Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Морфологическая организация дофаминергических систем мозга 12
1.2. Нигростриатная дофаминергическая система 13
1.2.1 Морфологическая характеристика нигростриатной дофаминергической системы 13
1.2.2. Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы 15
1.2.2.1 Синтез дофамина 15
1.2.2.2 Запасание, выделение и обратный захват дофамина 20
1.2.2.3 Деградация дофамина
1.2.3 Регуляция дофаминергических нейронов нигростриатной системы 24
1.2.4 Роль дофаминергических нейронов нигростриатной системы в регуляции моторного поведения 25
1.3. Функциональная недостаточность нигростриатной системы при болезни
Паркинсона 27
1.3.1 Патогенез болезни Паркинсона 28
1.3.2. Механизмы нейродегенерации при болезни Паркинсона 30
1.3.2.1 Окислительный стресс 30
1.3.2.2 Глутатион и антиоксидантная система 30
1.3.2.3 Нарушение работы митохондрий 32
1.3.2.4 Эндогенные токсины 34
1.3.2.5 Fe2+ и нейромеланин 35
1.3.2.6 Агрегация белков и убиквинтиновая система 36
1.3.2.7 Воспалительный процесс 38
1.3.2.8 Апоптоз, некроз и аутофагия 39
1.3.3 Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона 40 1.3.4. Экспериментальное моделирование болезни Паркинсона 41
1.3.4.1 Генетические модели 42
1.3.4.2 Нейровоспалительные модели 44
1.3.4.3 Нейротоксические модели 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы 54
2.1. Животные и эксперименты 54
2.1.1 Оценка активности тирозингидроксилазы 54
2.1.2 Ингибирование обратного захвата дофамина с помощью 2-метил-4-фенил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-амина 54
2.1.3 Инъекции регуляторного пептида Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) 2.2 Взятие материала 55
2.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией 58
2.4 Иммуногистохимия 58
2.5 Световая микроскопия и анализ изображений 59
2.6 Полуколичественный анализ содержания тирозингидроксилазы в нейронах черной субстанции и в терминалях аксонов стриатума 60
2.7 Иммуноферментный анализ 61
2.8 Статистическая обработка результатов 62
ГЛАВА 3. Результаты 63
3.1. Морфологическая характеристика и количественный анализ нигростриатной
дофаминергической системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП 63
3.1.1 Морфологическая характеристика и количественный анализ тел дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции 63
3.1.2 Морфологическая характеристика и количественный анализ дофаминергических терминалей в дорсальном стриатуме 67
3.2. Функциональное состояние нигростриатной системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП 70
3.2.1 Содержание дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в компактной части черной субстанции 70
3.2.2 Концентрация дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в дорсальном стриатуме 72
3.2.3 Соотношение содержания 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и содержанию дофамину в компактной части черной субстанции 73
3.2.4 Соотношение концентрации 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и концентрации дофамину в дорсальном стриатуме 74
3.2.5 Ферментативная активность тирозингидроксилазы в нигростриатной системе после введения МФТП 75
3.2.6 Концентрация глиального нейротрофического фактора в черной субстанции и стриатуме 77
3.3. Функциональная характерисуноктика отдельных дофаминергических нейронов
нигростриатной системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП 78
3.3.1 Внутриклеточное содержание тирозингидроксилазы в телах нейронов в компактной части черной субстанции 78
3.3.2 Содержание тирозингидроксилазы в терминалях дофаминергических аксонах нигростриатной системы в дорсальном стриатуме 78
3.3.3 Активность тирозингидроксилазы в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции и отдельной терминали в дорсальном стриатуме 79
3.3.4 Содержание дофамина в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции после введения МФТП 80
3.3.5 Концентрация дофамина в отдельной терминали аксона в дорсальном стриатуме после введения МФТП
3.4 Влияние ингибитора обратного захвата дофамина – номифензина на нигростриатную систему 82
3.5 Влияние фрагмента адренокортикотропного гормона – Семакс на нигростриатную систему 84
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 87
4.1. Динамика дегенерации и функциональное состояние выживших дофаминергических нейронов нигростриатной системы после введения МФТП 88
4.1.1 Методические предпосылки изучения динамики дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы 88
4.1.2 Динамика дегенерации нигростриатных дофаминергических нейронов под действием МФТП 90
4.2. Модель ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов 99
4.2.1 Доказательство возможности использования модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона в перилж дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов 99
4.2.2 Использование модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для тестирования потенциальных нейропротекторов 101
Заключение 105
Выводы 106
Список сокращений 107
Список литературы 108
- Деградация дофамина
- Инъекции регуляторного пептида Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) 2.2 Взятие материала
- Содержание тирозингидроксилазы в терминалях дофаминергических аксонах нигростриатной системы в дорсальном стриатуме
- Динамика дегенерации нигростриатных дофаминергических нейронов под действием МФТП
Деградация дофамина
Второй фермент синтеза ДА – ДАА относится к семейству аспартатаминотрансфераз. ДАА катализирует декарбоксилирование L-ДОФА в ДА и 5-гидрокситриптофан в серотонин, а также в значительно меньшей степени других ароматических аминокислот, таких как тирозин, триптофан и фенилаланин до соответствующих аминов [Lovenberg et al., 1962]. ДАА представляет собой гомодимер, каждый мономер которого (480 аминокислотных остатков) состоит из трех доменов [Ichinose et al., 1989; Nasrin et al., 1992]. L-домен («large-domain») формирует центральный каркас из -листов окруженный -спиралями, а короткий С-концевой домен и N-концевой домен обеспечивают димеризацию фермента [Sandmeier et al., 1994; Burkhard et al., 2001]. В качестве кофермента выступает пиридоксаль-5 -фосфат (ПФ), предшественник витамина B6 [Ishii et al., 1996; Burkhard et al., 2001]. Пиридоксаль-5 -фосфат проникает в центральную нервную систему в виде пиридоксала, пиридоксина и пиридоксамина. Активный центр фермента находится «в глубине» гомодимера, в котором и происходит связывание с двумя молекулами ПФ (рисунок 5) [Ishii et al., 1996; Burkard et al., 2001]. После образования комплекса ПФ с ДАА образуется комплекс с субстратом с дальнейшим декарбоксилированием последнего.
Большое количество исследований было проведено по определению сродства ДАА к различным субстратам, так для L-ДОФА Km составляет от 120 М до 620М, для 5-гидрокситриптофана от 20 М до 490 М в зависимости от условий реакции и ткани [Lovenberg et al., 1962; Boomsma et al., 1986; Moore et al., 1996; Jebai et al., 1997; Verbeek et al., 2007]. Для других ароматических кислот Km значительно выше [Lovenberg et al., 1962], но их количество в ЦНС находится в следовых количествах. N-домен представлен синим ветом, красным – C-домен и желтым – L-домен. Активный центр фермента представлен розовым цветом, белым цветом обозначен второй мономер в составе димера фермента.
В мозге ДАА локализуется в серотонинергических, ДА-ергических, норадреналин-ергических (НА-ергических) нейронах, а также в популяции неаминергических нейронов – Д-нейронах [Ugrumov, 2013; Jaeger et al., 1984; Kitahama et al., 1990; Eaton et al., 1993; Kitahama et al., 2009]. Д-нейроны были обнаружены в гипоталамусе, стриатуме, переднем мозге и коре головного мозга [Kitahama et al., 2009]. Одной из предполагаемых функций этих нейронов является участие их в кооперативном синтезе моноаминов. Это было показано на примере синтеза ДА в медиобазальном гипоталамусе крыс [Ugrumov et al., 2014]. При этом L-ДОФА, синтезирующийся в ТГ-содержащих нейронах, выделяется в межклеточное пространство, откуда захватывается в нейроны, экспериссирующие ДАА, где происходит синтез ДА.
Как регулируется синтез катехоламинов на уровне ДАА до конца остается не ясным. Большинство работ, направленных на исследование регуляции активности ДАА проведено с использованием различных ингибиторов или агонистов/антагонистов. Например, показано, что антагонисты Д1 и Д2 рецепторов (рецепторы к ДА) в стриатуме увеличивают активность ДАА [Zhu et al., 1992; Hadjiconstantinou et al., 1993], что позволяет предположить ингибирование активности фермента ДАА по механизму обратной связи. Кроме того было показано ингибирование фермента по механизму обратной связи для серотонина [Neff et al., 2006]. Ингибирование ДАА с помощью NSD-1015 приводит «компенсаторному» увеличению экспрессии мРНК ДАА и количества белка [Li et al., 1993]. По предположению авторов это также является проявлением механизма обратной связи, т.е. чем ниже активность фермента, тем сильнее/быстрее идет транскрипция и/или трансляция. В ряде работ был показано влияние кофермента на уровень экспрессии белка. При дефиците витамина B6 у животных была показана сниженная активность ДАА [Rahman et al., 1982; Siow, Dakshinamurti, 1985]. При этом добавление пиридоксаль-5 -фосфата перед измерением активности ДАА не восстанавливало данный показатель до контрольного уровня, что свидетельствует об изменении активности самого фермента. Регуляция на транскрипционном уровне, вероятно, осуществляется за счет наличия двух разных промоторов гена ДАА с дальнейшим альтернативным сплайсингом мРНК, что дает две изоформы фермента ДАА. Данные изоформы предположительно имеют нейрональное и ненейрональное происхождение [Albert et al., 1992].
После синтеза ДА транспортируется из цитоплазмы в специализированные секреторные везикулы, где его концентрация составляет примерно 0,1 М, что в 10-1000 раз выше, чем уровень в цитоплазме [Elsworth, Roth, 1997]. Транспорт ДА в везикулы является АТФ-зависимым процессом при участии везикулярного моноаминового транспортера (ВМАТ) 2-го типа. ВМАТ2 является неспецифическим транспортером большинства биогенных моноаминов, которые могут конкурировать с ДА за связывание с ВМАТ2. Транспорт ДА в везикулы может обратимо ингибироваться резерпином [Elsworth, Roth, 1997]. Необходимо отметить, что ДА может синтезироваться и высвобождаться не только из аксональных окончаний, но также и из дендритов, где нейротрансмиттер может храниться как в классических везикулах, так и в гладком эндоплазматическом ретикулуме [Elsworth, Roth, 1997].
В терминалях аксонов обнаружено три пула везикул ДА: два из них представляют синаптические пулы и один резервный. Первый – «легко выделяемый пул» везикул, находящихся в активной зоне, второй – подвижный синаптический пул, который поддерживает работу первого пула, и третий – большой резервный пул (несколько сотен везикул), который начинает выделяться только при истощении синаптических пулов. Размер синаптических везикул около 50 нм, в то время как секреторных везикул резервного пула свыше 100 нм. Объем легко выделяемого пула составляет 1-2%, 10-20% приходится на подвижный пул и 80-90% на резервный [Yavich, 1996; Kristensen et al., 1994; Rizzoli, Betz, 2004, 2005].
Высвобождение ДА в синаптическую щель происходит под влиянием потенциала действия. При деполяризации мембраны открываются селективные потенциал-зависимые кальциевые каналы и ионы Са2+ входят в клетку. Повешенное содержание ионов Са2+ запускает биохимический каскад реакций, что приводит к слиянию мембраны секреторных везикул с цитоплазматической мембраной ДА-ергического нейрона при участии SNARE-комплекса, и выделению ДА в синаптическую щель [Kelly et al., 1993]. Функционально различают две части SNARE-комплекса, расположенные на цитоплазматической (t-SNARE) и везикулярной (v-SNARE) мембранах. При повышении концентрации Ca2+ в клетке Ca2+-зависимый белок синтаксин меняет конформацию и вместе с белком SNAP-25 образует t-SNARE комплекс. В этот момент везикула подходит к t-SNARE, на мембране которой локализован белок синаптобревин (v-SNARE). Эти три белка, а также белок Munc 13-1 образуют единый комплекс, после чего везикула «подтягивается» к плазматической мембране с дальнейшим слиянием мембран и выбросом нейротрансмиттера в синаптическую щель.
Физиологическое действие ДА в синаптической щели осуществляется через G-белок-ассоциированные рецепторы, которые можно разделить на две группы Д1 (Д1 и Д5) и Д2 (Д2, Д3 и Д4). Рецепторы в этих двух группах различаются по фармакологическим и биохимическим свойствам, а также по распределению в пределах ЦНС [Andersen et al., 1990; Niznik, Van Tol, 1992; Sibley, Monsma, 1992; Civelli et al., 1993; Vallone et al., 2002].
Рецепторы ДА обладают высокой гомологией по составу друг к другу: Д1 и Д5 – 79%, а Д2, Д3 и Д4 – 75% [Civelli, 1993]. Структура рецепторов сходна, они имеют 7 трансмембранных доменов, которые образуют гидрофобную щель с тремя внутри- и тремя внеклеточными петлями [Missale et al., 1998].
Инъекции регуляторного пептида Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) 2.2 Взятие материала
Для ингибирования обратного захвата ДА использовали подкожное введение (RS)-2-метил-4-фенил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-амина (номифензина) (Sigma, США) в дозе 10 мг/кг веса животного за полчаса до каждого введения МФТП. Было использовано четыре группы животных, получавших только 0,9% NaCl и 0,9% NaCl, 0,9% NaCl и номифензин, МФТП и 0,9% NaCl, МФТП и номифензин. Через 12 часов после последней инъекции МФТП осуществляли сбор материала, в котором выявляли ТГ-иммунореактивных терминали в дорсальном стриатуме методом иммуногистохимии, подсчитывали их количество и определяли уровень белка ТГ. Также определяли содержание катехоламинов и их метаболитов в компактной части ЧС и дорсальном стриатуме методом ВЭЖХ-ЭД.
В первом случае Семакс (препарат предоставлен отделом химии физиологически активных веществ, Институт молекулярной генетики РАН) вводили интраназально за 12 часов до первой инъекции МФТП в дозе 50 мкг/кг веса животного. Во втором случае Семакс вводили интраназально через 1 час после последней инъекции МФТП в дозе 50 мкг/кг веса животного. Количество групп в обоих случаях равнялось трем: 0,9% NaCl и 0,9% NaCl, МФТП и 0,9% NaCl, МФТП и Семакс. Сбор материала в данных экспериментах осуществляли через 12 часов после последней инъекции МФТП, затем образцы использовали для определения количества катехоламинов с помощью ВЭЖХ ЭД.
Для морфологического исследования динамики дегенерации ДА-ергических нейронов (тел нейронов в компактной части ЧС и терминалей аксонов в дорсальном стриатуме) брали материал через 1 (только терминали аксонов), 3, 6, 12 и 24 часа после последнего введения МФТП (рисунок 12). Для этого мышей наркотизировали хлоралгидратом (600 мг/кг) (Sigma, США) и интракардиально перфузировали следующими растворами: 12 минут фосфатно-солевым буфером (0,9% NaCl на 0,02 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,2 7,4) (ФСБ), затем 12 минут 4% параформальдегидом на 0,2 М фосфатном буфере (ФБ). После этого мышей декапитировали, извлекали мозг и помещали в 4% параформальдегид на 12 часов при +4о С.
Для морфологического исследования влияния ингибитора обратного захвата – номифензина, мышей декапитировали, извлекали мозг и фиксировали иммерсией 4% параформальдегидом на 0,2 М ФБ в течение 12 часов при +4о С. Далее в обоих случаях мозг мышей промывали в 0,02 М ФСБ, помещали в 20% сахарозу на 0,02 М ФСБ на 48 часов, замораживали в гексане при -40о С и хранили при -70о С до последующего выявления ТГ – маркера ДА-ергических нейронов методом иммуногистохимии.
Для биохимического анализа через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП мышей наркотизировали хлоралгидратом (600 мг/кг), декапитировали, извлекали мозг (рисунок 12). На хладоэлементе под бинокулярной лупой (Leica M60, Германия), снабженной окулярмикрометром, разрезали мозг по среднесагиттальной плоскости. Для выделения дорсального стриатума делали первый фронтальный разрез на 0,3 мм каудальнее передней камиссуры (bregma 0.02) и второй – на 1 мм ростральнее мозолистого тела (bregma 2.10). Из полученного фронтального среза выделяли стриатум согласно атласу [Paxinos, Franklin, 2001]. Из оставшегося блока мозга выделяли ЧС, для этого делали два фронтальных разреза: на уровне каудальной границы мозолистого тела (bregma -2.70) и на 0,8 мм каудальнее первого разреза. Отступив на 0,75 мм от сагиттальной линии получившегося фронтального среза, и на 1,3 мм от нижнего края, также делали разрезы, после чего выделяли ЧС (рисунок 13, 14). Кусочки взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70о С до последующего определения содержания катехоламинов.
С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД) определяли содержание ДА и ДОФУК в дорсальном стриатуме и ЧС. Для этого образцы ЧС и стриатума размораживали, гомогенизировали соответственно в 70 и 150 мкл 0,1 Н HCIО4 с добавлением 3,4-дигидроксибензиламин гидробромида (250 пмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Далее пробы центрифугировали при 17 000 g при +4оС в течение 20 мин и отбирали супернатант для дальнейшего анализа. Определение ДА и ДОФУК осуществляли на обращнно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3,4 х 100 мм с диаметром пор 3 мкм (Элсико, Россия) при скорости подвижной фазы 0,7 мл/мин. В состав подвижной фазы входили: 0,1 M цитратно-фосфатный буфер (pH 3,0), 1,1 мM октансульфоновая кислота, 0,1 мM ЭДТА и 9% ацетонитрил. Для измерения катехоламинов использовали стеклоугольный электрод (+0,85 В) и электрод сравнения Ag/AgCl. Пики ДА и ДОФУК идентифицировали по времени их выхода в растворе стандартов. Содержание ДА и ДОФУК рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце с помощью программного обеспечения «Мультихром» (Ampersand LTD, Россия). Данные представлены в виде изменения содержания ДА и ДОФУК в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%.
Для выявления ТГ-иммунореактивных нейронов методом иммуногистохимии делали серийные фронтальные срезы мозга, содержащие стриатум (от bregma 1,70 до bregma 0,14) и ЧС (от bregma 2,54 до bregma 4,04), на криостате (Leica, Германия). Толщина срезов стриатума составляла 12 мкм, а ЧС – 20 мкм. На стекла монтировали серийные срезы ЧС и стриатума, при этом на каждом стекле присутствовали как срезы контрольной, так и опытной групп.
Cрезы на стеклах последовательно инкубировали: (а) с 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Sigma, США) и 0,3% Тритоном X100 (Triton-X100, Sigma, США) в ФСБ 30 мин при 20оС; (б) с антителами кролика к ТГ (1:2000) (предоставлены профессором Ж. Тибо, Франция), 1% БСА и 0,1% Тритоном X-100 в ФСБ в течение 20 часов при 20оС; (в) с биотинилированными антителами козы к антителам кролика (1:200) (Vector Laboratories, США) в ФСБ в течение 2-х часов при 20оС; и (г) с авидин-биотиновым комплексом, связанным с пероксидазой хрена (Vector Laboratories, США) в ФСБ в течение 1 часа при 20оС. После каждой инкубации, за исключением первой, срезы промывали в ФСБ в течение 30 минут при 20оС.
Пероксидазу авидин-биотинового комплекса выявляли путем инкубации срезов с 0,03% 3,3 -диаминобензидин-тетрогидрохлоридом (Sigma, США) и 0,01% H2O2 в ФСБ при 20оС под визуальным контролем, причем «проявление» срезов от одной пары мозга (контроль и опыт) на всех стеклах осуществляли одновременно. Затем срезы заключали в гидрофильную среду Mowiol 4-88 (Sigma, США).
Срезы ЧС и стриатума после выявления ТГ с помощью пероксидазного моноиммуномечения изучали в просвечивающем световом микроскопе Olympus BX51 (Olympus, Япония), оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Olympus, Япония), при увеличении объектива х10 и х100, соответственно. Изображения анализировали с помощью программы AnalySIS 5.0 (Olympus, Япония). Серийные срезы ЧС (примерно 70 срезов с мозга) были сфотографированы, после чего на каждом изображении была обведена область компактной части ЧС, содержащая ДА-ергические нейроны, в соответствии с атласом головного мозга мышей [Paxinos, Franklin, 2001] и схемами по статье Нельсон с соавторами [Nelson et al., 1996]. Далее в обведенной области подсчитывалось количество нейронов с видимым ядром. Для исключения двойного подсчета нейронов, расположенных на соседних срезах использовали метод Аберкромби [Abercrombie, 1946]: N = n , где N – общее число клеток в слое, n – число подсчитанных клеток в слое, – толщина среза (20 мкм), d – средний диаметр ядра для клетки.
Для количественного анализа терминалей аксонов в дорсальном стриатуме делали фотографии четырех условно выделенных областей дорсального стриатума (зона 1, 2, 3 и 4), как показано на рисунке 15. В данные зоны, согласно Герфен с соавторами, в основном проецируются ДА-ергические аксоны от нейронов в компактной части ЧС [Gerfen, 1985].
Количество терминалей аксонов подсчитывали в центре каждой из четырех условно выбранных зон площадью 200х200 мкм2 с помощью программы Striatum Image Analysis» (Россия), разработанной нами совместно с Вычислительным Центром им. А.А. Дородницына РАН [Gurevich et al., 2010]. Окончательные результаты представлены в виде изменения количества тел и терминалей аксонов ТГ-иммунореактивных (ДА-ергических) нейронов в опыте относительно контроля, принятого за 100%. ВТО – вентральная тегментальная область, ЧСк – компактная часть черной субстанции, ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции, ЧСл – латеральная часть черной субстанции. Схемы среднего мозга основаны на данных стереотаксического атласа [Paxinos, Franklin, 2001] и рекомендаций Нельсона с соавторами [Nelson et al., 1996]. Рисунок 15 – Схемы локализации тел ДА-ергических нейронов в среднем мозге, использованные для подсчета нейронов в компактной части черной субстанции (А) и терминалей аксонов в области дорсального стриатума (мелкий пунктир), использованные для их подсчета (Б)
Содержание тирозингидроксилазы в терминалях дофаминергических аксонах нигростриатной системы в дорсальном стриатуме
Содержание ДОФУК, одного из основных продуктов деградации ДА, в компактной части ЧС в контрольных группах в среднем составляло 2 пмоль (1,5 ± 0,3; 2,8 ± 0,4; 2,8 ± 0,4; 1,8 ± 0,2; 1,9±0,2 пмоль), без достоверных различий между контролями.
В первые 12 часов после последней инъекции МФТП было обнаружено снижение содержания ДОФУК в ЧС по сравнению с контрольными группами (рисунок 23). Так, через 1 час после последней инъекции МФТП содержание ДОФУК составляло 0,8 ± 0,1 пмоль, в то время как в соответствующем контроле 1,5 ± 0,3 пмоль. Через 3 часа содержание ДОФУК было на уровне 1,1 ± 0,4 пмоль, а через 6 часов – 0,6 ± 0,1 пмоль, в контролях – 2,8 ± 0,4 пмоль. Через 12 часов содержание ДОФУК также было ниже контроля (1,8 ± 0,2 пмоль) и составляло 1,1 ± 0,3 пмоль, а через 24 часа статистически достоверной разницы не было обнаружено между контролем (1,9 ± 0,2 пмоль) и опытом (1,5 ± 0,7 пмоль).
Через 1 и 6 часов после последней инъекции МФТП происходило снижение содержания ДОФУК в ЧС в два раза, между 3 и 6 часов была обнаружена тенденция к снижению содержания ДОФУК, хотя не было достоверных различий. Было обнаружено увеличение в 4 раза содержания ДОФУК к 24 часам после последнего введения МФТП при сравнении с данным показателем через 6 часов. ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота, ЧС – черная субстанция. р 0,05 по сравнению с контролем; р 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 23 – Содержание 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в компактной части черной субстанции через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.2.2 Концентрация дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в дорсальном стриатуме
Концентрация ДА в дорсальном стриатуме составляла в среднем 16,2 мкг/г веса ткани в контрольных группах, а именно 14,8 ± 0,5, 19,5 ± 0,3, 14,2 ± 1,4, 18,1 ± 2,2 и 14,5 ± 1,0 мкг/г. После введения МФТП уровень ДА резко падал, через 1 час после последней инъекции МФТП концентрация ДА была снижена почти в 9 раз по сравнению с контролем (14,8 ± 0,5 мкг/г в контрольной группе и 1,9 ± 0,2 в опытной группе). В дальнейшем, через 3, 6, 12 и 24 часа после введения МФТП, концентрация ДА не изменялась при сравнении с концентрацией ДА через 1 час, составляя 2,2 ± 0,3, 1,5 ± 0,1, 2,5 ± 0,3 и 1,9 ± 0,1 мкг/г соответственно (рисунок 24).
Время после введения МФТП, ч р 0,05 по сравнению с контролем. Рисунок 24 – Концентрация дофамина в дорсальном стриатуме через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% Концентрация ДОФУК в дорсальном стриатуме в норме примерно в 10 раз меньше, чем ДА, и составляла в среднем 1440 нг/г веса ткани (1130 ± 84, 1881 ± 86, 1534 ± 290, 1470 ± 209 и 1295 ± 124 нг/г) (рисунок 25).
Концентрация ДОФУК через 1 час была снижена до 171 ± 43 нг/г, в то время как в соответствующем контроле было 1130 ± 84 нг/г, что составляет 15%. Через 3, 6, 12 и 24 часа концентрация ДОФУК также была ниже контрольного уровня примерно на 80%: в контроле через 3 часа -1881 ± 86, 6 часов - 1534 ± 290, 12 часов - 1470 ± 209 и 24 часа 73 1295 ± 124 нг/г), в то время как в опытных группах 3 часа – 147 ± 30, 6 часов – 206 ± 34, 12 часов – 379 ± 73 и 24 часа – 340 ± 32 нг/г соответственно.
При сравнении концентрации ДОФУК между сроками было обнаружено, что через 3 часа сохранялась тенденция к снижению концентрации метаболита по сравнению с данными, полученными через 1 час. В последующие временные сроки, через 6, 12 и 24 часа, наблюдалась тенденция к увеличению уровня ДОФУК соответственно до 14%, 19% и 26%. Однако статистически достоверные различия были отмечены только между сроками 3 часа и 24 часа после последней инъекции МФТП (рисунок 25). ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота. р 0,05 по сравнению с контролем; р 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 25 – Концентрация 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в дорсальном стриатуме через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100%
Соотношение содержания продукта деградации и содержанию нейромедиатора является интегративным показателем «оборота» (turnover) нейромедиатора, который складывается из синтеза, выделения, обратного захвата и деградации медиатора. Соотношение ДОФУК/ДА в ЧС через 1 и 3 часа после последнего введения МФТП было увеличено примерно в 2 раза относительно уровня в контролях, принятых за 100%. Через 6 и 12 часов было обнаружено снижение уровня ДОФУК/ДА в 3 и почти в 2 раза, соответственно. Через 24 часа после последней инъекции МФТП соотношение ДОФУК/ДА было на уровне в контроле (рисунок 26).
Между сроками изменения были обнаружены только между 3 и 6 часами, когда происходило статистически достоверное снижение соотношения ДОФУК/ДА от 199% до 30%, а также между 12 и 24 часами при увеличении от 64% (12 часов) до 119% (24 часа). Время после введения МФТП, ч ДА – дофамин, ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота, ЧС – черная субстанция. р 0,05 по сравнению с контролем; р 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 26 – Соотношение содержания 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и содержания дофамина (ДОФУК/ДА) в компактной части черной субстанции через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9%
Динамика дегенерации нигростриатных дофаминергических нейронов под действием МФТП
Согласно полученным нами результатам количество ДА-ергических нейронов ЧС начинало снижаться только через 3 часа после четырехкратного введения МФТП. Данное снижение продолжалось всего 3 часа, после чего их количество не менялось. Так, через 24 часа их количество составляло 57%, что соответствовало количеству нейронов через 2 недели после введения МФТП [Ugrumov et al, 2011]. Учитывая эти данные, увеличение продолжительности периода оценки количества ДА-ергических нейронов в ЧС было признано нами не целесообразным.
Несмотря на то, что дегенерация тел ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при БП является основным элементом патогенеза заболевания, существуют лишь единичные работы по исследованию динамики их дегенерации после введения МФТП [Jackson-Lewis et al., 1995; Aoki et al., 2009]. При этом анализ этих работ создает достаточно противоречивую картину. В двух работах была использованы мыши линии C57BL/6 такого же возраста и веса, что и в нашем исследовании, однако, доза МФТП была больше, составляя 20 мг/кг при аналогичном четырехкратном введении с интвервалом два часа. Тела ДА-ергических нейронов в ЧС выявлялись с помощью иммуногистохимии на ТГ. В работе Джексон-Левис с соавторами [Jackson-Lewis et al., 1995] дегенерация ДА-ергических нейронов (тел нейронов) начиналась позднее – через 12 часов после последней инъекции МФТП, и продолжалась дольше – в течение 36 часов. В работе Аоки с соавторами [Aoki et al., 2009] также была проведена оценка динамики дегенерации ДА-ергических нейронов в ЧС, согласно полученным данным количество ДА-ергических нейронов было снижено на 35% через 5 часов. Это согласуется с нашими данными, где количество нейронов снижалось к 6 часам. Однако в этой работе снижение длилось вплоть до 24 часов, достигая при этом 44% от уровня в контроле, в то время как по нашим данным их количество не меняется после 6 часов. Единственным объяснением расхождения данных полученных в этих работах, несмотря на одинаковые схемы введения МФТП, а также с результатами нашей работы, могут быть разные методические подходы количественной оценки ДА-ергических нейронов (ТГ-иммунореактивные) в ЧС. Если в нашей работе был проведен подсчет количества тел ДА-ергичекских нейронов на серийный срезах, что позволило учесть зональность распределения нейронов в ЧС, то в работе Джексон-Левис для подсчета количества тел нейронов были использованы только выборочные срезы от 3-х до 5, а в работе Аоки не представлено методических указаний об уровне использованных срезов.
Помимо количественного анализа ДА-ергических нейронов в ЧС мы также оценивали ростро-каудальный градиент при нейродегенерации. Было показано, что основная потеря ДА-ергических нейронов после введения МФТП происходит в медиальной части ЧС. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными при разработке данной модели [Хаиндрава и др., 2010]. При увеличении дозы происходит снижение количества нейронов по всей протяженности ЧС примерно до 20 нейронов на срез [German et al., 1996]. Однако, учитывая то, что в контроле в медиальной части нейронов больше, чем в каудальной и ростральной частях ЧС, при введении МФТП наибольшее снижение количества нейронов происходит именно в этой области структуры.
Деградация нигростриатной системы при БП в значительной степени выражена в медиальной и каудальной частях компактной части ЧС [Damier et al., 1999; German et al., 1992]. ЧС у приматов принято делить на субпопуляции ДА-ергических нейронов: матрикс, образованный нейронами, содержащими Са2+-связывающий белок кальбиндин, и 5 нигросом, в которых локализованы нейроны, не содержащих этот белок. Анализ чувствительности этих субпопуляций к нейротоксическим факторам показал, что нейроны, локализованные в матриксе, менее подвержены деградации по мере развитии заболевания (на терминальной стадии погибает 80%), чем нейроны нигросом. Для нейронов нигросом существует зависимость степени деградации от их расположения: так в каудальной части ЧС гибель нейронов достигает 100%, а ближе к ростральной части – до 70-80% [Lavoie, Parent, 1991; German et al., 1992; Damier et al., 1999].
У грызунов ЧС имеет несколько иную морфологическую организацию, чем у приматов, а именно нейроны, содержащие Са2+-связывающие белки кальбиндин и кларнитин, образуют дорсальный тяж, тянущийся от ростральной до каудальной части ЧС. В то же время вентральная и медиальная части ЧС представлены ДА-ергическими нейронами, которые не содержат данные белки [Liang et al., 1992a; McRitchie et al., 1996; Nemoto et al., 1999; et al., 2000]. После введения мышам линии С57BL/6 суммарной дозы 80 мг/кг МФТП наблюдается гибель ДА-ергических нейронов в ЧС, которые не содержат Са2+-связывающие белки, тогда как остальные нейроны ЧС и нейроны ВТО не подвергаются дегенерации [Muthane et al., 1994]. Увеличение дозы МФТП до 140 мг/кг приводит к гибели ДА-ергических нейронов обеих популяций в ЧС, а также нейронов в ВТО [Liang et al., 1996b]. Таким образом, Са2+-связывающие белки являются нейропротекторами для ДА-ергических нейронов ЧС за счет поддержания внутриклеточного уровня Са2+ и сдерживая образование АФК [Hirsch, 1992; Yamada et al., 1990; German et al., 1992; Liang et al., 1996b].
Представляется интересным факт, что после введения МФТП уровень кальбиндина в ДА-ергических нейронах ВТО повышается через 3 часа после введения нейротоксина [Ng et al., 1996]. Аналогичных данных по оценке уровня кальбиндина в ЧС в ответ на введения МФТП обнаружить не удалось. Однако учитывая то, что при увеличении дозы МФТП происходит гибель ДА-ергических нейронов в ЧС и ВТО обеих популяций (содержащих и не содержащих Са2+-связывающие белки), то вероятно, их наличие не является единственным фактором, отвечающим за протекцию нейронов.
Одной из гипотез, объясняющей разную чувствительность к действию токсинов ДА-ергических нейронов разных систем (ЧС, ВТО и тубероинфудибулярная система – ТИДАС), является предположение о зависимости гибели нейронов от количества ДАТ на мембране, через который МФП+ проникает в нейрон [Sanghera et al., 1994]. С одной стороны, действительно, ДАТ на ДА-ергических нейронах ТИДАС практически отсутствуют из-за того, что волокна этих нейронов выбрасывают ДА в портальную систему циркуляции крови, и регуляция функционального состояния нейронов через механизм обратной связи у них не развита [Demarest, Moore, 1979; Annunziato et al., 1980; Revay et al., 1996]. Однако оказалось, что уровень МФП+ в этих нейронах превышает таковой в стриатуме в 4 раза через 5 часов после введения МФТП (20 мг/кг) и МФП+ захватывается в эти нейроны с помощью транспортера органических катионов 3 типа [Cui et al., 2009; Gasser et al., 2009; Benskey et al., 2012]. Эти данные свидетельствуют о том, что количество ДАТ на мембране не является определяющим фактором гибели ДА-ергического нейрона, а, вероятно, связано с молекулярными механизмами протекции в нейроне от действия токсина. Действительно, авторы этого исследования показали, что в нейронах ТИДАС происходит увеличение уровня паркина, который является Е3 лигазой, после введения МФТП, в то время как, в нейронах ЧС обнаружено снижение содержания данного белка [Benskey et al., 2012]. Подводя итог, можно заключить, что ДА-ергические нейроны различных систем реагируют на действие токсина по-разному из-за разного функционального состояния и разных механизмов защиты нейронов. Дальнейшее исследование и сравнение реакции на действие токсина ДА-ергических нейронов этих систем позволит найти клеточные механизмы, которые приводят к более высокой чувствительности нигростриатной системы, а также новые мишени для фармакотерапии. Как уже упоминалось, в основе патогенеза БП лежит деградация не только тел ДА-ергических нейронов в ЧС, но и их аксонов в стриатуме. Более того, считается, что дегенерация нигростриатных ДА-ергических нейронов при БП начинается именно с деградации терминалей аксонов в стриатуме [German et al., 1996]. Это можно объяснить более высоким содержанием ДАТ на мембранах аксонов, чем на телах нейронов, что приводит к большему захвату МФП+ в нейроны на уровне аксонов и, следовательно, к более выраженному токсическому эффекту.
Нами было показано, что через 3 часа после последней инъекции МФТП, число терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме, в отличие от тел нейронов, чье число не изменялось, было значительной степени снижено – примерно на 34% по сравнению с контролем. Это подтверждает более высокую чувствительность к МФТП аксонов по сравнению с телами нейронов. Деградация терминалей аксонов, как и тел нейронов, продолжается в последующие 3 часа, однако, с меньшей скоростью. Так, в это время число тел нейронов в ЧС уменьшилось на 35%, а терминалей аксонов в стриатуме – на 10%.
Если предположить, что скорость деградации терминалей аксонов сохраняется на постоянном уровне, то этот процесс должен начинаться сразу же после первой инъекции МФТП (рисунок 37). Это предположение хорошо согласуется с данными, полученными в нашей лаборатории ранее, согласно которым количество терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме снижается на 20% уже после однократного введения МФТП в дозе 12 мг/кг [Ugrumov et al., 2011]. Через 6 часов после последней инъекции МФТП число терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме не изменялось, как и тела нейронов в ЧС в последующие изученные сроки – через 12 часов и 24 часа после последнего введения МФТП.