Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1 Адаптационные изменения, вызываемые регулярными аэробными физическими 15
1.2 Роль белка PGC-1а в регуляции митохондриального биогенеза 19
1.3 Механизмы активации белка PGC-1 в ответ на сократительную активность 21
1.4 Регуляция экспрессии гена PPARGCIA с канонического промотора 24
1.5 Регуляция экспрессии гена PPARGCIA с альтернативного (индуцибельного) промотора 26
1.6 Регуляция экспрессии укороченных изоформ белка pgc-1 34
1.7 Экспериментальные подходы для изучения молекулярных механизмов адаптации скелетной мышцы человека к физической нагрузке 42
1.8 Молекулярные механизмы адаптации скелетной мышцы к аэробным нагрузкам различной длительности 44
1.9 Молекулярные механизмы адаптации скелетной мышцы к аэробным нагрузкам различной интенсивности 48
1.10 Заключение 58
2. Методология и методы исследования 60
3. Результаты и обсуждение 89
3.1 Экспрессия различных изоформ мРНК PPARGCIA в скелетной мышце человека в покое и после аэробной нагрузки 89
3.1.1 Заключение 94
3.2 Особенности регуляции экспрессии гена PPARGCIA в скелетной мышце человека 95
3.2.1 Промотор-специфичная регуляция экспрессии гена PPARGC1A после нагрузок с различной интенсивностью 97
3.2.2 Влияние AMPK на промотор-специфичную регуляцию экспрессии гена PPARGC1A 104
3.2.3 Влияние системных факторов и уровня тренированности скелетной мышцы на промотор-специфичную регуляцию экспрессии гена PPARGC1A ILL 111
3.2.4 Потенциальная роль репрессоров в регуляции экспрессии PPARGC1A с индуцибельного промотора 121
3.2.5 Заключение 124
3.3 Модулирование молекулярных ответов на аэробную физическую нагрузку в скелетной мышце человека 126
3.3.1 Эффекты длительности аэробной нагрузки 128
3.3.2 Эффекты интенсивности аэробной нагрузки 134
3.3.3 Эффекты паттерна аэробной нагрузки 144
3.3.4 Эффекты приема незаменимых аминокислот после аэробной нагрузки 150
3.3.5 Заключение 157
3.4 Адаптация скелетной мышцы человека к регулярным аэробным упражнениям (аэробной тренировке) 158
3.4.1 Влияние регулярных аэробных упражнений на базальный уровень фосфорилирования сигнальных киназ и содержание транскрипционных факторов 160
3.4.2 Специфический для сократительной активности ответ транскриптома на однократное и регулярные аэробные упражнения, поиск потенциальных транскрипционных регуляторов 168
3.4.3 Заключение 187
Заключение 188
Выводы 193
Список сокращений и условных обозначений 194
Список литературы 198
Приложения 231
- Адаптационные изменения, вызываемые регулярными аэробными физическими
- Экспрессия различных изоформ мРНК PPARGCIA в скелетной мышце человека в покое и после аэробной нагрузки
- Эффекты длительности аэробной нагрузки
- Специфический для сократительной активности ответ транскриптома на однократное и регулярные аэробные упражнения, поиск потенциальных транскрипционных регуляторов
Адаптационные изменения, вызываемые регулярными аэробными физическими
Хорошо известно, что регулярные физические нагрузки приводят к выраженным изменениям функциональных возможностей организма в целом и его отдельных систем. Эти изменения затрагивают, прежде всего, мышечную систему, а также системы вегетативного обеспечения мышечной деятельности. Значительные адаптационные изменения, наблюдаемые в скелетных мышцах, связаны, прежде всего, с тем, что во время выполнения физической нагрузки в мышцах многократно возрастает скорость гидролиза АТФ. Для поддержания необходимой скорости ресинтеза АТФ резко активируются бескислородные реакции (аденилаткиназная и креатинкиназная реакции и гликолиз) и реакции окислительного фосфорилирования. Для обеспечения необходимой скорости протекания окислительных реакций в работающей мышце существенно возрастают кровоток, потребление кислорода и различных субстратов: глюкозы, жирных кислот и др. Одновременно в работающем мышечном волокне происходит значительное накопление ионов кальция и различных метаболитов, наблюдается снижение pH, энергетического заряда клетки и окислительно-восстановительного потенциала.
Важно отметить, что выраженность перечисленных выше изменений зависит от режима мышечного сокращения. Более того, различные физические нагрузки при регулярном предъявлении вызывают различные адаптационные изменения. Так, регулярное использование коротких околомаксимальных физических нагрузок, вызывающих глубокие метаболические сдвиги в работающей мышце (силовая тренировка), приводит к увеличению размеров тренируемых мышц и их максимальной силы; при этом не наблюдается значимых изменений в активности окислительных ферментов и объемной плотности митохондрий, т.е. в окислительных возможностях мышц. Напротив, регулярное использование низкоинтенсивных продолжительных (несколько десятков минут) упражнений (аэробная тренировка) приводит к увеличению окислительных возможностей мышц и аэробной работоспособности, т.е. способности выполнять физическую нагрузку, энергообеспечение которой идет преимущественно за счет аэробного ресинтеза АТФ. Такие различия в адаптационных ответах связаны с тем, что разные физические нагрузки вызывают различные метаболические сдвиги в работающей мышце и крови; это приводит к активации различных сигнальных каскадов и к изменению экспрессии различных генов и белков. Аэробная тренировка приводит к развитию адаптационных изменений на уровне целого организма и на уровне различных систем и органов [7]. Так при сравнении нетренированных людей и спортсменов было показано [1, 2, 11, 26, 49], что аэробная тренировка приводит к увеличению размера камер сердца и максимального сердечного выброса, объема циркулирующей крови и мышечной капилляризации – ключевых показателей, определяющих способность организма человека доставлять кислород к митохондриям работающих мышц. С другой стороны, увеличивается способность скелетных мышц утилизировать доставляемый с кровью кислород: в тренируемых мышцах увеличивается объёмная плотность митохондрий и активность окислительных ферментов. Следует отметить, что в скелетных мышцах аэробная тренировка, прежде всего, активирует биогенез митохондрий, т.е. увеличивает митохондриальную массу и активность окислительных ферментов, и не влияет на миогенез. Так, в тренированных мышцах не наблюдается увеличение размера мышц и площади поперечного сечения мышечных волокон [2, 5, 188], тогда как объемная плотность митохондрий возрастает с 3-4 % в нетренированной мышце до 8-10 % в мышце высококвалифицированных спортсменов, тренирующих аэробные возможности [49, 159, 160, 219]. Одновременно в тренированных мышцах по сравнению с нетренированными возрастает активность окислительных ферментов и содержание митохондриальных белков, тогда как для ферментов гликолиза, локализованных в цитоплазме, показано отсутствие изменений или даже снижение [73, 74, 121, 122, 151, 152, 201]. В результате адаптации скелетных мышц, респираторной и сердечно-сосудистой систем значительно повышается максимальная скорость потребления кислорода работающими мышцами (т.е. скорость ресинтеза АТФ за счет реакций окисления) и возрастает способность выполнять длительную работу, т.е. увеличивается аэробная работоспособность. Интересно отметить, что активность окислительных ферментов, нормированная на митохондриальную массу, не различается в мышцах тренированных и нетренированных людей [81, 82], т.е. изменение функциональных возможностей мышц связано именно с изменением митохондрильной массы.
Увеличение работоспособности в тренированных мышцах связано с изменениями в субстратном обеспечении сократительной активности мышц. Так в тренированных мышцах наблюдается увеличение запасов энергетических субстратов: гликогена и триглицеридов, локализованных в липидных каплях. Интересно, что увеличение объема липидных капель найдено в мышцах людей с избыточной массой тела [18]. Однако тренированные мышцы, в отличие от мышц людей с метаболическим синдромом и диабетом 2 типа, активно окисляют жиры в покое и при физической нагрузке низкой и умеренной интенсивности [318]. Важно отметить, что эффекты аэробной тренировки, связанные со скелетными мышцами, оказывают влияние на многие системные показатели. Это объясняется тем, что у человека мышечная масса составляет более 30 % от веса тела, и поэтому изменение метаболизма скелетных мышц оказывает значимое влияние на метаболизм целого организма. Помимо этого, известно, что работающие скелетные мышцы могут выделять множество метаболически активных молекул (миокинов), тем самым влияя на работу различных систем и органов [266, 324]. Например, показано, что регулярные аэробные нагрузки увеличивают инсулинозависимую скорость потребления глюкозы организмом в покое, тогда как при метаболическом синдроме этот показатель снижается [18, 226, 366]. При этом у людей с метаболическим синдромом около 90 % глюкозы потребляется скелетными мышцами, также как и у здоровых людей [84]. Это означает, что снижение инсулинозависимой скорости потребления глюкозы организмом связано именно со снижением метаболических функций скелетных мышц, которые во многом зависят от их окислительных возможностей. Помимо этого регулярные аэробные нагрузки снижают риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний как у молодых здоровых людей, так и у пожилых людей, пациентов с метаболическим синдромом и диабетом второго типа [201, 227, 266, 366]. Напротив, снижение функциональных возможностей скелетных мышц, вызванное хроническим уменьшением двигательной активности, связано с возникновением многих социально значимых заболеваний, таких как метаболический синдром и диабет второго типа, заболевания сердечнососудистой системы, депрессия и синдром хронической усталости, а также со снижением продолжительности жизни [12, 59, 86, 266].
Увеличение/поддержание аэробной работоспособности важно для различных контингентов. Это важно для людей, чья профессиональная деятельность связана с выполнением длительных и интенсивных физических нагрузок, например, для спортсменов, военных, спасателей. С другой стороны, следует помнить, что одна из наиболее острых проблем современного общества – это гипокинезия – хроническое снижение двигательной активности, вызывающее снижение функциональных возможностей мышц, мышечной массы и серьезные нарушения в функционировании практически всех органов и систем организма. Поэтому увеличение/восстановление аэробных возможностей до нормального уровня это важная задача для большинства современных людей, живущих в развитых странах, для людей подвергшихся длительной (несколько недель) гипокинезии в результате пребывания в постельном режиме, а также для людей с избыточным весом и людей, страдающих метаболическим синдромом и диабетом второго типа. Интересно отметить, что в отличие от спортсменов, тренирующих аэробные возможности, у нетренированных людей аэробная работоспособность ограничена, прежде всего, низкими окислительными возможностями скелетных мышц и их высокой утомляемостью, а не низкой производительностью кислородтранспортной системы [9, 117]. Это подчеркивает важность изучения механизмов регуляции митохондрального биогенеза в скелетных мышцах человека. Ниже в обзоре будут рассмотрены молекулярные механизмы адаптации скелетной мышцы к аэробным нагрузкам.
Экспрессия различных изоформ мРНК PPARGCIA в скелетной мышце человека в покое и после аэробной нагрузки
В нескольких работах было показано, что в мышцах мыши и человека экспрессируется несколько изоформ мРНК PPARGC1A, начинающихся с канонического (мРНК PPARGClA-a) и альтернативного (мРНК PPARGClA-b и PPARGClA-c) промоторов [66, 242, 391]. В результате альтернативного сплайсинга между экзонами 6 и 7, могут образовываться изоформы мРНК (Щ-PPARGCIA), кодирующие укороченные белки NT-PGC-1а [399], функции которых несколько отличаются от функций полноразмерных изоформ белков PGC-la [61, 313, 353 ]. Таким образом, ген PPARGC1A потенциально может продуцировать как минимум, шесть изоформ [60]. Однако, в другом исследовании было показано, что в скелетной мышце мыши и человека экспрессируется только четыре изоформы: две вышеупомянутые изоформы (мРНК PPARGClA-a и KT-PPARGCIA-b) и еще две неописанные ранее мРНК PPARGC1A-2 и PPARGC1A-3, содержащие множественный сплайсинг между экзонами [313], что противоречит описанным выше результатам. Кроме этого, у человека в нервной ткани [339] и в печени [104] были описаны другие тканеспецифичные промоторы и изоформы мРНК PPARGC1A. Таким образом, несмотря на довольно большое количество работ, посвященных изучению экспрессии изоформ мРНК PPARGC1A, до сих пор не сформировалось четкого представления о том, какие изоформы этого гена экспрессируются в скелетных мышцах человека.
Цель данного этапа исследования - идентифицировать старты транскрипции гена PPARGC1A в скелетной мышце человека и выявить наиболее значимые сплайс-сайты в покое до упражнения (в базальных условиях) и после однократной аэробной физической нагрузки. Для этого был использован метод высокопроизводительного РНК-секвенирования и проведен анализ соединений экзон-экзон для гена PPARGC1A. Биопсические пробы из т. vastus lateralis брали у двух человек до, через 4 ч и 8 ч после нагрузки на велоэргометре (65 мин, 70 % КОгтах) - работы большой мышечной массы. Помимо этого проанализировали сплайсинг этого гена в т. vastus lateralis при выполнении упражнения умеренной интенсивности с участием малой мышечной массы «разгибание ноги в коленном суставе» (60 мин); для этого у семи человек брали пробы ткани до и через 4 ч после упражнения.
Во второй части исследования, для подтверждения результатов, полученных с помощью РНК-секвенирования, подобрали праймеры, специфически детектирующие обнаруженные изоформы, и с помощью метода ПЦР в реальном времени целенаправленно определяли экспрессию этих изоформ. Для этого у семи добровольцев брали пробы из т. vastus lateralis до, через 3 ч и 5 ч после нагрузки на велоэргометре (85 мин, 60 % КОгтах). Выбор этих временных точек связан с тем, что в первой части работы изменения в экспрессии гена PPARGC1A и появление нового старта транскрипции и новых сплайсинг-сайтов были обнаружены только на 4 ч восстановления после нагрузки.
Важно отметить, что молекулярные ответы (экспрессия различных метаболических генов и активация сигнальных киназ) на однократную аэробную нагрузку в скелетных мышцах нетренированных людей более выражены и значительно менее специфичны по сравнению с мышцами спортсменов, тренирующий аэробные возможности [69, 231, 252, 270, 323, 393]. Поэтому в это исследование привлекались люди, адаптированные к регулярным аэробным нагрузкам: спортсмены-любители, тренирующие аэробные возможности (велосипедисты, бегуны, лыжники).
Результаты
Картирование соединений экзон-экзон на геномную ДНК показало, что в покое ген PPARGC1A экспрессируется только с канонического (проксимального) промотора с экзона 1а. Аэробная нагрузка на велоэргометре вызвала увеличение экспрессии, как с канонического, так и с альтернативного (дистального) промоторов: мРНК, берущие начало с экзона 1a и 1b, соответственно. Транскриптов, экспрессирующихся с альтернативного промотора с экзона 1с, не было обнаружено. В полном соответствии с предыдущими данными [242, 391] альтернативный промотор был обнаружен -14 т.п.н. выше канонического. Других стартов транскрипции, типичных для других тканей, найдено не было. Дополнительный экзон 7а, содержащий стоп-кодон, был найден во всех пробах. Транскрипты, содержащие экзон 7а, кодируют укороченные белки NT-PGC-la, содержащие 270 а.о., в отличие от мРНК не содержащих этого экзона и кодирующих 800 а.о. Важно отметить, что другие сплайс-варианты соединений экзон-экзон были слабо представлены и не детектировались во всех пробах. На Рисунке 3.1 показаны результаты картирования прочтений, содержащих соединения экзон-экзон, на геномную ДНК для гена PPARGC1А.
При анализе данных РНК-секвенирования после работы малой мышечной массы было обнаружено, что через 4 ч после нагрузки происходили такие же изменения в старте транскрипции гена PPARGC1A, как и при работе большой мышечной массы. Помимо этого, дополнительный экзон 7a, содержащий стоп-кодон, был найден во всех образцах, как и после работы большой мышечной массы (данные не представлены).
Результаты, полученные с помощью РНК-секвенирования, полностью подтвердились в отдельном исследовании с использованием ПЦР в реальном времени. Для детекции изоформ мРНК, берущих начало с канонического промотора, использовали пару праймеров к экзононам 1a и 2, для изоформ мРНК, берущих начало с альтернативного промотора – пары праймеров к экзонам 1b и 2, а также 1с и 2; для детекции изоформ мРНК, кодирующих укороченный белок – пару праймеров к экзонам 5 и 7а; для детекции общей экспрессии гена – пару праймеров к экзону 2, общему для всех изоформ.
Как показано на Рисунке 3.2, в покое ген PPARGC1A экспрессируется только с канонического промотора с экзона 1а. После нагрузки экспрессия с канонического промотора увеличивается незначительно, то есть этот промотор экспрессирует конститутивно.
Напротив, экспрессия с альтернативного промотора крайне низка в покое, тогда как после нагрузки увеличивается на два порядка и вносит больший вклад в общую экспрессию гена PPARGC1A, чем канонический промотор. При этом экспрессия с альтернативного промотора идет, главным образом, через экзон 1b, тогда как уровень мРНК, начинающихся с экзона 1с, крайне низок как до, так и после нагрузки. Изоформы мРНК, содержащие дополнительный экзон 7а и преждевременный стоп-кодон, составляют более 30 % от общей экспрессии гена PPARGC1A, как в покое, так и после сократительной активности.
Эффекты длительности аэробной нагрузки
Проведенный анализ литературы (раздел 1.8, 1.9 и [6]) показал, что вызванные сократительной активностью молекулярные ответы в мышце зависят от параметров физической нагрузки: от ее продолжительности, интенсивности и паттерна. Следует отметить, что в отдельных работах изучалось влияние длительности нагрузки на активацию СаМКП [307, 308] и АМРК [ПО, 204, 305, 358]. Однако эффекты длительности нагрузки на экспрессию гена PPARGC1A и PGC-la-зависимых генов остаются не исследованными. Целью этого раздела было изучение влияния аэробных нагрузок различной продолжительности на экспрессию гена PPARGC1A и PGC-la-зависимых генов в скелетной мышце человека, адаптированного к физическим нагрузкам аэробного характера.
Белковый обмен в скелетной мышце зависит от скорости синтеза и деградации белка [194]. Известно, что аэробные упражнения умеренно стимулируют увеличение скорости синтеза мышечных белков [374] и могут активировать их катаболизм. Последнее связано с активацией убиквитин-протеасомной системы, которая, по крайней мере частично, зависит от активации АМРК [190, 248]. Влияние аэробных упражнений на регуляцию этой системы исследовано недостаточно, поэтому второй задачей настоящей работы было изучить влияние аэробных нагрузок различной длительности на сигнальный путь FOXOl (Forkhead box protein 01)–ЕЗ убиквитин-лигазы (TRIM63 (MURF1) и FBX032 (MAFbx)). Для этого 9 мужчин спортсменов-любителей в разные дни в случайном порядке выполнили на велоэргометре три нагрузки на уровне около 60 % К02тах длительностью 30, 60 и 90 мин. Биопсические пробы из т. vastus lateralis брали через 10 мин, 3 ч и 5 ч после окончания нагрузки.
Результаты
Во время упражнений длительностью 30, 60 и 90 мин интенсивность нагрузок не различалась и составила 58(56-65) %, 57(53-64) % и 60(56-66) % от К02тах, соответственно. На Рисунке 3.17 показано, что субъективная оценка тяжести работы во всех тестах была 5 баллов. Пиковое содержание лактата в крови было зарегистрировано между 20 и 30 минутами работы ( 2,1 мМ) и не различалось между тестами. Значимое увеличение содержания свободных жирных кислот в крови было обнаружено только через 90 мин работы.
Представлены медиана и межквартильный разброс. Звездочкой обозначено отличие от исходного уровня при P 0,05.
На Рисунке 3.18 показано, что тестовые нагрузки не вызвали изменений в уровне фосфорилирования АМРКа72, р38 МАРК80 182 и элонгационного фактора 2 (eEF26) -одного из маркеров активации САМКИ [305]. Экспрессия общей мРНК гена PPARGC1A увеличилась в 3,1 и 3,6 раз через 5 ч после окончания нагрузок продолжительностью 60 и 90 мин, соответственно.
Рисунок 3.18 - Изменение уровня фосфорилирования сигнальных белков и содержания общей мРНК PPARGC1A в т. vastus lateralis после нагрузки на велоэргометре длительностью 30, 60 и 90 мин относительно исходного уровня. А - репрезентативный иммуноблот. Б, В, Г -уровень фосфорилирования АМРКа72, р38 МАРК80 182 и eEF26 через 10 мин после окончания различных нагрузок. В - содержание мРНК PPARGC1A через 5 ч после окончания различных нагрузок
В Таблице 3.2 показано, что для всех исследованных потенциальных генов-мишеней белка PGC-1: митохондириальные транскрипционные факторы (TFAM и TFB2M), гены, кодирующие митохондриальные белки (CS, COX2), регуляторы ангиогенеза (VEGFA) и углеводно-жирового обмена (PDK4 и HADH), не было найдено значимых увеличений экспрессии после всех нагрузок.
Как показано на Рисунке 3.19, ни одна из тестовых нагрузок не повлияла на уровень фосфорилирования транскрипционного фактора FOXO1Ser256. Несмотря на это, экспрессия гена TRIM63 (MURF1) на 5 ч восстановления после нагрузок длительностью 30 и 60 мин была снижена в 5 и 3 раз, соответственно. Экспрессия других генов, связанных с регуляцией катаболизма (FBX032 (MAFbx), MSTN, FST) не изменилась.
Важно отметить, что для исследования эффектов длительности нагрузки была выбрана умеренная интенсивность упражнения: 60 % от КОгтах. Такая интенсивность не вызывает прогрессирующего накопления метаболитов гликолиза в мышце и не приводит к прогрессирующему развитию утомления, по крайней мере, в течение 90 мин работы. Эти рассуждения подтверждаются отсутствием прироста содержания лактата в крови даже при выполнении работы продолжительностью 90 мин. Это позволяет предположить, что даже при нагрузке продолжительностью 90 мин не происходило выраженного дополнительного рекрутирования высокопороговых мотонейронов, иннервирующих мышечные волокна II типа. То есть обнаруженные в скелетной мышце изменения молекулярных показателей были связаны, главным образом, с увеличением длительности работы уже работающих волокон, а не с рекрутированием новых мышечных волокон (преимущественно волокон II типа, обладающих низкими окислительными возможностями и высокой утомляемостью).
Было показано, что в адаптированных к аэробным тренировкам скелетных мышцах аэробная нагрузка умеренной интенсивности не увеличивает уровень фосфорилирования сигнальных киназ, активирующих белок PGC-1. Несмотря на отсутствие увеличения уровня фосфорилирования этих киназ, нагрузки длительностью 60 и 90 мин вызвали увеличение экспрессии гена PPARGC1A. Следовательно, при нагрузках умеренной интенсивности увеличение экспрессии гена PPARGC1A происходило без активации киназ AMPK, p38 MAPK и САМКИ, что полностью согласуется с результатами, описанными в разделе 3.2. Увеличение продолжительности нагрузки с 60 до 90 мин не привело к увеличению экспрессии гена PPARGC1A. Отсутствие прироста экспрессии потенциально зависимых от PGC-1 генов, скорее всего, может объясняться относительно невысокой интенсивностью предъявляемых нагрузок и, как следствие, отсутствием активации киназ, регулирующих активность PGC-1 [96], а также достаточно высоким уровнем тренированности испытуемых [323]. Отсутствие эффектов, связанных с увеличением длительности нагрузки с 60 до 90 мин, хорошо согласуется с результатами работ, исследовавших эффекты длительной аэробной тренировки у крыс [92] и у людей [296, 309]. У крыс, тренировавшихся 8 недель по 30, 60 и 90 мин/день, увеличение длительности нагрузки с 60 до 90 мин не оказало дополнительного влияния на вызванное тренировкой увеличение содержания цитохрома с в тренируемых мышцах. Сходные результаты были получены при тренировке людей с избыточной массой тела: двукратное увеличение продолжительности тренировочных нагрузок не вызвало дополнительного увеличения маркёров митохондриальной плотности (содержание цитратсинтазы и белков-компонентов митохондриальных комплексов) в т. vastus lateralis, а также КОгтах организмом.
Вопреки нашему предположению оказалось, что даже 90 минутные аэробные нагрузки умеренной интенсивности не вызвали увеличение экспрессии генов, участвующих в регуляции катаболизма в скелетной мышце, в частности специфических мышечных ЕЗ убиквитин-лигаз TRIM63 (MURF1) и FBX032 (MAFbx). По-видимому, это было связано с отсутствием снижения уровня фосфорилирования, то есть с отсутствием активации, транскрипционного фактора FOX01 - регулятора экспрессии этих генов [133]. Любопытно отметить, что между длительностью нагрузки и экспрессией гена TRIM63 (MURF1) найдена положительная зависимость. Можно предположить, что увеличение продолжительности нагрузки более 90 мин может привести к увеличению экспрессии гена этой Е3 лигазы.
Таким образом, в результате исследования было показано, что увеличение продолжительности аэробной нагрузки умеренной интенсивности (60 % от КОгтах) с 60 до 90 мин не приводит к дополнительному приросту экспрессии гена PPARGC1A и не увеличивает экспрессию потенциально зависимых от PGC-l генов. При этом даже 90 минутные нагрузки не вызывали активации сигнального пути FOXOl–ЕЗ убиквитин лигазы. Данные, представленные в разделе 3.3.1, опубликованы в [281 ].
Специфический для сократительной активности ответ транскриптома на однократное и регулярные аэробные упражнения, поиск потенциальных транскрипционных регуляторов
Анализ изменений транскриптома после аэробного упражнения дает уникальную возможность выявить направленность адаптационных изменений, развивающихся в скелетной мышце в полногеномном масштабе, а также предсказать транскрипционные регуляторы, связанные с изменением генной экспрессии. Несколько исследований, использовавших ДНК-микрочипы [58, 223, 250, 283, 361] и РНК-секвенирование [89], уже изучали изменение транскриптома в m. vastus lateralis человека через 0,5, 1, 2,5, 3, 4, 5, 8, 24, 48 и 96 ч после однократной аэробной физической нагрузки. Следует отметить, что на сегодняшний день остается неизученным вопрос о влиянии регулярных аэробных упражнений на изменение транскриптома в базальном состоянии. Помимо этого, только в одном из цитируемых выше исследований был проведен поиск транскрипционных регуляторов, связанных с изменением генной экспрессии через 0,5 ч после нагрузки [58]. Более того, результаты, полученные в исследованиях на мышцах грызунов и в наших исследованих, поднимают вопрос о корректности интерпретации данных об изменениях транскриптома мышц после физической нагрузки у людей. Так, в скелетной мышце грызунов в покое в течение суток изменяется экспрессия более 200 генов, что связано с осцилляциями экспрессии нескольких генов-регуляторов циркадных ритмов Clock and Arntl. Большая часть этих суточных изменений связана с экспрессией генов, регулирующих метаболизм, а также с экспрессией специфических регуляторов миогенеза [230, 238, 325]. Потенциальное влияние циркадных ритмов на изменение транскриптома после аэробного упражнения было показано в нашем исследовании для мышц человека (Раздел 3.3.2, [283]). Это означает, что описанные ранее для скелетной мышцы человека изменения транскриптома после физической нагрузки могут быть связаны не только с сократительной активностью как таковой, но и с суточными ритмами. Помимо этого, различные системные факторы могут оказывать выраженное влияние на изменение транскриптома в работавшей скелетной мышце человека [58], например, нервная активность, гуморальные факторы, прием той или иной пищи во время исследования или отсутствие приема пищи.
Цель настоящего этапа исследования – выявить изменения генной экспрессии, связанные непосредственно с сократительной активностью в скелетной мышце человека (специфические для сократительной активности изменения транскриптома). Для этого пробы ткани после аэробного упражнения (разгибание одной ноги в коленном суставе в течение 1 ч) брали как из работавшей мышцы, так и из неработавшей мышцы контрлатеральной ноги, а изменение генной экспрессии оценивали с помощью РНК-секвенирования при сопоставлении данных одноименных мышц двух ног в каждой временной точке (до, через 1 и 4 ч после окончания упражнения). Известно, что адаптация скелетной мышцы к регулярным нагрузкам может снижать генный ответ на однократное упражнение [323]. Поэтому мы сопоставляли специфические для сократительной активности изменения транскриптома до и после двух месяцев аэробной тренировки. Такой подход позволил выявить гены, которые отвечают на нагрузку как в нетренированной, так и в тренированной скелетной мышце, то есть гены, играющие ключевую роль в адаптации к однократной нагрузке независимо от уровня тренированности.
Помимо этого, мы предположили, что адаптация скелетной мышцы к регулярным нагрузкам связана не только с кратковременным изменением транскриптома после каждого стрессорного воздействия (однократное упражнение), но и с выраженным изменением экспрессии множества генов в базальном состоянии после двух месяцев аэробной тренировки. Для проверки этого предположения мы оценивали изменения транскриптома при сопоставлении проб, взятых в покое до и после двух месяцев тренировки. Кроме этого, с помощью метода панорамной масс-спектрометрии были оценены вызванные регулярными аэробными упражнениями изменения содержания высокопредставленных мышечных белков, в частности, митохондриальных белков. Это позволило оценить роль транскрипции в увеличениии содержания митохондриальных белков, вызванного аэробной тренировкой.
Результаты
Изменения транскриптома после упражнения в работавшей и неработавшей мышце
Кластерный анализ показал, что у всех испытуемых изменения содержания мРНК после упражнения в работавшей и в неработавшей мышце хорошо разделились на два главных кластера, как показано в Приложении Г. На Рисунке 3.32 А видно, что в работавшей мышце через 1 и 4 ч после окончания упражнения было обнаружено 1134 и 1844 дифференциально экспрессируемых гена (ДЭГ) при сравнении с этой же мышцей до нагрузки, при этом 65 % ДЭГ увеличили экспрессию. На Рисунке 3.32 Б показано, что одновременно в неработавшей мышце также произошли выраженные изменения: 270 и 419 генов изменили экспрессию, любопытно, что большая их часть (-60 %) снизила экспрессию. ДЭГ в неработавшей мышце были ассоциированы с биологическими процессами регуляция транскрипции, внутриклеточная сигнализация и циркадные ритмы, как показано на Рисуноке 3.32 Б.
Специфичный для сократительной активности транскриптомный ответ в нетренированной и тренированной мышце
Для выявления специфических для сократительной активности генов определяли ДЭГ между работавшей и неработавшей мышцей в каждой временной точке. В пробах, взятых до упражнения, не было обнаружено ДЭГ (что свидетельствует о сопоставимом уровне генной экспресии в обеих мышцах), тогда как через 1 и 4 ч после упражнения было выявлено 805 и 1283 ДЭГ, соответственно; эти специфические для сократительной активности изменения транскриптома были связаны, главным образом, с увеличением ( 80 %) генной экспрессии, как показано на Рисунке 3.32 В. Сопоставление специфических для сократительной активности изменений транскриптома с изменениями транскриптома после нагрузки только в работавшей мышце (относительно уровня до нагрузки) показало, что в работавшей мышце только 50 % ДЭГ связаны со специфическим для сократительной активности ответом, как изображено на Рисунке 3.33.
Для сопоставления специфического транскриптомного ответа в нетренированной и тренированной мышце, упражнение «разгибание одной ноги в коленном суставе» повторили с той же относительной интенсивностью (-65 % от Wmax) через 8 недель аэробной тренировки на велоэргометре. На Рисунке 3.34 А и Б показано, что тренировка увеличила аэробную работоспособность мышц-разгибателей коленного сустава: максимальная мощность в тесте с возрастающей нагрузкой при разгибании одной ноги в коленном суставе возросла на 24 % и поэтому после тренировки абсолютная мощность упражнения «разгибание одной ноги в коленном суставе» также была увеличена. Несмотря на это, в тренированной мышце специфический ответ транскриптома на сократительную активность был значительно менее выражен, чем в нетренированной мышце: 352 и 183 ДЭГ через 1 и 4 ч после нагрузки в тренированной мышце против 805 и 1283 ДЭГ в нетренированной мышце, как показано на Рисунке 3.34 В.
На Рисунке 3.34 В и Г показано, что при сопоставлении специфического ответа транскриптома на сократительную активность в нетренированной и тренированной мышце были выделены ДЭГ, уникальные для нетренированной мышцы и общие для нетренированной и тренированной мышцы. Наиболее значимые биологические процессы, ассоциированные с этими наборами ДЭГ, это регуляция транскрипции и ангиогенез.