 - glutamic acid decarboxylase 65/67 (глутаматдекарбоксилаза 65/67), MEK - mitogen-activated protein kinase kinase (MAPK/ERK kinase) (киназы митогенактивитуемого протеинкиназного каскада), NR2B - N-methyl-D-aspartate, n-метил-d-аспартат рецептор, VGLUT2 - Vesicular glutamate transporter 2 (везикулярный транспортер глутамата 2).

ERK1/2 киназ в регуляции дофамин-, глутамат- и ГАМК-ергических нейронов в базальных ганглиях при эпилептиформных состояниях в настоящее время остается неясной. С другой стороны, возможность использования функций ERK1/2 и его блокаторов в фармакологии рассматривается рядом авторов (Sebolt-Leopold, Herrera, 2004; Nateri et al., 2007), и мы предположили возможность влияния ингибиторов киназ на характер протекания судорожного припадка и молекулярные механизмы его регуляции.

В настоящее время для изучения механизмов формирования эпилептиформной активности
широко используются экспериментальные модели аудиогенной эпилепсии на животных, имеющих
генетическую предрасположенность к судорожным припадкам. Одной из таких

экспериментальных моделей являются крысы инбредной линии Крушинского-Молодкиной (крысы КМ) (Крушинский, 1960). Крысы линии КМ, характеризующиеся двухволновым клонико-тоническим припадком, который возникает у них в ответ на звук высокой мощности, были получены на основе аутбредной популяции крыс линии Вистар.

Целью настоящего исследования является изучение роли ERK1/2 киназ в регуляции активности глутамат-, ГАМК- и дофаминергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ при формировании аудиогенной эпилептиформной активности.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи.

1. Сопоставить уровень активности ERK1/2 киназ и морфофункциональные показатели состояния глутамат-, ГАМК- и дофаминергических нейронов в нигростриатной системе крыс линии КМ и крыс линии Вистар.

2. Оценить характер изменений активности ERK1/2 киназ в нигростриатной системе крыс линии КМ на разных стадиях судорожного припадка.

3) Оценить роль ERK1/2 киназ в регуляции активности глутамат-, ГАМК- и
дофаминергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ на разных стадиях
судорожного припадка.

4. Оценить влияние интраперитонеального введения блокатора ERK1/2 киназ SL327 в дозах 25мг/кг и 50мг/кг крысам линии КМ на характер аудиогенного судорожного припадка.

5. Выявить изменения в активности глутамат-, ГАМК- и дофаминергической нейронов ЧС и стриатума крыс линии КМ в ходе аудиогенного судорожного припадка при инактивации ERK1/2 киназ.

Научная новизна. Впервые показано, что у крыс, склонных к аудиогенным эпилептиформным припадкам, по сравнению с крысами линии Вистар значительно увеличена активность ERK1/2 киназ в ЧС и стриатуме. Отмечено, что, несмотря на это, интенсивность фосфорилирования Synapsin I у интактных крыс линии КМ ниже, чем у крыс линии Вистар. У крыс КМ впервые выявлена высокая активность D1-зависимого пути регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС на фоне более интенсивного, чем у Вистар, уровня ERK1/2-зависимого фосфорилирования ТГ в нигростриатной системе. Кроме того, впервые показано, что у крыс линии КМ активен также и D2-зависимый путь. Впервые показано, что при предъявлении крысам линии КМ специфического звукового сигнала происходит увеличение активности ERK1/2 киназ в стриатуме и в ЧС. При этом активность Synapsin I также увеличивается, что приводит к усилению выведения глутамата в стриатуме. Впервые выявлено, что на стадии клонико-тонических судорог у крыс КМ снижается активность D1 и D2-зависимых путей регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС.

Впервые показано, что инактивация ERK1/2 киназ приводит к дозозависимой отмене эпилептиформного припадка или ослаблению его интенсивности у крыс с повышенной судорожной готовностью. В ЧС и стриатуме крыс КМ при применении SL327 происходит

снижение активности Synapsin I, вызванное инактивацией ERK1/2, что приводит к накоплению VGLUT2 и торможению выведения глутамата в стриатуме. ERK1/2-зависимое ослабление процесса биосинтеза дофамина в нигростриатной системе вызывает ослабление D1–зависимого (просудорожного) и активацию D2–зависимого (противосудорожного) путей регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС у крыс линии КМ, что приводит к усилению синтеза ГАМК в рЧС. Полученные данные свидетельствуют о важной роли ЕRK1/2 киназ в регуляции нейрональной активности нигростриатной системы, участвующей в формировании повышенной судорожной готовности и в регуляции эпилептиформной активности при аудиогенных судорожных припадках.

Положения, выносимые на защиту.

1. ЕRK1/2 киназы играют важную роль в регуляции нейрональной активности нигростриатной системы крыс линии КМ и являются важным фактором формирования повышенной судорожной готовности, а также регуляции судорожной активности при аудиогенных эпилептиформных припадках.

2. Крысы линии КМ обладают более высокой активностью дофаминергических нейронов по сравнению с крысами линии Вистар на фоне повышенного уровня фосфорилирования ERK1/2 киназ. Активация D1-зависимого пути, оказывающего тормозное влияние на ГАМК-ергические нейрны ЧС, служит одной из причин повышенной судорожной готовности. Повышенная активность D2-зависимого пути, который оказывает возбуждающее действие на ГАМК-ергические нейроны ЧС, является компенсаторным механизмом, предотвращающими возникновение судорожного припадка в отсутствие аудиогенного стимула.

3. На клонико-тонической стадии эпилептиформного припадка у крыс линии КМ происходит резкое увеличение активности ERK1/2 киназ в стриатуме и активация процессов экзоцитоза, что приводит к интенсивному выбросу глутамата. Повышенная трансмиссия глутамата в рЧС на клонико-тонической стадии, а также увеличение синтеза ГАМК в ЧС может служить механизмом, направленным на остановку судорожной активности.

4. Инактивация ERK1/2 киназ синтетическим блокатором SL327 приводит к дозозависимой отмене и/или снижению тяжести аудиогенного судорожного припадка у крыс линии КМ за счет торможения выведения глутамата в стриатуме и снижения активности дофаминергических нейронов нигростриатной системы. Ослабление D1-зависимого и усиление D2-зависимого путей регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС приводит к ослаблению или полной отмене аудиогенного судорожного припадка у крыс линии КМ.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты данной работы позволяют расширить представления о механизмах, лежащих в основе патогенеза различных заболеваний, в том числе эпилепсии. Выполненная в работе оценка состояния глутамат-, ГАМК- и дофаминергической систем мозга крыс линии КМ, склонных к аудиогенным судорожным припадкам, в норме и при воздействии специфическим звуковым раздражителем вносит значительный вклад в изучение механизмов формирования судорожных припадков. Эти данные, а также результаты экспериментов с введением SL327 (селективного ингибитора активности ERK1/2 киназ), могут стать основой в разработке новых антиконвульсантных препаратов и других терапевтических методов лечения эпилепсии и эпилептиформных состояний. Результаты исследования могут быть использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов медицинских и биологических направлений.

Апробация работы. Результаты исследования представлены и обсуждены в виде
устных и стендовых докладов на российских и зарубежных конференциях: Всероссийская
конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы

формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2014), 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), 10^th World Congress on Neurohypophyseal Hormones (Бристоль, Великобритания 2013), XV Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2012), XIV международное совещание и седьмая школа по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), VIII

Всероссийская конференция «Нейроэндокринология-2010» (Санкт-Петербург, 2010), 4 ESN Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders (Leipzig , Germany, 2009), XIII международное совещание по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Международная научная конференция «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006).

Публикации. Основные положения диссертации нашли полное отражение в 15 печатных работах, 5 из которых - статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций и 10 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.

Личный вклад автора. Результаты, представленные в работе, получены лично автором и при его непосредственном участии в проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 11-04-00648, 14-04-00811, 16-04-00681).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах и состоит из введения, обзора литературы - глава 1, описания методики - глава 2, описания результатов исследования - глава 3, обсуждения с заключением - глава 4, выводов, списка сокращений и списка литературы, который включает 234 источника (из них 220 иностранных). Работа иллюстрирована 39 рисунками и 1 таблицей.

Глутаматергическая система

Иерархические связи структур головного мозга, участвующих в регуляции моторики, представляют собой комплекс, благодаря скоординированной деятельности которого происходит реализация моторного ответа при получении сенсомоторной, эмоциональной или когнитивной информации (Takakusaki et al., 2004; Turner, Desmurget, 2010). На генетической модели аудиогенной эпилепсии - на крысах линии КМ - показано, что первичный очаг генерации судорожного припадка расположен в стволовых отделах головного мозга (Гусельникова, 1959; Faingold, 2004). Однако значительную роль в регуляции двигательной активности, в том числе эпилептиформных припадков, играет комплекс структур БГ, представляющий собой разнообразные субкортикальные группы клеток (Deransart, Depaulis, 2002). Сами БГ участвуют не столько в создании двигательных команд, сколько в обработке сигнала от вышестоящих отделов мозга, например, коры, таламуса (Леонтович, 1954; Айрикян, Гаске, 1969; Толкунов, 1978). Связанные функционально, структуры БГ могут быть значительно удалены друг от друга. Например, стриатум и бледный шар (БШ) залегают глубоко в ростральной части полушарий мозга, в то время как связанные с ними ядра находятся в структурах, локализованных в промежуточном мозге - субталамическом ядре и среднем мозге - ЧС (Chesselet, Delfs, 1996).

Центральным звеном системы БГ можно рассматривать стриатум, в котором происходит сбор и анализ информации, приходящей из других отделов мозга (Graybiel, 1990) (Gurney et al., 2004). Основной функцией стриатума является регуляция двигательной активности (Арушанян, Белозерцев, 1976; Шаде и др., 1976). По топографическим особенностям кортикальных входов стриатум можно без четких границ разделить на несколько функциональных областей: дорсолатеральная часть иннервируется сенсомоторной корой, обширная центральная область имеет входы из ассоциативной коры, вентромедиальные структуры афферентно связаны с амигдалой и лимбической системой (Knzle, 1975; DeLong, Georgopoulos, 1979; Phillipson, Griffiths, 1985; McDonald, 1991; Lynd-Balta, Haber, 1994; Robbins, Everitt, 1996; Groenewegen, 2003; Durieux et al., 2012). В нашей работе мы рассматриваем дорсолатеральную часть стриатума, которая, помимо проекций из сенсомоторной и ассоциативной областей коры, иннервируется дофаминергическими нейронами ЧС (Bedard et al., 1969; Ungerstedt, 1971; Lynd-Balta, Haber, 1994; Durieux et al., 2012). При этом дофаминергические терминали нейронов кЧС направлены к ГАМК-ергическим нейронам стриатума и, на ультраструктурном уровне, прилегают очень близко к кортикостриатным терминалям на шипиках этих клеток (Smith, Bolam, 1990), что во многом определяет характер ответа стриатума на глутаматергическое возбуждение коры (Graybiel, 1990; Houk et al., 1995) (Рис. 1).

Рисунок 1. Схема взаимодействия глутаматергических нейронов моторной коры и дофаминергических нейронов кЧС в регуляции ГАМК-ергических нейронов стриатума, а также модель нигростриатного/стриатопаллидарного и кортикостриатного гетеросинапса (по (Kitada et al., 2007; Robison, Nestler, 2011)). Основным нейротрансмиттером клеток стриатума яыляется -аминомасляная кислота (ГАМК). Нейроны стриатума ингибируют ГАМК-ергические нейроны обоих сегментов БШ - наружний (нБШ) и внутренний (вБШ) (Lanciego et al., 2012). вБШ в комплексе с рЧС получает афферентные глутаматергические проекции из субталамического ядра и ГАМК-ергические проекции из стриатума (Graybiel, 1990). При этом таламус посылает глутаматергические эфференты к стриатуму и субталамическому ядру. Аксоны дофаминергических нейронов выявлены в стриатумн БШ, субталамическое ядро, таламусе и стволе мозга (Obeso et al., 2008). В регуляции активности БГ ключевую роль играют дофаминергические нейроны кЧС, иннервирующие именно стриатум. Активность этой группы дофаминергических клеток, в свою очередь, регулируется ГАМК-ергическими нейронами рЧС и БШ (Celada et al., 1999) (рис. 2).

Упрощенная схема, отображающая систему нейрональных взаимодействий внутри БГ и взаимодействующих с ними структур мозга, которые участвуют в регуляции двигательной активности. Адаптировано по (Graybiel, 1990). В настоящее время принято считать, что стриатум на 95% состоит из ГАМК-ергических длинноаксонных умеренно-шипиковых нейронов (MSNs – Medium spiny neurons) (Tepper, Bolam, 2004). Остальные пять процентов приходятся на нешипиковые интернейроны, которые на основании их морфологии, содержания белков и электрофизиологических характеристик классифицируются как гигантские холинергические интернейроны и соматостатин-, парвальбумин- и кальретинин-экспрессирующие ГАМК-ергические интернейроны (Kawaguchi et al., 1995). В настоящее время принято различать две субпопуляции ГАМК-ергических нейронов стриатума, отличающихся по направлению эфферентных проекций и составу экспрессируемых белков. Первая субпопуляция нейронов иннервирует рЧС, характеризуется экспрессией рецептора дофамина D1, динорфина и субстанции P и дает начало прямому пути регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС (нигростриатный), в то время как вторая субпопуляция направляет отростки к нБШ, экспрессирует рецептор дофамина D2 и энкефалин и дает начало непрямому пути регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС (стриопаллидарный) (Gerfen et al., 1990; Le Moine, Bloch, 1995) (рис. 2). Эти два основных типа ГАМК-ергических нейронов стриатума равномерно распределены внутри стриатума, и, в зависимости от преобладающей активности одного или другого типа клеток, происходит модуляция разнонаправленного поведенческого ответа (Alexander et al., 1986). Однако стоить отметить, что существуют данные о значительном числе ГАМК-ергических нейронов стриатума, продуцирующих и D1, и D2 рецепторы, от 5% до 17% в разных отделах стриатума (Bertran-Gonzalez et al., 2008).

Иммуннофлуоресцентный метод

При сопоставлении уровня фосфорилирования ERK1/2 киназ выявлено, что у крыс линии КМ, по сравнению с крысами линии Вистар, повышена активность ERK1/2, при неизменном содержании общего уровня белка ERK1/2 киназ, как в ЧС (рис. 5-А, Б, Д), так и в стриатуме (рис. 5-В, Г, Е). Иммуногистохимическим методом также показано, что оптическая плотность фосфо-ERK1/2 выше в стриатуме крыс линии КМ, чем у Вистар (рис. 6-В, Е, Ж). При этом значительное количество фосфо-ERK1/2 в стриатуме выявлено методом конфокальной микроскопии именно в глутаматергических нейронах (рис. 7-А), в то время, как только в отдельных ГАМК- и дофаминергических клетках и их отростках была показана колокализация фосфо-ERK1/2 киназ с GAD65/67 (рис. 7-Б) и фосфо-ТГ (данные не представлены). Однако нами показана колокализация фосфо-ERK1/2 и дофаминового рецептора D1 в волокнах стриатума крыс (рис. 7-В), что свидетельствует об участии дофаминовых рецепторов в активации ERK1/2 киназ.

Несмотря на то, что в стриатуме не отмечено существенной иммунореактивности фосфо-ERK1/2 в терминалях дофаминергических нейронов, в ЧС крыс КМ процент дофаминергических нейронов, которые содержат фосфо-ERK1/2 увеличен (рис. 8-А, Б), что указывает на более активное функционирование киназ в телах этих клеток у крыс с повышенной судорожной готовностью, по сравнению с крысами Вистар. При этом иммуногистохимическим методом в кЧС и рЧС выявлена повышенная активность ERK1/2 (рис. 5-А, Б, Г, ДСодержание фосфо-ERK1/2 – иммунореактивного вещества в ЧС (А,Б,Д) и стриатуме (В,Г,Е) крыс линий Вистар и КМ. Вестерн-блот анализ. В качестве контроля использован уровень ERK1/2 киназ (нижний ряд). На графиках представлена средняя оптическая плотность, выраженная в условных единицах ± стандартное отклонение. р 0,05 по сравнению с контролем. А

Содержание фосфо-ERK1/2 – иммунореактивного вещества в кЧС (А,Г,Д), рЧС (Б,Г,Д) и стриатуме (В,Е,Ж) крыс линий Вистар (Г,Е) и КМ (Д,Ж). Метод иммуногистохимии. На графиках представлена средняя оптическая плотность, выраженная в условных единицах ± стандартное отклонение. р 0,05 по сравнению с контролем.

На фоне повышенной активности ERK1/2 киназ в стриатуме крыс КМ мы наблюдаем увеличение содержания VGLUT2 (рис. 9-В, Г) по сравнению с крысами линии Вистар. Это является адекватным показателем интенсивной продукции глутамата. Тем не менее, нами не показано существенных отличий в иммунореактивности NR2B субъединицы NMDA рецептора в волокнах стриатума крыс линии КМ по сравнению с Вистар (рис. 10-А). Другим важным показателем интенсивности работы нейронов, является содержание белков экзоцитоза. У крыс линии КМ в стриатуме иммуногистохимически показано снижение содержание активной формы белка экзоцитоза Synapsin I (рис. 11-Б, В), фосфорилированного по Ser62/67 ERK1/2 киназами. Вестерн-блот анализ показал аналогичные результаты (рис. 12-А, В). Эти данные свидетельствуют о нарушении выброса глутамата и накоплении его в терминальных отделах нейронов в стриатуме крыс КМ в состоянии покоя.

Методом иммуногистохимии у крыс линии КМ в рЧС не выявлено отличий от крыс линии Вистар в содержании VGLUT2 (рис. 9-Б) и числе клеток, давших иммунопозитивную реакцию к NR2B субединице NMDA рецептора (рис. 10-Б). При этом в ЧС крыс линии КМ Вестерн-блот анализом выявлено снижение активности Synapsin I (рис. 12-Б, Г). Ослабление интенсивности процессов экзоцитоза могут свидетельствовать о нарушении глутаматергической иннервации ГАМК-ергических нейронов ЧС.

Содержание VGLUT2-иммунореактивного вещества в стриатуме (А) и рЧС (Б) крыс линий Вистар (В) и КМ (Г). Метод иммуногистохимии. На графиках представлена средняя оптическая плотность, выраженная в условных единицах ± стандартное отклонение. р 0,05 по сравнению с контролем.

На основании измерения оптической плотности в матриксе стриатума крыс линии КМ и Вистар отличий в содержании иммуннореактивного GAD65/67 не было обнаружено (рис. 13-А). Однако в стриосомах стритума крыс линии КМ выявлена меньшая иммунореактивность GAD65/67 (рис. 14-А, В, Г), что свидетельствует о снижении тормозного влияния ГАМК-ергических нейронов стриосом на дофаминергические клетки кЧС. Кроме того, нами показано, что содержание рецепторов ГАМК GABAA у крыс линии КМ выше (Рис. 15-А, В, чем у Вистар, в то время как уровень GABAB понижен (рис. 15-Б, Г).

В волокнах нБШ крыс линии КМ иммуногистохимическим методом отмечено меньшая оптическая плотность GAD65/67 (рис. 14-Б, Д, Е), что свидетельствует о более низкой продукции ГАМК нейронами этой структуры, чем у крыс Вистар и является показателем активации D2-зависимого пути регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС. В ЧС нами также выявлено более низкое, чем у Вистар, содержание белка GAD67 (рис. 13-Б, В). На фоне повышенного уровня рецепторов ГАМК GABAA (рис. 15-Д, Ж) и пониженного GABAB (рис. 15-Е, З) более низкий уровень синтеза ГАМК в рЧС может свидетельствовать об ослаблении тормозного влияния ЧС мозга крыс КМ на иннервируемые ими клетки моторного отдела таламуса.

Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов нигростриатной системы крыс линии КМ

После декапитации животных, мозг выделяли и фиксировали в 4% формальдегиде на фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline, PBS). Фиксация проводилась при +4 С в течение 5 дней. Затем материал на сутки помешался в 15%-ный раствор сахарозы (при +4 С). Материал замораживали при температуре -45 С в изопентане, охлажденном на сухом льду или жидком азоте до требуемой температуры. На криостате изготавливались серии чередующихся срезов во фронтальной плоскости толщиной 10 мкм. Использование чередующихся срезов сделало возможным выявление на параллельных срезах различных иммунореактивных веществ c помощью иммуногистохимического метода.

Иммуногистохимические реакции проводили по стандартному протоколу. Для подавления пероксидазной активности ферментов ткани использовали 0,3% раствор перекиси водорода на метаноле. Подавление неспецифического связывания производили путем инкубации срезов с 2% нормальной сывороткой козы в течение 1 часа. Затем срезы инкубировали в течение суток с первичными антителами против фосфо-ТГ (Ser31) (Millipore) -1:500, фосфо-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (Cell Signalling) – 1:200, фосфо-ТГ (Ser31) (Millipore) – 1:1000, D1a рецептор (Millipore) – 1:1000, GAD65 (Abcam plc, Cambridge, UK) – 1:500, GAD67 (Millipore) ProSci Incorporated), 1:500, VGLUT2 (Abcam plc, Cambridge, UK) – 1:100, фосфо-Synapsin I (Ser62/67) (ProSci Incorporated) – 1:500, NR2B субъединица NMDA рецептора (Abcam plc, Cambridge, UK) – 1:100. После этого производили инкубацию с вторичными биотинилированными антителами (Vector, 1:200) в течение часа, и с комплексом стрептавидин-пероксидазы (Sigma), разведенным на PBS (1:500) также в течение одного часа. После всех этапов, за исключением инкубации в сыворотке козы, препараты промывали в PBS 3 раза по 10 минут. Экзогенную пероксидазу визуализировали путем инкубации срезов в растворе тетрагидрохлорида диаминобензиидина, разведенном на PBS и содержащим 0,015% H2O2 в течение 10 минут. Препараты заключали в BioMount после тщательной промывки в дистиллированной воде и обезвоживания в спиртах восходящей концентрации и в ксилоле. Специфичность окраски проверяли, инкубируя препараты без первых антител. Микрофотографии были получены с помощью микроскопа Axio A1 (Carl Zeiss, Германия).

Для исследования локализации исследуемых веществ в стриатуме и ЧС было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание. Срезы мозга крыс инкубировали с антителами к фосфо-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) – 1:250, выработанными в кролике в сочетании с антителами к D1a рецептору (Millipore) - 1:100, GAD65 (Abcam plc, Cambridge, UK) – 1:500 и GAD67 (Millipore) - 1:500, VGLUT2 (Abcam plc, Cambridge, UK) - 1:100 или тирозингидроксилазе (Sigma-Aldrich) - 1:1000, выработанными в мыши. Для выявления иммунореактивности использовали вторичные антитела, коньюгированные с различными флуорохромами: антитела козы против IgG кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:1000) и антитела козы против IgG мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 546 (Invitrogen, 1:1000). Препараты отмывали в PBS и заключали в среду Mowiol с красителем DAPI.

Анализ препаратов проводили на конфокальном микроскопе (Leica) и флуоресцентном микроскопе (Carl Zeiss).

После декапитации из мозга крыс иссекали стриатум и ЧС. Материал гомогенизировали в буфере для лизиса (20 mM Tris, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1% Triton X-100), содержащем инибиторы протеаз (PhosSTOP, Roche) и фосфатаз (Sigma) и центрифугировали при 12 000 оборотах в течение 15 минут. Полученный супернатант разводили SDS буфером (200 mM Tris-HCl, pH 6.7; 6% SDS; 15% Glycerin; Bromphenol Blue и 10%-ный B-mercaptoethanol) в соотношении 2:1 и инкубировали в течение 5 минут при 95 С. Пробы хранили при -20 С.

Белковые фракции из полученных проб были разделены в 10% полиакриламидном геле с помощью электрофореза (SDS-PAGE). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-ECL, Amersham). Для блокировки неспецифического связывания мембраны инкубировали в 5% растворе обезжиренного сухого молока, разведенного в TBS буфере (50 mM Tris; 150 mM NaCl; 0.05% Tween-20; pH 7.6) в течение 60 минут. Затем мембраны инкубировали в течение ночи при +4С с первичными антителами: D1a (Millipore) - 1:500, D2 (Millipore) - 1:500, фосфо-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology) - 1:500, ERK1/2 (Cell Signaling Technology) - 1:1000, актин (Abcam plc, Cambridge, UK) - 1:2000, фосфо-synapsin I (Ser62/67) (ProSci Incorporated) – 1:500, , synapsin I (Millipore) – 1:1000, GABAA (Abcam plc, Cambridge, UK) - 1:750, GABABr1 (Abcam plc, Cambridge, UK) – 1:750 и GABABr2 (Millipore) – 1:750, GAD65 (Abcam plc, Cambridge, UK) – 1:500 и GAD67 (Millipore) – 1:500, ТГ (Sigma-Aldrich) – 1:1000, фосфо-ТГ (Ser31) (Millipore) – 1:1000, GAPDH (Abcam plc, Cambridge, UK) - 1:2000. После промывок в TBS буфере мембраны инкубировали со вторыми антителами к иммуноглобулинам кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена (1х5000) или антителами к иммуноглобулинам мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена (1х40000). Реакцию визуализировали с помощью набора ECLplus (Amersham) в соответствии с протоколом производителя с последующим проявлением хемилюминисцентного сигнала на пленке Hyperfilm-ECL (Amersham).

Количественная оценка содержания иммунореактивного вещества в телах клеток или в их отростках производилась на основании измерения оптической плотности окрашенного вещества на микрофотографиях с помощью компьютерного цифрового анализатора телевизионного изображения и программного обеспечения PhotoM (А.Черниговский, http://t_lambda.chat.ru) на полученных от каждого животного 6 фотографиях соответствующей структуры. Измерение содержания иммунореактивных веществ проводили при длине волны 550 нм. Оптическая плотность оценивалась компьютерной программой как «уровень серого». Результат оценки оптической плотности представлял собой разницу между уровнем серого участка ткани мозга, содержащего иммунореактивное вещество, и уровнем серого фона. При этом оптическую плотность фона оценивали на том же срезе на участке ткани мозга, не содержащем иммунореактивного вещества. Данные выражены в условных единицах оптической плотности на мкм2. Измерение оптической плотности иммунореактивного вещества в клетках позволило определить уровень выявляемого белка, а также дало возможность оценить число иммунопозитивных клеток в исследуемых отделах мозга, в которых наблюдалась повышенная экспрессия изучаемых веществ.

В случае Вестерн-блот анализа денситометрический анализ содержания белка был осуществлен после сканирования пленок, полученных в результате как минимум трех разных иммуноблоттингов, с помощью программы ImageJ. Оптическая плотность специфических бендов была скорректирована по фоновому сигналу и нормирован на оптическую плотность белка актин или GAPDH, в случае выявления фосфорилированной формы белка - по уровню нефосфорилированной формы исследуемого белка.

Морфофункциональный анализ глутаматергических нейронов стриатума и ЧС крыс линии КМ в ответ на введение SL-327

Для изучения особенностей нигростриатной системы крыс, имеющих генетическую предрасположенность к эпилептиформным припадкам, и роль ERK1/2 киназ в эпилептогенезе у этих животных мы сравнили уровень активности ERK1/2 киназ, а также глутамат-, ГАМК- и дофаминергической систем ЧС и стриатума крыс линии КМ и контрольной группы крыс линии Вистар. Эти данные позволяют судить об основных отклонениях в функционировании нигростриатной системы крыс КМ, которые являются одной из возможных причин повышенной судорожной готовности этих животных. Кроме того, данные об исходных физиологических особенностях крыс КМ дают возможность более адекватно оценить изменения, происходящие в мозге, при применении химических веществ и на разных стадиях эпилептиформного припадка.

В настоящее время несколькими авторами показано, что ERK1/2 киназы играют важную роль в развитии судорожных состояний (Thomas, Huganir, 2004; Nateri et al., 2007; O Sullivan et al., 2008). В стриатуме отмечена важная роль взаимодействия этих киназ с рецепторами дофамина и глутамата при формировании ответа на сигналы, поступающие из моторной коры. Это во многом определяет характер ответа системы БГ - возбуждающий или тормозный (Gerfen et al., 2002; Bertran-Gonzalez et al., 2008; Shiflett, Balleine, 2011). Нами показано, что уровень фосфориллирования ERK1/2 киназ у крыс линии КМ в стриатуме и в ЧС выше, чем у крыс линии Вистар. Эти данные подтверждают, что ERK1/2 играют важную роль в формировании эпилептиформной готовности. Необходимо отметить, что значительное количество фосфо-ERK1/2 в стриатуме выявлено именно в глутаматергических нейронах, содержащих VGLUT2, что было показано с помощью конфокальной микроскопии. Известно, что глутамат, будучи возбуждающим нейротрансмиттером, играет важную роль в инициации судорог, в том числе эпилептиформных (Chapman, 2000; Yang et al., 2006). Из моторной коры проекции глутаматергических нейронов приходят в дорсолатеральный стриатум, где образуют контакты с ГАМК- и дофаминергическими нейронами (Graybiel, 1990; Robison, Nestler, 2011; Rowley et al., 2012). Иммуногистохимически и с помощью вестерн-блот анализа мы показали повышение содержания VGLUT2 в стриатуме, что позволяет предположить высокий уровень выведения глутамата в этой структуре.

Однако в выведении глутамата из терминалей существенную роль играет белок Synapsin I (Hilfiker et al., 1999). Он способен связывать синаптические везикулы с актиновыми филаментами и контролировать объем резервного пула медиатора (Schiebler et al., 1986; Hilfiker et al., 1999). Также показано, что отсутствие Synapsin I у нокаутных мышей приводит к снижению уровня основных нейромедиаторов - глутамата и ГАМК в стриатуме, а также их везикулярных транспортеров, при этом уровень синтеза этих нейротрансмиттеров не меняется (Li et al., 1995; Bogen et al., 2006; Bogen et al., 2009; Bogen et al., 2011). В то же время отсутствие Synapsin I не оказывает существенного влияния на уровень везикулярного транспортера моноаминов 2 (VMAT2) и его способность к захвату дофамина (Croft et al., 2005; Bogen et al., 2006). Показано, что мыши-нокауты по генам Synapsin I и Synapsin II проявляют предрасположенность к судорожным припадкам, что сопровождается пониженным уровнем синаптических везикул в гиппокампе (Li et al., 1995; Rosahl et al., 1995). Основным механизмом активации Synapsin I является его фосфорилирование ERK1/2 киназами (Vara et al., 2009). Повышенная активация Synapsin I в глутаматергических нейронах должна приводить к отсоединению синаптических пузырьков от актинового цитоскелета и усилению глутаматергической нейротрансмиссии. Однако у крыс КМ уровень фосфо-Synapsin I в стриатуме заметно ниже, чем у крыс Вистар. Пониженный уровень фосфорилирования Synapsin I приводит к торможению выброса глутамата и, как следствие, наблюдаемому нами накоплению VGLUT2 в терминальных отделах нейронов. Торможение выведения глутамата в стриатуме, возможно, является компенсаторным механизмом, обеспечивающим отсутствие судорожного припадка у крыс КМ в отсутствии специфического раздражителя.

ERK1/2 запускает цепочку взаимодействий, которая завершается активацией NR2B субъединицы NMDA рецептора глутамата (Nateri et al., 2007). Также показано, что активация ERK1/2 в ГАМК-ергических нейронах дорсального стриатума может служить маркером взаимодействия NMDA рецепторов и рецепторов дофамина (Valjent et al., 2005) и может быть направлена на активацию ГАМК-ергических нейронов. Антагонисты NMDA рецепторов уже давно рассматриваются в качестве антиконвульсантов на самых различных моделях эпилепсии (Gilbert, 1988; De Sarro, De Sarro, 1992; Rogawski, 1992). Использование агонистов к NMDA рецепторам, наоборот, вызывает судорожный припадок (Graybiel, 1990). При этом важную роль в формировании эпилептических заболеваний играет NR2B субъединица (Karimzadeh et al., 2013). Несмотря на то, что в стриатуме мышей мутантных по гену Bassoon и имеющих предрасположенность к судорожным припадкам, выявлена более низкая экспрессия NR2B, чем у контроля (Ghiglieri et al., 2009), нами не показано существенных отличий в содержании NR2B в волокнах стриатума крыс линии КМ по сравнению с Вистар.

Одним из механизмов запуска или торможения фосфорилирования ERK1/2 может быть активация рецепторов дофамина, которые находятся на тех же ГАМК-ергических нейронах стриатума (Greengard, 2001; Lee et al., 2002). Показано, что усиление фосфорилирования ERK1/2 в стриатуме коррелирует с активацией как NMDA, так и D1 рецепторов (Cole et al., 1994; Guerrero et al., 2002; Valjent et al., 2005). Несмотря на отсутствие различий в содержании NR2B в стриатуме, усиление экспрессии D1 рецепторов дофамина сопровождалось активацией ERK1/2 у крыс линии КМ. Известно, что система межструктурных взаимодействий D1-зависимого (прямого) пути приводит к активации двигательной активности, в том числе при участии ERK1/2 киназ (Deransart et al., 2000; Groenewegen, 2003; O Sullivan et al., 2008). Нами показана колокализация фосфо-ERK1/2 и дофаминового рецептора D1 в волокнах стриатума крыс, что подтверждает данные об участии дофаминовых рецепторов в активации ERK1/2. Применение селективных агонистов D2 рецепторов, так же как и стимуляция кортикостриатальных проекций, приводит к активации ERK1/2 киназ в D2 позитивных нейронах стриатума (Sgambato et al., 1998; Cai et al., 2000; Bertran-Gonzalez et al., 2008). Усиление активности D2-зависимого (непрямого) пути приводит к торможению двигательной активности (Bravo et al., 2014) за счет ослабления тормозного влияния нБШ на глутаматергические нейроны субталамического ядра и ГАМК-ергические клетки рЧС. Действительно, мы показали, что в нБШ уровень GAD65/67 достоверно ниже у крыс линии КМ, чем у Вистар, что указывает на снижение продукции ГАМК этой структурой.

Повышенный уровень рецептора D1 и снижение D2 подтверждают важную роль взаимодействия ERK1/2 киназ и рецепторов дофамина в нейронах стриатума в формировании повышенной судорожной готовности у крыс линии КМ. Изменения в содержании рецепторов дофамина, выявленные у крыс КМ, указывают на высокую активность обоих типов ГАМК-ергических нейронов стриатума, направляющих свои отростки как по прямому -"просудорожному" пути регуляции ГАМК-ергических нейронов ЧС, так и по непрямому - "противосудорожному". При этом возбужденное состояние D1-зависимого пути, судя по всему, является одной из причин повышенной судорожной готовности крыс линии КМ, в то время как активность D2-зависимого пути может служить компенсаторным механизмом, который обеспечивает отсутствие судорожного припадка без предъявления звукового стимула.