Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Морфофункциональная характеристика эритрона в норме 12-19
1.2. Реологические свойства популяций эритроцитов 20-29
Глава II. Материал и методы исследования
II.1 Материал исследования 30
II.2. Методы исследования
II.2.1. Генеалогический метод 30
II.2.2. Реологические методы исследования 31-38
II.2.3. Статистический метод 38-39
II.2.4. Генетико-математический анализ 40-41
Глава III. Основные реологические характеристики общей эритроцитарной популяции человека и их сопряжённость 42-60
Глава IV. Реологические свойства эритроцитов, фракционированных в соответствии со временем их циркуляции в кровеносном русле 61-82
Глава V. Роль отдельных белков мембраны эритроцитов в изменчивости реологических свойств клеток на различных этапах их жизненного цикла 83-90
Глава VI. Роль наследственности и среды в формировании реологических свойств эритроцитов кровяного русла.
VI. 1. Роль генетических и средовых факторов в формировании дисперсии реологических своиств эритроцитов человека на различных этапах жизненного цикла клеток 91-106
VI.2. Генетическая детерминируемость реологических свойств эритроцитов и её
изменчивость в жизненном цикле клеточной популяции 107-113
Обсуждение 114-129
Выводы 130-131
Список литературы 132-164
- Морфофункциональная характеристика эритрона в норме
- Реологические методы исследования
- Реологические свойства эритроцитов, фракционированных в соответствии со временем их циркуляции в кровеносном русле
- Роль генетических и средовых факторов в формировании дисперсии реологических своиств эритроцитов человека на различных этапах жизненного цикла клеток
Введение к работе
Актуальность темы
Проблема структурной и функциональной изменчивости в жизненном цикле клетки является одной из актуальнейших проблем современной клеточной биологии. Анализ современного состояния литературы указывает на большое число работ, посвященных изучению структурно-функциональных свойств эукариотических клеток на отдельных этапах их жизненного цикла [28,50,82,83,85].
Особое место в ряду таких работ занимают исследования эритроцитов, как клеток высоко специализированной активности [104,111,178]. Интерес к изучению кровяных телец обусловлен рядом факторов: 1) важностью выполняемой ими функцией в жизнедеятельности многоклеточных организмов, в том числе организма человека; 2)вовлечённостью эритроцитов в патогенез многих заболеваний; 3)относительной простотой строения, позволяющей изучать функцию и структуру мембран красных клеток; 4) доступностью эритроцитов в большом количестве для работы, а также доступностью их отделения от других клеток.
При изучении клеточных мембран красных кровяных телец используются разнообразные методы [119,130,140,146]. Особое место среди них занимает исследование реологических свойств эритроцитов [68,103,128,148], изменчивость которых оказывает существенное влияние на выполняемые ими жизненно важные функции, а также является одним из патогенетических факторов в формировании многих тяжёлых заболеваний, таких как,
сахарный диабет, гипертоническая болезнь, лейкемия, гемолитическая анемия, ишемическая болезнь сердца, ожоги и шоки различной этиологии [13,27,40,107,147,231]. В литературе имеются многочисленные данные о влиянии изменчивости реологических свойств эритроцитов на симптоматику заболеваний, формирование клинической картины, а также о роли реологических характеристик в контроле эффективности лечения больных [121,160,218,230].
Следует отметить, что при наличии большого числа работ
по изучению реологических свойств эритроцитов в норме
[31,68,158] и при патологии [59,63,65,192,201], исследования
динамики этих свойств в жизненном цикле клетки по сути не
проводились, хотя очевидным является тот факт, что результаты
таких исследований могли бы способствовать более корректной
оценке изменчивости реологических характеристик при
патологии, более оптимальному влиянию на формирование
количественных характеристик реологических свойств,
обеспечивать эффективный контроль за лечением и
определением его тактики.
Отсутствие в доступной нам литературе данных по оценке динамики реологических свойств на различных этапах жизненного цикла эритроцита, а также их значимость в понимании процессов, происходящих в жизненном цикле красных кровяных телец, побудили нас к проведению настоящего исследования.
Цель исследования:
Оценить изменчивость реологических свойств эритроцитов человека в процессе их жизненного цикла и изучить вклад генетических и средовых факторов в её формирование.
Задачи исследования:
1.Изучить реологические свойства красных клеток крови у человека в общей эритроцитарной популяции и оценить особенности их взаимосвязей между собой.
2.Провести оценку изменчивости реологических
характеристик на различных возрастных этапах жизни кровяных телец и изучить возрастную динамику сопряжённости этих характеристик.
3.Оценить связь устойчивости отдельных белков клеточной мембраны эритроцитов с изменчивостью реологических свойств клеток в процессе их жизнедеятельности.
4.Установить вклад наследственности и среды в формирование реологических свойств эритроцитов.
5.Определить изменчивость соотносительной роли наследственности и среды в детерминации реологических свойств кровяных телец на различных этапах их функционирования в кровеносном русле.
Научная новизна работы.
Впервые проведена оценка характера взаимного варьирования реологических свойств эритроцитов в выборках человека, различающихся по полу и по возрасту. Определена оценка изменчивости этих свойств на различных возрастных этапах жизни кровяных телец и изучена возрастная динамика их сопряжённости. Установлена связь устойчивости отдельных
белков клеточной мембраны эритроцитов с изменчивостью реологических свойств клеток в процессе их жизнедеятельности. Впервые проведена оценка роли генетических и средовых компонент в формировании общих фенотипических дисперсий количественных показателей реологических характеристик эритроцитов. Изучена роль генетических факторов в детерминации этих характеристик и определена выраженность взаимосвязей между ними.
Практическая значимость работы.
Полученные результаты формируют представления о реологических свойствах эритроцитов на различных этапах их функционирования в кровеносном русле, открывая перспективы для более глубокого изучения изменения функциональной активности клеток в процессе их старения. Получены новые знания о соотносительной роли среды и наследственности в формировании количественных показателей реологических свойств эритроцитов человека. Результаты работы могут быть использованы как показатели нормы в практической медицине при проведении дифференциальной диагностики заболеваний, связанных с клеточной патологией.
На основе полученных данных возможна разработка научно-обоснованных методических рекомендаций при изучении курсов физиологии, биофизики, цитологии, медицинской генетики в высших медицинских и биологических заведениях.
Положения, выносимые на защиту
1. Количественные показатели реологических свойств эритроцитов общего пула характеризуются статистически значимыми взаимосвязями различной степени выраженности.
Структура этих взаимосвязей обладает статистически достоверной мерой сходства среди родственников I степени генетического родства.
Реологические свойства эритроцитов в процессе их жизнедеятельности характеризуются увеличением вязкости клеток и количественного содержания в них гемоглобина, ослаблением гемолитической резистентности, усилением агрегации и вязкости внутреннего содержимого клеток, а также снижением деформируемости, уменьшением диаметра эритроцитов. При этом, возрастная динамика сопряжённости реологических характеристик проявляется в ослаблении и дезинтеграции взаимосвязей.
Динамика показателей вязкости и деформируемости эритроцитов при температурной денатурации спектрина имеет свои статистические особенности на каждом из этапов жизненного цикла клеток. Стабилизация белка полосы 3 оказывает существенное влияние на повышение детергентустойчивости клеток средней фракции.
Соотносительная роль генетических и средовых факторов в формировании фенотипических дисперсий реологических свойств красных клеток крови меняется в процессе их жизнедеятельности, что выражается в усилении влияния средовой компоненты на заключительной стадии жизненного цикла эритроцитов. Между генетическими факторами, обеспечивающими контроль за формированием количественных показателей реологических свойств эритроцитов человека, установлена достаточно выраженная сопряжённость, которая сохраняется на протяжении всего
жизненного цикла клеток, за исключением показателя продолжительности гемолиза кровяных телец.
Апробация работы и публикации
Результаты работы доложены на конференции студентов и
молодых ученых (Курск,2002, 2004 гг.), на 58-й межвузовской
конференции молодых ученых и студентов
(Екатеринбург,2003г.), на межвузовской конференции молодых ученых (Томск,2004г.), на 3-й Всероссийской конференции молодых ученых по медицине (Тула,2004г.), на межкаферральном совещании сотрудников КГМУ (2004г.), межлабораторном семинаре сотрудников КГСХА (2004г.)
По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Объём и структура диссертации
Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами, 1 рисунком; состоит из введения, 6 глав, обсуждения и выводов. Список литературы включает 238 источника, в том числе 148 источников зарубежной литературы.
Морфофункциональная характеристика эритрона в норме
Важная роль в изучении изменчивости структурно- функциональных свойств эукариотических клеток в их жизненном цикле отводится исследованию эритроцитов. Именно эти кровяные тельца служили объектом ранних исследований, в результате которых сформировались представления о структурной организации клетки. В настоящее время эритроциты широко используются для проверки и доказательств новых идей и гипотез клеточной биологии. Кроме того, проблема структурно- функциональной изменчивости эритроцитов привлекает ученых в связи с установлением различных нарушений в строении и количественном соотношении белковых компонент мембран, приводящих к наследственным заболеваниям. Так, современные данные указывают на вовлеченность клеточных мембран в патогенез ряда наследственных патологий: гемолитической анемии [20,67,113], миодистрофии [16], псориаза [77], гипертонической болезни [34,223] и других.
Эритроциты циркулируют в кровеносном русле в течение 120 дней (в среднем), после чего они выводятся из кровотока. Эритропоэз представляет собой постоянный и непрерывный процесс образования и восстановления клеток эритрона, главной функцией которых является снабжение тканей кислородом. Эри-трон - совокупность всех эритроидных клеток костного мозга и крови. Эта клеточная система выполняет высокоспециализированную функцию переноса кислорода из альвеолярного воздуха в ткани и включает в себя 4 категории клеток: 1) ядросодержа-щие эритроидные клетки костного мозга; 2) ретикулоциты костного мозга; 3) ретикулоциты крови; 4) зрелые эритроциты [21,57,64].
Клеточная основа эритропоэза состоит из дифференциации, пролиферации и созревания эритроидных предшественников в костном мозге с последующим выходом эритроцитов в циркуляцию крови[89,181,182,206,229].
Продолжающееся на протяжении всей жизни организма обновление клеток эритрона контролируется механизмами регуляции, которые поддерживают динамически устойчивое эритроци-тарное равновесие. Центральное место в регуляции эритропоэза занимает эритропоэтин - почечный гормон гликопротеиновой природы [168,181,182,210]. Инициируя синтез всех классов РНК, специфических для эритрона, эритропоэтин действует так же, как и другие «классические» гормоны, приводя к образованию белков, составляющих структурную и функциональную основу эритроидных клеток [181,229].
Белки в мембранах эритроцитов распределены особым образом, обеспечивая осуществление эритроцитарной мембраной основных функций. В связи со способом расположения макромолекул в мембране эритроцита белки подразделяют на периферические и интегральные[6,24,34,55,119].
Интегральные белки характеризуются высоким содержанием неполярных аминокислотных остатков, с помощью которых они удерживаются в мембране за счет сил гидрофобного взаимодействия с жирнокислотными цепями фосфолипидного матрикса [6,84,153]. В состав интегральных белков входят гликопротеины и протеолипиды [55,86]. Гликопротеины - белки, к определенным аминокислотным остаткам которых присоединены олигоса-харидные цепи. Размеры углеводной цепи колеблются от диса-харидного звена до структур, содержащих 18 моносахаридов и более. В количественном отношении представленность углеводов также различна: от 5-8% (белок полосы 3) до 60% (гликофо-рин А) [34]. Углеводные цепи гликопротеинов играют важную роль в формировании антигенной структуры мембран эритроцитов. Протеолипиды взаимодействуют с липидным слоем более прочно, чем гликопротеины. Функции интегральных белков многообразны: они выступают в роли гидролитических ферментов, рецепторов клеточной поверхности, окислительно-восстановительных компонентов транспортной системы электронов и в качестве белков-переносчиков [234,236,237].
Периферические белки по аминокислотному составу напоминают «водорастворимые» и удерживаются в мембране относительно слабыми нековалентными связями , не вступая с липида-ми в гидрофобные взаимодействия. Основная часть периферических белков эритроцитов входит в состав цитоскелета, который представляет собой двумерную сеть, соединенную непосредственно с мембраной эритроцита через взаимодействие с интегральными белками [24,84,88]. Кроме того, к периферическим белкам относится ряд эритроцитарных ферментов [6,34,86].
Эритроцитарные мембраны проявляют функциональную и структурную ассиметричность [3,6,34]. На поверхности мембраны эритроцита находятся центры связывания биологически активных веществ, таких как инсулин, соматотропный гормон, В-адренэргические агенты, простагландины [1,24,55,86], что свидетельствует об участии мембраны эритроцита в передаче сигналов, поступающих от организма.
Важнейшими функциями мембран эритроцитов являются также барьерная и транспортная [4,5,6,26]. В цитоплазме эритроцитов в больших количествах содержится гемоглобин, карбо-ангидраза, ферменты гликолитического цикла, органические соединения и неорганические ионы, состав которых в эритроцитах значительно отличается от состава плазмы [1,3,84,88].
Форма эритроцитов и их реологические свойства (деформируемость, способность к агрегации) играют важную роль в процессах переноса кровью кислорода и углекислого газа между легкими и тканями [2,31,42,68,128].
Реологические методы исследования
Для проверки статистических гипотез использовались параметрические критерии Стьюдента и Фишера. Уровень значимости принимали равным 0.5. При описании количественных признаков использовались параметры нормального распределения: среднее значение, стан дартная ошибка среднего значения, несмещённая дисперсия. Проверка нормальности распределения проводилась с использованием пакета прикладных программ. Вычислялись показатели ассиметрии и эксцесса, эмпирические и теоретические частоты распределения, проводилась проверка соответствия рас пределения вариант правилу «плюс-минус трёх сигм», строились вариационные кривые. При обработке анкетных данных вычислялись: размер выборочной доли в процентах и ошибка выборочной доли. При сравнении более двух эмпирических совокупностей использовались приёмы дисперсионного анализа. Нулевая гипотеза своди лась к тому, что генеральные межгрупповые средние и диспер сии равны между собой и различия, наблюдаемые между выбо рочными показателями, вызваны случайными причинами, а не влиянием на признак регулируемых факторов. Описание сложного фенотипа с помощью набора характеристик приводит к необходимости использования специальных многомерных методов для анализа комплекса признаков, поэтому в настоящем исследовании использовались методы многомерной статистики: корреляционный, кластерный анализ. Анализ структуры множественных корреляций изучаемых показателей позволил выделить соответствующие группы признаков, вариабельность которых отражала их фенотипическую изменчивость. Коэффициенты корреляции между изучаемыми параметрами использовались для проведения дальнейшего многомерного анализа. При проведении кластерного анализа для оценки характера взаимосвязей между количественными показателями использовались коэффициенты корреляции без учёта знака. Интерпретация полученных значений проводилась согласно критериям нормального распределения признаков с оценкой линейности корреляций между изучаемыми параметрами через F-отношение. Дискриминантный анализ позволял получать такую линейную комбинацию исходных показателей, которая отражала максимально возможное различие между сравниваемыми группами для данной совокупности фенотипических характеристик Полученная ЛДФ рассматривалась как интегральный показатель, максимизирующий различия между двумя группами. Использование ЛДФ считалось эффективным, если различия между средними значениями групп по ЛДФ являлось статистически значимым, что устанавливалось на основании F-критерия.Различие считалось статистически достоверным, если F F5%. В процессе ЛДФ анализа проводилась оценка диагностической ценности признака. Генетико-математический анализ был проведен с использованием программы «GEN1», подготовленной д.б.н. В.И.Трубниковым. Для определения степени сходства между родственниками по изучаемым признакам и для анализа связей между реологическими характеристиками эритроцитов применялся корреляционный анализ. Коэффициенты корреляции между родственниками являлись основой для установления соотносительного вклада генетических и средовых факторов в изменчивость признаков. Коэффициенты корреляции между признаками использовались для проведения дальнейшего многомерного анализа, целью которого было выделение групп признаков, вариабельность которых обусловлена общими и независимыми причинами. Межклассовый коэффициент корреляции для количественных признаков вычислялся по методу сумм. Компонентное разложение общей фенотипической дисперсии признаков. Результаты компонентного разложения фенотипической дисперсии (VP) являлись основой для решения ряда важных генетических задач: установления типа наследования признака, вычисления генетических и средовых корреляций между признаками. Генетическую компоненту (G) раскладывали на аддитивную (Ga) и доминантную (Gd) , а средовую (Е) -на случайную (Ew) и общесемейную (Ее). Компонентное разложение общей фенотипической дисперсии изучаемых признаков проводилось с помощью матриц коэффициентов на основе семейных корреляций и осуществлялось путём решения системы линейных уравнений. Кроме того, проводилась оценка влияния материнского эффекта (ME) на вариабельность изучаемых признаков на основе определения разности между корреляциями родитель-ребёнок, рассматриваемых с учётом их пола.
Реологические свойства эритроцитов, фракционированных в соответствии со временем их циркуляции в кровеносном русле
В этой связи, полученные нами данные о снижении величины диаметра у тяжёлых кровяных телец (7.1 мкм) по сравнению клетками лёгкой фракции (7.3 мкм), выглядят закономерными.
Как известно, внутреннее содержимое эритроцита представляет собой идеальную ньютоновскую жидкость с сильной зависимостью вязкости от концентрации гемоглобина или степени его гидратации, поэтому существенный рост количественного показателя вязкости внутреннего содержимого у тяжёлых эритроцитов (8.51) по сравнению с лёгкими и средними клетками (8.07 и 8.29 соответственно) вполне объясним с учётом описанного выше увеличения количественного содержания гемоглобина в клетках в процессе их старения.
Анализ количественных показателей деформируемости эритроцитов выявил снижение их способности к изменению формы в ответ на внешнее воздействие у клеток, находящихся на завершающем этапе своего жизненного цикла. Для сравнения, величина коэффициента деформируемости лёгких эритроцитов составляла 61.18 10"3, а у тяжёлых клеток была 58.76 10"3. Различия статистически достоверны (t=3.68). Поскольку деформируемость клеток контролируется мембранным белком спектрином, то логично было бы предположить, что за уменьшение коэффициента деформируемости ответственны изменения количественного содержание и (или) изменения структуры взаимосвязи спектрина в процессе жизнедеятельности клетки. Из таблицы 15 видно, что лёгкие эритроциты у пробандов характеризуются более высоким коэффициентом агрегации (0.93) по сравнению с тяжёлыми кровяными тельцами (0.89). Коэффициент агрегации, обусловленный взаимодействием между красными клетками крови, зависит от поверхностного заряда мембраны эритроцита и структуры гликокаликса. В литературе имеются данные о потере клетками в процессе функционирования в кровеносном русле остатков сиаловой кислоты, формирующей отрицательный поверхностный заряд мембраны эритроцита. Возможно, это является одной из причин увеличения по мере старения клеток их способности агрегировать друг с другом. При анализе результатов по относительной вязкости эритроцитов был установлен рост данного показателя в группе тяжёлых эритроцитов (2.84) по сравнению с лёгкими клетками (2.66). Относительная вязкость является комплексной характеристикой клеток и определяется в основном их деформационными и агрегационными свойствами, которые, как видно из предыдущего обсуждения, претерпевают существенные изменения в процессе циркуляции клеток в кровеносном русле. Поэтому отмеченный рост коэффициента вязкости в процессе старения кровяных телец, на наш взгляд, является закономерным. Наиболее выраженный характер носило увеличение показателя максимума гемолизированных клеток по мере старения эритроцитов. У лёгких эритроцитов этот показатель составлял 18.41%, у средних клеток-26.76%, а у тяжёлых-32.97%. Кроме того, было отмечено уменьшение времени наступления максимума гемолиза с 4 минут для лёгких эритроцитов до 2.5 минут у тяжёлых, а также уменьшение продолжительности самого процесса гемолиза с 8.37 минут у лёгких клеток до 6.91 минут у тяжёлых. Всё это даёт основание говорить о снижении стойкости эритроцитов к действию гемолитика, что может быть обусловлено количественными и качественными изменениями, происходящими в структуре мембраны эритроцитов в процессе жизнедеятельности клетки. Анализируя полученные результаты в целом, можно сделать вывод о снижении функционального уровня реологических свойств клеток в процессе их старения, что выражается в уменьшении деформируемости эритроцитов, их диаметра и стойкости к действию гемолитика с одновременным увеличением агрегации, концентрации гемоглобина в клетках, вязкости как внутреннего содержимого, так и всего эритроцита в целом. Для достижения поставленных в настоящем исследовании задач нам представлялось важным провести сравнительный анализ количественных показателей реологических свойств лёгких, средних и тяжёлых эритроцитов между пробандами и их родственниками I степени генетического родства.
Роль генетических и средовых факторов в формировании дисперсии реологических своиств эритроцитов человека на различных этапах жизненного цикла клеток
Подобные тенденции в формировании генетических связей были характерны и для деформируемости средних эритроцитов.
Однако, у тяжёлых кровяных телец наблюдалось снижение корреляционных коэффициентов в парах мать-сын и сибс-сибс по исследуемому признаку. Это позволило сделать вывод об уменьшении роли генетических факторов в деформируемости клеток на заключительном этапе их жизненного цикла.
Существенные генетические корреляции были характерны и для показателя максимума гемолизированных клеток. Среди лёгких эритроцитов по этой характеристике были получены достаточно выраженные корреляционные связи, превышающие значение 0.7 в группах мать-дочь, мать-сын, сибс-сибс, что указывает на значительный вклад генетических факторов в детерминации данного показателя. При анализе внутрисемейных корреляций максимума гемолизированных клеток обращает на себя внимание ассиметрия, имеющая место между родителями и детьми, в сторону более высоких коэффициентов корреляции в группах матери и их дети, позволяющая полагать о проявлении материнского эффекта. С увеличением возраста эритроцита генетические связи для рассматриваемого показателя претерпевают изменения. В группах матери-дети и сибс-сибс у тяжёлых клеток крови происходит снижение коэффициентов корреляции до значений (0.561-0.619) при одновременном росте корреляционной зависимости между родителями. Это указывает на возрастающее в процессе жизнедеятельности клетки влияние средовых факторов в формировании устойчивости мембран эритроцитов к гемолитическому воздействию.
При анализе внутрисемейных корреляций для вязкости эритроцитов лёгкой фракции были также получены высокие значения коэффициентов корреляции в парах мать-дочь и сибс-сибс, что указывает на значительный вклад генетических факторов в детерминацию указанного признака. Низкое значение корреляционной связи между супругами в сравнении с другими анализируемыми связями позволяет полагать о наличии выраженном материнском эффекте, влияющем на процесс формирования показателя вязкости.
У кровяных телец средней фракции существенных отличий для вязкости по величине коэффициентов корреляции от лёгких эритроцитов не наблюдалось.
В тоже время, фракция старых эритроцитов характеризуется ослаблением корреляционных связей в группах матери и дети, сибс-сибс (0.387-0.411) по сравнению с лёгкими клетками крови (0.569-0.694). Параллельное увеличение коэффициентов корреляции в группах отцы и дети, мать-отец является показателем возрастающей роли средовых факторов, как систематических (Ее), так и случайных (Ew) в детерминации вязкости эритроцитов на завершающей стадии их функционирования в кровеносном русле.
Определённый интерес представляют данные о высоких корреляционных связях по величине диаметра лёгких эритроцитов в парах мать-дочь, мать-сын, сибс-сибс. Это свидетельствует о выраженном влиянии генетических факторов, отвечающих завнутрисемейное сходство этой количественной характеристики на начальном этапе жизненного цикла клеток.
Для диаметра средних эритроцитов наблюдалось увеличение корреляционных коэффициентов в группах отцы и их дети, что может быть обусловлено возрастающей ролью средовых компонент в детерминации этого показателя.
Стабильное снижение корреляционных связей в группах мать и дети, сибс-сибс для диаметра тяжёлых эритроцитов, а также увеличение коэффициентов корреляции у супругов и в парах отец-дочь, отец-сын позволяют предположить усиление влияния случайных и систематических средовых факторов в определении размера кровяных телец в конце их жизнедеятельности.
Существенными были коэффициенты корреляции в группах мать-дочь, сибс-сибс и мать-сын для признаков, характеризующих вязкость внутреннего содержимого лёгких эритроцитов и их способность к агрегации. Значение корреляционных связей в указанных парах превышало уровень 0.5. Это указывает на наличие достаточно выраженной генетической детерминации исследуемых показателей у лёгких клеток. Выраженная ассиметрия корреляций между родителями и детьми в сторону более высоких значений в парах мать- дети свидетельствует о проявлении материнского эффекта.
