Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 12
1.1. Cемейство белков агути как часть меланокортиновой системы .12
1.1.1. Общая характеристика белка агути .12
1.1.2. Общая характеристика AGRP .13
1.1.3. Экспрессия МКР3 и МКР4 в мозге млекопитающих 18
1.2. Общая характеристика катехоламинергической систем 20
1.2.1. Биосинтез катехоламинов в мозге .20
1.2.2. Регуляция синтеза тирозингидроксилазы 21
1.2.3. Локализация дофаминергических и норадренергических нейронов в мозге млекопитающих 24
1.2.3.1. Локализация дофаминергических нейронов .25
1.2.3.2. Локализация норадренергических нейронов .26
1.2.3.3. Дисфункции катехоламинергических нейронов 27
1.2.4. Рецепторы катехоламинов .28
1.2.4.1. Рецепторы дофамина 28
1.2.4.3. Рецепторы норадреналина .30
1.3. Вазопрессинергическая система гипоталамуса млекопитающих 32
1.3.1. Общая характеристика .32
1.3.2. Катехоламинергическая регуляция вазопрессинергических нейронов гипоталамуса 34
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Экспериментальные животные и экспериментальные модели .38
2.1.1. Модели in vitro 38
2.1.1.1. Инкубация переживающих срезов мозга мыши С57Bl/6J в среде с AGRP 83-132 или AGRP 25-51 38
2.1.1.2. Инкубация переживающих срезов мозга мыши в среде с неселективным блокатором МКР3 и МКР4 (SHU 9119) и AGRP 83-132 39
2.1.2. Модели in vivo .39
2.1.2.1. Депривация сна 39
2.1.2.2. Тест открытое поле 40
2.1.2.3. Иммобилизационный стресс 40
2.1.2.4. Введение белков в структуры мозга с помощью стереотаксиса 40
2.1.2.5. Мыши Agouti yellow (Ay/а) при ожирении 41
2.1.2.6. Моделирование дефицита катехоламинов с помощью
введения -метил-паратирозина и SCH 39166 41
2.1.2.7. Модель дисбаланса дофамина
(крысы линии Крушинского-Молодкиной) .42
2.2. Обработка материала 43
2.3. Иммуногистохимические методы
2.3.1. Биотин-стрептавидиновый метод 45
2.3.2. Двойное иммуномечение, флуоресцентная и конфокальная микроскопия 46
2.3. 3. Вестерн-блоттинг 47
2.4. Определение уровня мРНК 48
2.4.1.Метод гибридизации in situ 48
2.4.2. Метод обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени 50
2.5. Морфофункциональный анализ материала 53
2.6. Определение содержания катехоламинов и их метаболитов в ткани 53
2.7. Статистический анализ результатов 54
Глава 3. Результаты и их обсуждение 55
3.1. Исследование морфофункциональных взаимосвязей AGRP- и
дофаминергических нейронов мозга млекопитающих 55
3.1.1. Взаимосвязи AGRP- с дофаминергическими нейронами мозга у крыс,
отличающихся двигательной активностью 55 3.1.1.1. В цикле бодрствование-сон .55
3.1.1. 2. В тесте открытое поле .56
3.1.2. Влияние AGRP на биосинтез дофамина в экспериментах in vivo .61
3.1.3. Исследование механизмов функционального взаимодействия AGRP и дофаминергических нейронов мозга .70
3.1.3.1. Локализация MКР3 и MКР4 в дофаминергических структурах мозга 70
3.1.3.2. Влияние фрагмента AGRP 83-132 на дофаминергические нейроны в экспериментах in vitro .73
3.1.3. 3. Влияние фрагмента AGRP 25-51 на дофаминергические нейроны в экспериментах in vitro .75
3.2. Исследование морфофункциональных взаимосвязей AGRP- и норадренергических нейронов мозга млекопитающих 76
3.2.1. Исследование морфологических взаимосвязей AGRP- и норадренергических нейронов 76
3.2.2. Локализация МКР3 и МКР4 в норадренергических структурах
3.2.3. Морфофункциональные взаимосвязи AGRP- с норадренергическими нейронами мозга у крыс, отличающихся двигательной активностью (тест открытое поле ) .79
3.2.4. Прямое влияние AGRP на функциональное состояние норадренергических нейронов locus coeruleus в экспериментах in vitro .81
3.3. Морфофункциональная характеристика дофамин- и норадренергических структур мозга при дисфункции AGRPергической системы .82
3.3.1. Морфофункциональная характеристика дофамин- и норадренергических структур мозга у мышей Agouti yellow при ожирении .82
3.3.2. Морфофункциональное состояние вазопрессинергической системы гипоталамуса у мышей Agouti yellow при ожирении 86
3.3.3. Влияние различных фрагментов AGRP на морфофункциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса в экспериментах in vitro 97
3.4. Исследование влияния катехоламинов на экспрессию AGRP в гипоталамусе млекопитающих .100
3.4. 1. Исследование локализации рецепторов дофамина на AGRPергических нейронах .100
3.4.2. Влияние блокатора Д1 рецепторов дофамина и -метил-паратирозина на экспрессию AGRP в гипоталамусе мышей C57Bl/6J 101
3.4.3. Функциональное состояние AGRPергической системы гипоталамуса на фоне
увеличения уровня дофамина .104
Заключение 106
Выводы 108
Список использованной литературы... 109
- Общая характеристика белка агути
- Инкубация переживающих срезов мозга мыши С57Bl/6J в среде с AGRP 83-132 или AGRP 25-51
- Исследование механизмов функционального взаимодействия AGRP и дофаминергических нейронов мозга
- Исследование влияния катехоламинов на экспрессию AGRP в гипоталамусе млекопитающих
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дофамин и норадреналин играют огромную роль в регуляции многих функций организма. В мозге эти катехоламины участвуют в иннервации большого числа структур и, соответственно, вовлечены в регуляцию разных функций и форм поведения (двигательная активность, цикл бодрствование-сон, стресс, когнитивные процессы, пищевое поведение, ноцицепция и др.). Изменение баланса катехоламинов является причиной возникновения различных заболеваний, в частности нейродегенеративных (болезнь Паркинсона, эпилепсия и др.). Поэтому изучение механизмов регуляции биосинтеза катехоламинов остается актуальной проблемой физиологии и медицины. В регуляции дофамин- и норадренергических нейронов участвуют различные пептиды. При выявлении новых пептидов в областях, где локализованы катехоламинергические нейроны, возникает вопрос о возможности и характере их функционального влияния на эти нейроны.
Агути-подобный пептид (AGRP-agouti related peptide/agouti gene related protein) идентифицирован около 20 лет назад (Ollmann, et al., 1997). В мозге мРНК AGRP выявлена только в нейронах аркуатного ядра гипоталамуса (Bagnol, et al., 1999). Было показано, что из промолекулы в ходе посттрансляционных изменений образуется три активных фрагмента AGRP: 25-51, 54-82 и 83-132 (Creemers, 2006). Последний фрагмент AGRP 83-132 является наиболее изученным. Различные литературные источники свидетельствуют об участии AGRP в регуляции пищевого поведения как эндогенного антагониста меланокортиновых рецепторов 3-го и 4-го (МКР3 и МКР4) типов (Yang, et al., 1999; Stanley, et al., 2001; Schwartz, Mortin, 2002), блокирование которых в гипоталамусе приводит к активации аппетита и изменению энергетического баланса организма (Cone, 2005; Lee, Wardlaw, 2007). Однако AGRP-иммунопозитивные отростки выявлены далеко за пределами гипоталамуса, в частности в областях, где локализованы тела дофаминергических (черная субстанция, вентральная тегментарная область и др.) и норадренергических (голубое пятно, ядро одиночного тракта) нейронов (Bagnol, et al., 1999; Haskell-Luevano, et al., 1999; Романова, 2012). Результаты,
Список сокращений: ВП-вазопрессин; ГАД 65/67 - глутаматдекарбоксилаза 65/67; МКР3/МКР4 - меланокортиновые рецепторы 3-го и 4-го типов; ТГ -тирозингидроксилаза; фТГ(40) - фосфорилированная по серину-40 ТГ; фТГ(31) -фосфорилированная по серину-31 ТГ; ДБГ - дофамин--гидроксилазы; AGRP - agouti related peptide (агути-подобный пептид); VTA - ventral tegmental area (вентральный тегментум); LC - locus coeruleus (голубое пятно); NTS - nucleus tractus solitaries (ядро одиночного тракта); SN- substantia nigra.
полученные разными авторами, свидетельствуют о функциональной роли AGRP 83-132 и как агониста МКР3 и МКР4 (Sternson, 2012), а также о возможном действии AGRP 83-132 через другие типы рецепторов (Pritchard, White, 2005; Fu, den Pol, 2008).
В настоящее время в литературе появились данные о “непищевых” функциях
AGRP (Романова, 2012; Lippert, Ellacott, Cone, 2014). Были выявлены морфологические
связи между AGRP- и дофаминергическими нейронами мозга,
продемонстрировано уменьшение уровня тирозингидроксилазы (ключевого фермента
синтеза катехоламинов) в дофаминергических нейронах мозга под влиянием AGRP 83-
132 (Романова, 2012). Однако, остается невыясненным функциональное значение
других фрагментов AGRP (25-51 и 52-82) и каково влияние AGRP на
норадренергические нейроны.
МКР3 и МКР4 широко экспрессируются в мозге (Roselli-Rhefus, 1993; Liu, et al.,
2003; Lipper, et al., 2014). Однако вопрос об их локализации требуется уточнить для
выяснения механизмов влияния AGRP на дофамин- и норадренергические нейроны
мозга. Также не известно, оказывают ли дофаминергические нейроны влияние на
AGRPергические нейроны аркуатного ядра гипоталамуса, изменяется ли уровень
AGRP при нарушении баланса дофамина в мозге. Выяснение этих вопросов важно для понимания роли AGRP при патологиях дофаминергической системы и, возможно, позволит выяснить участие AGRP в развитии компенсаторных механизмов мозга при различных функциональных нарушениях.
В гипоталамусе вазопрессинергические нейроны получают мощную
дофаминергическую и норадренергическую иннервацию (Wagner, et al., 1995; Cheung,
et al., 1998; Угрюмов, 1999). В областях локализации вазопрессинергических
нейронов выявляются и AGRP-иммунопозитивные отростки (Bagnol, et al., 1999; Haskell-Luevano, et al., 1999). Однако каковы морфофункциональные взаимоотношения между AGRP и вазопрессинергическими нейронами остается невыясненным.
Цель настоящей работы: исследование морфофункциональных
взаимодействий AGRP- с дофаминергическими и норадренергическими нейронами мозга. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Выявить морфологические связи между AGRP- и норадренергическими нейронами мозга.
-
Оценить возможность влияния различных активных фрагментов AGRP на дофамин- и норадренергические нейроны мозга.
-
Оценить характер распространения МКР3 и МКР4 в дофамин- и норадренергических структурах мозга.
-
Оценить морфофункциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса при изменении баланса AGRP в мозге.
-
Выяснить, изменяется ли функциональная активность AGRPергических нейронов при изменении баланса катехоламинов в мозге.
Научная новизна. Впервые продемонстрировано дозозависимое тормозное влияние
различных активных фрагментов AGRP на биосинтез дофамина в мозге
млекопитающих. Выявлено уменьшение уровня ферментов синтеза норадреналина в
нейронах голубого пятна после воздействия AGRP. Показана взаимосвязь между
уровнем AGRP и функциональным состоянием дофамин- и норадренергических
нейронов мозга, что, в частности, определяет характер двигательной активности. МКР
выявлены в дофаминергических (МКР3/4), норадренергических (МКР3),
ГАМКергических (МКР3/4) нейронах мозга. Показано, что тормозное влияние AGRP
на дофаминергические и норадренергические нейроны мозга может осуществляться
как через блокаду МКР3 и МКР4 (фрагмент 83-132), а также и через другие
механизмы, не связанные с G-белок-связанными рецепторами (фрагмент 25-51).
Впервые показано тормозное влияние AGRP на вазопрессинергические нейроны
гипоталамуса, которое может осуществляться как прямым действием, так и
опосредованным, через регуляцию функциональной активности нейронов-посредников,
в частности дофамин- и норадренергических. Показано, что меланокортиновое
ожирение (у мышей Agouti yellow) сопровождается активацией дофаминергической и
вазопрессинергической систем. Впервые выявлена функциональная связь,
демонстрирующая возможность влияние дофамина на AGRPергические нейроны через
Д1 рецепторы, что, очевидно, может быть компенсаторным механизмом, регуляция
которого является многофакторным процессом. Впервые показано, что
нейродегенеративное заболевание, связанное с увеличением уровня дофамина в мозге (аудиогенная эпилепсия) сопровождается увеличением экспрессии как AGRP, так и МКР4.
Положения, выносимые на защиту:
-
AGRPергические нейроны мозга оказывают тормозное воздействие не только на дофаминергические, но и на норадренергические нейроны мозга.
-
Присутствие МКР3 и МКР4 непосредственно в телах дофаминергических и МКР3 в телах норадренергических нейронов является структурной основой для осуществления тормозного эффекта фрагмента AGRP 83-132 на дофамин и
норадренергические нейроны мозга. Присутствие этих рецепторов в телах ГАМКергических нейрон свидетельствует о роли AGRP как модулятора взаимодействия ГАМК с дофамин- и норадренергическими нейронами.
-
Фрагменты AGRP 83-132 и 25-51 оказывают тормозное влияние на биосинтез дофамина.
-
Локализация Д1 рецепторов дофамина непосредственно на телах AGRPергических нейронов свидетельствует о наличии функциональной связи, осуществляющей регуляторное влияние дофамина на AGRPергические нейроны.
5. Изменение баланса катехоламинов в мозге оказывает влияние на экспрессию AGRP в гипоталамусе.
Теоретическая и практическая значимость. Исследование носит фундаментальный
характер и направлено на понимание нейрохимических механизмов взаимосвязи
меланокортиновой системы с дофамин- и норадренергическими нейронами мозга, а
также расширяет понимание роли AGRPергических нейронов гипоталамуса в
осуществлении не только регуляции пищевого поведения, но и других функций, в
которые вовлечены дофамин- и норадренергические системы (нейросекреция,
двигательная активность, стресс, цикл бодрствование-сон и др.). Полученные
результаты могут быть использованы в курсах лекций и практических занятий для
студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских
институтов, а также для разработки новых методов диагностики нарушения
функционирования дофаминергической и норадренергической систем и определения
фармацевтических стратегий для их коррекции. Полученные данные могут быть
использованы как теоретическая основа при разработке противосудорожных
препаратов, блокирующих МКР в мозге.
Апробация работы. Результаты исследования представлены и обсуждены на VI-й
Всероссийской конференции с международным участием “Механизмы
функционирования висцеральных систем”, посвященной 50-летию открытия А.М.
Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008), на конференции
“Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций”, посвященной 90-летию со дня
рождения академика Т.М. Турпаева (Москва, 2008), на BSN annual meeting (Edinburg,
Великобритания, 2009), на ХХI и ХХII-м съездах физиологического общества им.
И.П. Павлова (Калуга, 2010; Волгоград, 2013), на VIII и IX Всероссийской
конференции “Нейроэндокринология“ (Санкт-Петербург, 2010, 2015), на VI-IХ
Всероссийских конференциях с международным участием “Актуальные проблемы
сомнологии“ (Санкт-Петербург, 2008; Москва 2010, 2012, 2014), на ХIV
Международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), на 10-м Симпозиуме «Catecholamines and other neurotransmitters in stress» (Smolenice Castle, Slovakia, 2011), на VIII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 220-летию со дня рождения акад. К.М. Бэра (Санкт-Петербург, 2012), на Всероссийской конференции «Братья Орбели и развитие современной науки» (Санкт-Петербург, 2012), на IX и Х международном междисциплинарном Конгрессе “Нейронауки для медицины и психиатрии” (Судак, Крым, Украина, 2013; Россия, 2014), на 10-м Конгрессе “Neurohypophyseal neurohormones” (Bristol, Великобритания, 2013), на 3-й юбилейной международной конференции “Neuroscience and Biological Psychiatry” (Yerevan, Армения, 2013), на Всероссийской конференции молодых ученых «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013), на Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2014), на IV Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Москва, 2015).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке
РФФИ (гранты №№ 07-04-01258, 12-04-01543 и 14-04-31565-мол_а), гранта ОПТЭК. Личный вклад автора. Результаты, представленные в работе, получены лично автором и при его непосредственном участии в проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, из которых 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, включающего 204 источника, из которых 31 отечественный. Работа изложена на 129 страницах, иллюстрирована 66 рисунками.
Общая характеристика белка агути
Показано, что в нейронах АРК (по-видимому, не во всех) AGRP колокализован с NPY (нейропептид-Y) и с ГАМК (Hahn, et al., 1998; Schwartz, Mortin, 2002; Luquet, 2005). Их отростки выявлены не только на различных нейронах гипоталамуса, но и в других областях мозга (Bagnol, et al., 1999; Haskell-Luevano, et al., 1999). Функциональное значение AGRP (а именно фрагмента 83-132) в литературе в основном обсуждалось в связи с его участием в регуляции пищевого поведения как орексигенного (активирующего аппетит) фактора. Первоначально эти сведения были получены на основании результатов экспериментов с внутрижелудочковым введением AGRP, которые демонстрировали увеличение аппетита и увеличение с-Fos иммунореактивности в латеральном гипоталамусе - областях, участвующих в регуляции пищевого поведения. В дальнейшем было показано, что AGRP 83-132 обладает способностью связываться с МКР3 и МКР4 и, таким образом, блокирует передачу сигнала а-МСГ, что и приводит к изменению энергетического баланса и активации аппетита (Rossi, et al., 1998; Stanley, et al., 2001; Schwartz, Mortin, 2002). Данные оптогенетики демонстрируют взаимосвязь между активацией AGRP-экспрессирующих нейронов АРК и пищевым поведением (Matthew, et al., 2013).
Многочисленные исследования проведены на нокаутных животных и их результаты демонстрируют развитие ожирения и изменение углеводно-жирового обмена при мутации МКР4 (Graham, et al., 1997; Shutter, et al., 1997; Ebihara, et al., 1999; Stutz, et al., 2005). При активации экспрессии AGRP наблюдалось ожирение, аналогично тому, что наблюдалось у мышей, нокаутных по гену MКР4 (Marks, Cone, 2001). Однако у мышей, нокаутных по гену AGRP, отличий по фенотипу и пищевому поведению не наблюдалось. Авторы предположили, что это связано с существованием компенсаторных механизмов (Gantz, Fong, 2003).
Функциональное значение других фрагментов AGRP в этих исследованиях не рассматривалось. Их функциональное значение связывают с трансмембранным белком синдекан-3, которому отводят роль корецептора (Irani, et al., 2004). Синдекан-3 относится к семейству поверхностно-клеточных гепаран-сульфат протеогликанов, способных связывать различные внеклеточные пептиды, гормоны и ростовые факторы. Он экспрессируется в гипоталамусе, в частности, в латеральной его части, ПВЯ и перивентрикулярном ядрах, дорзомедиальных ядрах, АРК. Показана важная роль синдекана-3 в регуляции потребления пищи и энергетического баланса (Reizes, et al., 2003; Strader, et al., 2004). Механизмы его действия в настоящее время не достаточно изучены. Синдекан-3 имеет эктодомен, который в результате протеолитического отщепления может находиться в растворенной, не связанной с мембраной форме. Предполагают, что и сам эктодомен способен оказывать непрямое паракринное действие на регуляцию энергетического баланса, так как при отщеплении эктодомена происходит снижение потребления пищи (Reizes, et al., 2003).
Исследования, проведенные на людях, свидетельствуют об увеличении AGRP в периферической крови при увеличении массы тела и ожирении (Katsuki, et al., 2001). Эти данные, по-видимому, свидетельствуют об увеличении экспрессии AGRP в периферических тканях, а также и о нейроэндокринной функции AGRP.
Показано, что AGRP 83-132 может оказывать свои эффекты независимо от меланокортиновых пептидов, действуя, очевидно, как обратный агонист МКР4 (Marsh, et al., 1999; Tolle, Low, 2008). Способность AGRP передавать сигнал через МКР4 может быть обусловлена тем, что а-МСГ и AGRP связываются с разными участками этого рецептора (Dhillo, et al., 2002). Предполагают, что AGRP также может передавать сигнал и через другие, пока неизвестные, рецепторы (Tolle, Low, 2008). Кроме того, в экспериментах in vitro показано, что у мышей в гипоталамусе AGRP повышает свою собственную экспрессию (Charbonneau, et al., 2004), однако механизм этих взаимодействий не известен. Таким образом, имеющиеся в литературе сведения о механизмах действия AGRP несколько противоречивы и требуют дальнейшего изучения.
Регуляция экспрессии AGRP осуществляется различными факторами. На AGRPергических нейронах обнаружены рецепторы к лептину (гормону жировой ткани), инсулину, грелину и др. (Charbonneau, et al., 2004). Уровень мРНК AGRP в гипоталамусе возрастает натощак, когда уровень лептина падет (Hahn, et al., 1998). Таким образом, показано тормозное влияние лептина, инсулина, а также PYY, и активирующие влияние грелина и кортикостероидов на AGRP-экспрессирующие нейроны. Высказывается мнение о том, что AGRP не влияют на пищевое поведение в обычных, спокойных, условиях, а включаются во время стресса или других непривычных и неприятных обстоятельствах (Matthew, et al., 2013). Кроме гормональной метаботропной регуляции AGRP-экспрессирующих нейронов была описана и нейрональная регуляция. Так их активация зависит от глутамата, действующего через NMDA рецепторы. В недавней работе было показано участие астроцитов в ингибировании AGRP нейронов через аденозин 1 рецепторы. В модели мышей со встроенным GPCR в промотер glial fibrillary acidic protein (GFAP) после активации астроцитов было показано уменьшение потенциала действия AGRP нейронов (Yang, 2015). Таким образом, AGRPергические нейроны являются своеобразными функциональными посредниками между нейронами-мишенями, которые они контролируют, получая сигналы как от периферических тканей, так и от других нейронов мозга. Поэтому анализ распределения АОРхРергических отростков в мозге и установление морфофункциональных взаимосвязей с нейронами, ответственными за контроль различных функций мозга, будет свидетельствовать и об участии АОРхРергических нейронов в контролировании этих же функций.
AGRP-иммунопозитивные отростки в гипоталамусе выявлены в нейросекреторных ПВЯ и СОЯ, в преоптической области гипоталамуса, а также в ядрах амигдалы, в среднем мозге, парабранхиальном ядре, в голубом пятне, ядре одиночного тракта и др. Идентификация AGRP в заднем нейрогипофизе, свидетельствует о том, что он может выводиться в общий кровоток, что предполагает его нейросекреторную функцию (Bagnol, et al., 1999; Haskell-Luevano, et al., 1999). В связи с этим показано, что AGRP, кроме участия в регуляции энергетического гомеостаза, может также влиять на эндокринные функции организма, в частности, на активность ГГНС (Stutz, et al., 2005). В экспериментах in vivo и in vitro показано, что AGRP, независимо от а-МСГ, стимулирует продукцию CRF в ПВЯ гипоталамуса, что приводит к повышению уровня АКТГ в крови (Dhillo, et al., 2002). Так же показано, что AGRP участвует в регуляции выведения ГАМК (Tong, et al., 2008) в АРК.
Использование молекулярных подходов позволило показать влияние AGRP на другие формы поведения (кроме пищевого). После введения крысам AGRP 83-132 в желудочек мозга (Tang-Christensen, et al., 2004) было показано увеличение пищевого поведения и уменьшение спонтанной двигательной активности. В работе на трансгенных мышах с глутаматергическими нейронами, меченными GFP, показано присутствие AGR-отростков вокруг этих нейронов в вентральномедиальном ядре гипоталамуса. В этой работе AGRP оказывал тормозное влияние на глутаматергические нейроны, также как и агонисты МКР3/4, в то время как искусственный антагонист этих рецепторов приводил к возбуждению глутаматергических нейронов вентромедиального ядра гипоталамуса. Также было показано уменьшение пресинаптического высвобождения глутамата, частоты EPSC и mEPSC, что позволило предположить авторам непрямое влияние AGRP на пресинаптические рецепторы глутаматергических и ГАМКергических нейронов (Fu, van den Pol, 2008). AGRP также оказывает тормозное влияние на ПОМК нейроны, вызывая их гиперполяризацию за счет изменения мембранной проницаемости для ионов K+, по-видимому, ингибируя МКР3 и МКР4 как антагонист и обратной агонист этих рецепторов. Таким образом, AGRP может оказывать ингибируещее влияние на позитивную обратную связь меланокортинов (Smith, 2007).
Инкубация переживающих срезов мозга мыши С57Bl/6J в среде с AGRP 83-132 или AGRP 25-51
Для норадреналина и адреналина существуют общие адренорецепторы (АР), которые подразделяют на 2 типа: - и -АР. Оба типа рецепторов относятся к семейству G-белок связанных рецепторов с семью трансмембранными доменами. Cреди -АР выделяют 2 подтипа 1- и 2-АР, что обусловлено степенью чувствительности к различным агонистам: 1-АР чувствительны к фенилэфрину, а 2-АР к клонидину. В последнее время среди 1-АР и 2-АР выделяют три формы: А, B и C субтипы (Wozniak, 2000). Показано, что 1-АР являются возбуждающими и локализованы на постсинаптической мембране, в то время как 2-АР в основном находятся на пресинаптической мембране, ослабляя выброс норадреналина из терминалей симпатических окончаний. Являясь частью симпатической нервной системы, 1-АР осуществляют свою функцию в основном в периферических тканях. Использование радиолигнадного метода и фармакологических методик позволило обнаружить 1-АР в легких, сердце, гладких мышцах сосудов, мозге и других тканях. Стимуляция 1-АР в гладкой мускулатуре приводит к е сокращению, также как и в стенках артериальных и венозных сосудов и сердце. Вместе эти эффекты приводят к повышению кровяного давления. Эти рецепторы способствуют мышечному сокращению сфинктера желудка и уретры, и релаксации кишечной мускулатуры. В печени активация 1-АР приводит к гликогенолизу и глюконеогенезу, пониженной секреции поджелудочной железы.
В мозге крысы 1-АР экспрессируются в таламусе, коре больших полушарий, гиппокампе, катехоламинрегических зонах, а именно в NTS. В мозге микроинъекции агонистов 1-АР в NTS приводит к уменьшению кровяного давления. В гипоталамусе 1-АР вовлечены в регуляцию насыщения и веса тела, а также секреции гормона роста в гипофизе.
Через все три субтипа 1-АР приводит активация фосфолипазы-С, накопление инозитол-3-фосфата и, как следствие, высвобождение Са2+ из внутриклеточных запасов; высвобождению диацилглицерола, активации ПК-С, и дальнейшее увеличение Са2+ проницаемости, что также приводит к накоплению Са2+ внутри клетки. Наряду с запуском сигнальных каскадов, приводящих у увеличению Са2+, активация 1-АР через Gs-субъединицу приводит к активации цАМФ и цГМФ. В ЦНС 2-АР экспрессируются очень широко. Данные гибридизации in situ демонстрируют присутствие мРНК 2-АР в ядрах ствола мозга, среднем мозге, гипоталамусе, септальной области, амигдале, базальных ганглиях, обонятельной системе, гиппокампе, мозжечке, LC, NTS и вентролатеральной медулле. Механизмы действия норадреналина через 2-АР связаны с Gi/Go-белками и влиянием на ГТФ связанные гетеротетрамерные белки. Активация Gi-белков приводят к уменьшению цАМФ, активация .Go-белков - к подавлению потенциал-активируемых каналов и, как следствие, - уменьшению входа Ca2+; через субъединицу Gi осуществляется уменьшение K+-проницаемости. Все три пути способствуют подавлению высвобождения нейротрансмиттеров и нейрогормонов (Wozniak, 2000). 2-АР выявлены на пресинаптической мембране нейронов вентролатеральной медуллы, которая участвует в регуляции сердечно-сосудситой системы. Их активация приводят к уменьшению артериального давления и брадикардии, а агонисты 2-АР используются в качестве понижающих давления агентов. Активация 2-АР, локализованных на пресинаптической мембране нейронов LC, иннервирующих гиппокамп, приводит к снижению выброса норадреналина в гиппокампе, что, по одной из гипотез, приводит к депрессии (Liang, 1990), а стимуляция 2-АР, расположенных на нейронах иннервирующих таламус и кору больших полушарий, приводит к ослаблению высвобождения норадреналина, обеспечивая, таким образом, седативный эффект.
В другой группе - -АР выделяют 3 подтипа: 1- и 2- и 3-АР, которые отличаются разной чувствительностью к агонистам и антагонистам. Подтипы 1- и 2-АР экспрессируются преимущественно в ЦНС: они выявлены в височной коре, I и II слоях коры больших полушарий, гиппокампе, медиодорзальном и вентральном ядрах таламуса, молекулярном слое мозжечка, центральном, перавентрикулярном и каудальном таламических ядрах, SN, медиальном преоптическом ядре. Однако через 2-АР в основном влияет адреналин, норадреналин – слабо.
В периферических тканях -АР представлены в легких, миоцитах сердца, эзофагусе, желудке, печени, скелетных мышцах, на макрофагах, эозинофилах и Т-лимфоцитах. Активация -адренорецепторов через Gs-белки способствует накоплению цАМФ. Активация 1-АР приводит к увеличению сердечного ритма и силы его сокращения, секреции ренина в почке, расслаблении коронарных артерий и гладкомышечной мускулатуры желудочно-кишечного тракта. Активация 2-АР приводит к расслаблению гладкомышечной мускулатуры дыхательных путей, кровяносных сосудов, усилению секреции инсулина и продукцию глюкозы.
Подтип 3-АР выявлен в периферических тканях. В белой жировой ткани он участвует в липолизе, в бурой – в термогенезе, а в поджелудочной железе стимулируют секрецию инсулина, в скелетной мышце ингибирует синтез гликогена (Robbins, 1985; Wozniak, 2000). Таким образом, в головном мозге норадреналин осуществляет свои эффекты через активирующие 1-АР и 1-АР, а также тормозные 2-АР. Представленные данные свидетельствуют об экспрессии рецепторов дофамина и норадреналина в областях, где выявлены AGRP-иммунореактивные отростки (преоптическая область, ядра гипоталамуса, срединное возвышение). Однако мы не обнаружили исследования, демонстрирующие рецепторы дофамина и норадреналина в самих AGRPергических нейронах, что подтверждало бы существование прямой обратной связи между AGRP- и катехоламинергическими нейронами.
Вазопрессин (ВП) был одним из первых гормонов гипофиза, функции которого стали известны в 30-х годах прошлого века. Он представляет собой олигопептид, состоящий из 9 аминокислотных остатков, вследствие чего его относят к семейству нонапептидов. В гипоталамусе источниками ВП являются нейроны ПВЯ, СОЯ и супрахиазматическго ядра (СХЯ). Показано, что в ПВЯ и СОЯ ВПергические нейроны являются нейросекреторными, так как их отростки в основном поступают в нейрогемальные органы, где контактируют с капиллярами и ВП секретируется в кровь. Таким образом, ВП функционирует как нейрогормон (Поленов, и др., 1993). В нейронах СХЯ ВП вырабатывается как нейротрансмиттер (Угрюмов, 1989). ВП облaдает целым рядом физиологических эффектов: действие на гладкую мускулатуру сосудов обуславливает ее сократительный эффект, на эпителий собирательных трубочек почки – реадсорбцию воды и антидиуретический эффект, что является важнейшим механизмом осморегуляции. Влияния ВП опосредованы через цитоплазматические рецепторы различных подтипов: в почках - это V2 рецепторы, связанные с G-белками (Gs), АЦ; в гладкой мускулатуре - V1a, связанные с фосфолипазой-С; в гипофизе – V1b, также связанные с фосфолипазой С. Эти рецепторы играют важную роль в кортикотропном стрессорном ответе (Aguilera, et. аl., 2008).
Исследование механизмов функционального взаимодействия AGRP и дофаминергических нейронов мозга
Каждая пара праймеров перед постановкой ПЦР в эксперименте была проверена на эффективность, для чего проводили ПЦР в реальном времени с последовательным десятикратным разведением кДНК в пробах и последующим построением стандартной кривой данных. Непосредственно перед проверкой приготавливали рабочие-стоковые растворы праймеров (100 мкМоль).
Реакции проводили в планшетах для ПЦР, каждую пробу повторяли 3 раза. ПЦР амплификация проводилась в объеме 25 мкл содержащих 40 нг продукта ОТ-ПЦР, 0.4 мкМ прямого и обратного праймера (для крысиного AGRP и GAPDH 0,2 мкМ), и реагент qPCRmix-HS SYBR LowROX (Евроген, Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Каждый цикл реакции (всего 40 циклов) состоял из четырех этапов и подбирался по литературе: предварительная денатурация 5 мин при 95 С, далее денатурация 40 секунд при 95 С, отжиг с праймерами в течение 30 сек при 57 С (для Д2 рецепторов при 56 С), стадия наращивания продукта 35 сек при 75 С. Так как мы использовали для детекции продукции интеркалирующий краситель SYBR Green (набор LowRox), то на последнем этапе цикла делали кривую плавления конечного продукта реакции 40 минут при 95 С и 57 С (56 С для Д2рецепторов). В качестве негативного контроля для обратной траскрипции служили пробы с мРНК, но без фермента обратной транскриптазы, а для контроля самой ПЦР служили пробы с праймером, но без продукта обратной транскрипции.
Амплификационный сигнал был детектирован прибором 7500 Realime PCR System (Life Technologies ABI, США). Результаты обрабатывали с помощью программ 7500 Software v.2.0.6 и Expression Suite Software v.1.0.3. Для сравнения графиков полученных в результате ПЦР в реальном времени использовали пороговый метод, при котором определяется значение порогового цикла реакции Ct, как точки пересечения графика накопления ДНК-продукта и пороговой линии. Далее по формулам 1 и 2 высчитывалось Сt, а по конечной формуле 3 для каждого гена определяли количество конечного продукта, выраженное в относительных единицах (RQ - количество мРНК гена интереса относительно референсного гена): 1) Сt образца интереса = Ct целевого гена – Ct эндогенного контроля; Сt контроля = Ct целевого гена – Ct эндогенного контроля; 2) Сt = Сt образца интереса - Сt контроля 3) RQ=2-Сt 2.5. Морфофункциональный анализ материала Изображения изучаемых структур мозга крысы были получены с помощью микроскопа Zeiss (Germany) со встроенной видеокамерой Imager 4.1, программного обеспечения для захвата изображения AxioVision- 4.7.2. (в .jpg, .bmp или .tiff форматах). На полученных снимках проводили оценку оптической плотности иммунореактивного вещества в программе Scion Image Analysis (4.0b, NIH) или Photo-М (Черниговский, http:t_lambda.chat.ru). Во второй программе интенсивность окрашенных участков мозга (нейронов, отростков), содержащих иммунореактивное вещество в изучаемой структуре, оценивалась с интенсивностью фонового окрашивания. При анализе в программе обводили либо область структуры с иммунореактивными отростками и нейронами, либо все иммунореактивные нейроны (35-100) на снимке (стандартная площадь). По каждому животному в каждой структуре анализировали 8-30 снимков. Результат представлялся программой в виде оптической плотности (ОП), которую рассчитывали как средний десятичный логарифм отношения яркости фона к яркости точки объекта и площади объекта и выражены в условных единицах (у.ед.). Также обращали внимание на распределение иммунореактивного вещества в структурах и проводили подсчет числа точек, соответствующих иммунореактивному сигналу в нейронах определенной эргичности.
Количественный анализ результатов Вестерн-блоттинга проводили с помощью сканирования пленки при расширении от 300 dpi, и изображения анализировали в программе Фото-М. Площадь иммунопозитивных полосок умножали на их ОП. Для анализа были использованы по 2-3 снимка при разных экспозициях для белка-интереса и соответствующего ему контрольного белка GAPDH, который является цитоплазматическим ферментом, катализирует одну из важнейших реакций гликолиза и не меняется в клетке. GAPDH присутствует во всех клетках, и по количеству этого белка можно судить об общем количестве белка в пробе. Результат для белка-интереса делили на соответствующий ему результат для GAPDH.
Определение содержания катехоламинов и их метаболитов в ткани Концентрации дофамина и его метаболита – диоксифенилуксусной (ДОФУК) определяли методом обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе Beckman Coulter (США) (Krasnova, et al., 2000). Хроматографическая система включала инжектор Rheodyne 7125 с петлей на 20 мкл для нанесения образцов, колонку Phenomenex (250,0 x 4,6 мм) с сорбентом Sphere Clone 5 u ODS(2) и амперометрический детектор LC-4С BAS. Определение концентраций исследуемых веществ проводили при потенциале +0,70 В. Подвижная фаза включала 5,5 мМ цитратно-фосфатный буфер с 0,7 мМ октансульфоновой кислотой, 0,5 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила (рН 3,0). Скорость элюции подвижной фазы составляла 1 мл/мин, время анализа одной пробы – около 20 минут. Конечная концентрация была выражена в нг/мг ткани.
Статистический анализ данных, полученных с помощью иммуногистохимических методов, проводили с помощью критерия Стьюдента (парного двухвыборочный t-критерий для независимых выборок или непарного t-критерия) с помощью коммерческой программы Microsoft Excel 2003. При сравнении двух животных (контроль-опыт) за n было принято количество срезов. Достоверными считались отличия при уровне значимости p 0,05 (или р0,05). Результаты представлены в у. ед. как среднее арифметическое по каждой группе животных ± средняя квадратическая погрешность оптической плотности (mean±SE) и как процент изменения по сравнению с контрольным (100%) уровнем.
При статистическом анализе данных, полученных методом ПЦР, использовали ANOVA-тест, результаты считали достоверными при р 0,05 и представлены как RQ (relative quantity) ±SE. Конечные результаты обрабатывали в программе Microsoft Excel 2003.
Исследование влияния катехоламинов на экспрессию AGRP в гипоталамусе млекопитающих
После введения 0,6 нмоль AGRP 25-51 в нейронах VTA (рис. 16) ОП фТГ(31) составила в зоне 1 - 0,230±0,020 у.ед. и в зоне 2 – 0,101±0,010 у.ед. (уменьшение на 53% по сравнению с зоной 1, р 0,05, что на 65% меньше чем в с зоне 2 в контроле, р 0,05). После введения 0,6 нмоль AGRP 25-51 в нейронах SN ОП фТГ(31) составила в зоне 1 - 0,191±0,028 у.ед. и в зоне 2 – 0,079±0,0081 у.ед. (уменьшение на 58% по сравнению с зоной 1, р 0,05 и уменьшение на 62% по сравнению с зоной 2 в контроле, р 0,05). Результаты суммарного анализа ОП фТГ(31) приведены на рис. 17 и демонстрируют в нейронах VTA и SN в области вокруг инъекции достоверное уменьшение ОП фТГ(31) после введения 0,6 нмоль обоих фрагментов AGRP (83-132 и 25-51). При этом в зоне 1 отмечены разнонаправленные реакции нейронов на разные фрагменты AGRP: увеличение ОП фТГ(31) после введения фрагмента AGRP 83-132 и ее уменьшение после введения AGRP 25-51.
В этом эксперименте мы хотели оценить, изменяется ли фЕRK в дофаминергических нейронах после введения AGRP 25-51. Результаты Вестерн блоттинга не дали ясного результата, поэтому мы повторили иммуногистохимическая реакцию на срезах мозга. Мы не проводили количественный анализ, но при просмотре препаратов была отмечена более интенсивная реакция в нейронах SN и VTA у контрольных животных по сравнению с экспериментальными. Также следует заметить и тот факт, что в других структурах вентральной части среднего мозга (в ретикулярной части SN, вокруг трека от инъекции) интенсивность реакции была гораздо сильнее, чем в нейронах SN и VTA. Таким образом, полученные нами данные демонстрируют дозозависимый тормозный эффект различных активных фрагментов AGRP на системы биосинтеза дофамина, что приводит к уменьшению концентрации дофамина в ткани. Влияние AGRP 83-132 связывают с блокадой МКР3 и МКР4 (Ollmann, et al., 1997; Bagnol, et al.,
Полученные нами данные об уменьшении под влиянием AGRP 83-132 фТГ(40) и фТГ(31) в дофаминергических нейронах подтверждает роль AGRP 83-132 не только как антагониста меланокортиновых рецепторов, но и как обратного агониста. Эффекты AGRP 25-51 непосредственно не связаны с G-белок–ассоциируемыми механизмами и рассматриваются с взаимодействием с гликопротеином синдикан-3 (Pritchard, White, 2005; Goto, et al., 2003). Трансмембранный гликопротеин синдикан-3 выявлен в основном в ткани мозга (Rapraeger, 2000), однако мы не обнаружили данных о присутствии его в дофаминергических нейронах.
Следует отметить, что после введения каждого из фрагментов AGRP нами выявлено уменьшение фТГ(31), фосфорилирование которой осуществляется без участия G-белков и сопряжено с влияниями, опосредуемыми ERK 1/ 2 модулем МАРК киназного каскада (Daubner, et al., 2011). Наши данные с одной стороны свидетельствуют о том, что оба фрагмента участвуют в реализации этого пути, а с другой, что влияние AGRP 83-132 также может реализовываться и через G-белок независимые механизмы. В этом случае AGRP 83-132, выполняя роль обратного агониста, может влиять не только на экспрессию ТГ через G - белок-зависимые пути, но и на активность ТГ, блокируя ее фосфорилирование через ERK 1/ 2 модуль (Haycock, et al., 1992, Daubner, et al., 2011). Однако в литературе высказывалась версия о возможности влияния AGRP 83-132 не через МКР, а через другие рецепторы (Pritchard, White, 2005).
Полученные нами данные демонстрируют разнонаправленный характер влияния AGRP 83-132 на фТГ(31) в дофаминергических нейронах, расположенных непосредственно рядом с местом укола, что занимает ограниченную область, и нейронах, расположенных латерально от области введения белка. В первом случае мы наблюдали уменьшение количества иммунопозитивных нейронов и уменьшение ОП фТГ(31) в 1,5 – 2 раза по сравнению с контрольным уровнем. В нейронах, расположенных в стороне от области инъекции, на которые, по-видимому, не повлиял экзогенный белок, напротив, наблюдалось увеличение иммунореактивности фТГ(31) на 30-100%. Этот факт может свидетельствовать 1) о существовании интегративных взаимоотношений между дофаминергическими нейронами внутри структуры, нарушение которых приводит к увеличению активности фТГ(31), что, по-видимому, носит компенсаторный характер, в котором участвуют посредники, связанные с ERK 1/2 модулем, в частности, -аррестины; 2) о нарушении транспортных процессов в нейронах.
Ранее в экспериментах in vitro мы показали уменьшение ОП ТГ после инкубации с AGRP 83-132 (Михрина, Романова, 2013). Факт влияния обоих изучаемых фрагментов на фосфорилирование ТГ требуется подтвердить в экспериментах in vitro. Кроме того необходимо конкретизация вопроса о локализации
МКР3 и МКР4 в дофаминергических структурах: экспрессируются ли эти рецепторы в самих дофаминергических нейронах или влияние AGRP 83-132 как их антагониста осуществляться опосредованно через другие нейроны. 3.1.3. Исследование механизмов функционального взаимодействия AGRP и дофаминергических нейронов мозга
В структурах среднего мозга (SN, VTA, околоводопроводном сером веществе) с помощью флуоресцентного двойного иммуномечения и конфокальной микроскопии у крыс и C57BL/6J мышей МКР3 или МКР4 выявлены как в самих дофаминергических нейронах, так в нейронах другой эргичности (рис. 18 А, Б; 19). В SN выявляется много МКР3, причем не только в ее компактной (т.е. дофаминергической) части, но также и в