Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Бронхиальная астма 7
2.1.1. Клеточный ответ при астме 8
2.1.2. Гуморальный иммунный ответ при астме 17
2.2. Белки теплового шока 24
2.2.1. Семейства белков теплового шока 25
2.2.2. Семейство БТШ70 27
2.2.3. БТШ70 и иммунитет 34
2.2.4. БТШ70 в аллергии и астме 34
2.2.5. БТШ70 при воспалении дыхательных путей 35
2.2.6. БТШ70 в регуляции активности нейтрофилов 2.3. Активные формы кислорода 36
2.4. NADPH-оксидаза 2.4.1. Свойства и функции компонентов NADPH-оксидазы 39
2.4.2. Ингибиторы NADPH-оксидазы 42
2.4.3. NADPH-оксидаза и цитоскелет 42
2.4.4. Взаимодействие БТШ70 и NADPH-оксидазы 43
3. Материалы и методы 43
3.1. Буферные растворы 43
3.2. Животные и клеточные модели
3.2.1. Животные 44
3.2.2. Индукция воспаления дыхательных путей с помощью овальбумина... 44
3.2.3. Определение общего количества и популяционного состава клеток бронхоальвеолярного лаважа (бронхоальвеолярного смыва) 45
3.2.4. Определение уровня цитокинов в бронхоальвеолярных лаважах 46
3.2.5. Определение уровня иммуноглобулинов 47
3.2.6. Выделение клеток и приготовление клеточных суспензий 47
3.2.7. Регистрация уровня внеклеточной РНК 48
3.2.8. Регистрация активных форм кислорода 49
3.2.9. Индукция «окислительного взрыва» 50
3.2.10.Ингибиторы продукции АФК 50
3.3. Выделение белка БТШ70 из внутренних органов мышей 50
3.3.1. Получение гомогенатов печени и почек мышей 51
3.3.2. Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии на АТФ-агарозе 51
3.3.3. Диализ в бикарбонатном буфере 52
3.3.4. Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии наМ-агарозе 52
3.3.5. Очистка БТШ70 от контаминации бактериальных липополисахаридов 52
3.3.6. Определение концентрации белка 53
3.3.7. Электрофорез вПААГ 53
3.3.8. Вестерн-блот анализ 53
3.3.9. Определение содержания примеси LPS 54
3.4. Статистическая обработка результатов 54
4. Результаты исследований 55
4.1. Особенности получения и очистки белка БТШ70 55
4.2. Характеристика острой и эффекторной фазы аллергического воспаления дыхательных путей 56
4.3. Общее количество и популяционный состав клеток бронхоальвеолярных лаважей 57
4.4. Изменение уровня цитокинов в дыхательных путях 58
4.5. Продукция аллерген-специфических антител 59 4.6. Снижение уровня секреции проаллергических цитокинов под действием БТШ70 62
4.7. Влияние БТШ70 на системную и локальную продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов 63
4.8. Подавление роста общего количества и изменение популяционного состава клеток БАЛ мышей с аллергическим воспалением дыхательных путей после введения БТШ70 64
4.9. Оценка влияния БТШ70 на количество нейтрофилов в костном мозге мышей с индуцированным аллергическим воспалением 66
4.10. Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре активированных нейтрофилов 67
4.11. Оптимизация клеточной модели для исследования антиоксидантной активности БТШ70 69
4.12. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на продукцию АФК in vitro. 11
4.13. Изменение продукции активных форм кислорода клетками костного мозга мышей на различных стадиях аллергического воспаления дыхательных путей.
5. Обсуждение полученных результатов 96
6. Выводы 102
7. Список используемых сокращений 103
8. Список литературы
- Семейства белков теплового шока
- Определение общего количества и популяционного состава клеток бронхоальвеолярного лаважа (бронхоальвеолярного смыва)
- Характеристика острой и эффекторной фазы аллергического воспаления дыхательных путей
- Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре активированных нейтрофилов
Семейства белков теплового шока
Бронхиальная астма - хроническое прогрессирующее воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризующееся бронхиальной обструкцией и гиперреактивностью бронхов. Факторы, способные спровоцировать развитие данного заболевания, разнообразны (Holtzman, 2012).
Основными клиническими проявлениями аллергической астмы являются бронхоспазмы, затрудненное дыхание и одышка, обусловленные инфильтрацией в дыхательные пути тучных клеток и эозинофилов, вызывающих гиперчувствительность, воспаление и обструкцию дыхательных путей.
Генетические исследования свидетельствуют о том, что астма не является единым заболеванием, а представлена множеством нарушений как на генетическом, так и на эпигенетическом уровне (Binia, Kabesch, 2012; Yang, Schwartz, 2012). Фенотипическое разнообразие проявлений астмы обусловлено не только генетическими факторами, но и факторами окружающей среды, в частности изменением образа жизни и климатическими условиями (Custovic, Simpson, 2012; Dapul-Hidalgo, Bielory, 2012; Renz et al, 2011). Около 300 миллионов людей на планете страдают от астмы и около 250 тысяч смертей в год связано с астматическим воспалением (Baiz, Annesi-Maesano, 2012). Основными признаками аллергической астмы являются ассоциированное с Th2-лимфоцитами воспаление, эозинофилия, обструкция дыхательных путей, вызванная гиперплазией бокаловидных клеток и бронхиальная гиперчувствительность к неспецифическим стимулам (Idzko et al., 2007). Чаще всего к развитию аллергической астмы приводит IgE-опосредованная сенсибилизация к «домашним» аллергенам, распространяющимся воздушным путем. Чем дольше пациент подвергается воздействию аллергена, тем сильнее становится проявление астматических симптомов. Кроме того, аллергическое воспаление дыхательных путей усиливается респираторными вирусами и вдыхаемыми патогенами грибной или бактериальной природы (Custovic, Simpson, 2012; Fukushima et al, 2010).
Основными аллергенами, приводящими к развитию аллергической бронхиальной астмы, являются клещи домашней пыли (Gaffin, Phipatanakul, 2009), аллергены животного происхождения (Bjerg et al, 2015), споры грибов (Knutsen et al., 2012) и пыльца растений (D Amato et al, 2007).
Помимо классической аллергической бронхиальной астмы, где бронхоспазмы опосредуются в основном гистамином и активацией системы комплемента, существует также аспириновая астма, сопряженная с непереносимостью аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), ингибиторов циклоксигеназы (Szczeklik, Nizankowska, 2000). В диагностике аспириновой астмы выделяют триаду симптомов, состоящую из непереносимости аспирина, бронхиальной астмы и полипозного синусита (Samter, Beers, 1968). Основным механизмом развития аспириновой астмы является дисбаланс метаболизма арахидоновой кислоты. При этом введение ингибиторов циклоксигеназы приводит к повышенному образованию лейкотриенов (Antczak et al., 2002). Цистеиновые лейкотриены в свою очередь способны приводить к бронхостазмам и обструкции дыхательных путей (Liu, Yokomizo, 2015).
Различные типы клеток вовлечены в патогенез аллергической астмы. Помимо структурных клеток легочного эпителия, клеток мышечной и нервной ткани, перманентно ассоциированных с респираторным трактом, множество клеток иммунной системы приходят в дыхательные пути в процессе воспаления (Lambrecht, 2003). Типичным для аллергического воспаления дыхательных путей является участие эозинофилов, тучных клеток, Т-лимфоцитов и дендритных клеток (Idzko et al, 2007).
Выстилающие респираторный тракт клетки представляют собой гетерогенную популяцию клеток, соединенных между собой различными типами белковых молекул и образующие систему защиты дыхательных путей (Godfrey et al, 1994; Schleimer et al., 2007). Основными защитными функциями эпителиального барьера являются мукоцилиарный клиренс и механическая защита дыхательных путей. Кроме того, огромное значение имеет сигнальная функция структурных эпителиальных клеток, отвечающая за активацию иммунного ответа (Hammad et al., 2009). В состав эпителиального барьера входят реснитчатые, бокаловидные, вставочные, эндокринные клетки и клетки Клара; кроме того, хорошо описаны ассоциированные с эпителием интерстициальные дендритные клетки (Lambrecht, 2005; Reynolds, Malkinson, 2010; Schleimer et al., 2007). Известно, что такие цитокины как IL-25, IL-33 и TSLP, выделяемые эпителиальными клетками, принимают непосредственное участие в развитии иммунного ответа второго типа, опосредуемого Th-2 (Lloyd, Saglani, 2015).
Исторически астму ассоциируют с наличием эозинофилов в бронхоальвеолярных лаважах (Calhoun et al., 1991). Повышенный уровень белков, специфичных для гранул эозинофилов был обнаружен в бронхоальвеолярных смывах пациентов астматиков, причем концентрация этих белков была достаточной для того, чтобы вызвать повреждение тканей организма, в том числе клеток респираторного эпителия (Rothenberg, Hogan, 2006). Считают, что массовый приток эозинофилов в легкие вызван активностью Th2, продуцирующих IL-5, который и служит аттрактантом для эозинофилов. Однако, не всегда активация Th2 вызывает аккумуляцию эозинофилов, в некоторых случаях происходит усиление продукции IL-4 и/или IL-13, которое приводит к дифференцировке альтернативно-активированных макрофагов (Holtzman, 2012). Под воздействием различных стимулов эозинофилы способны продуцировать широкий спектр цитокинов, в том числе и Th2 цитокины (Rothenberg, Hogan, 2006). Основным патологическим эффектом эозинофилов является дегрануляция в результате кросс-связывания IgE с FcsRI рецепторами на поверхности эозинофилов (Turner, Kinet, 1999). В результате дегрануляции в окружающей среде оказываются высокотоксичные вещества, например, такие как МВР, которые оказывают прямое воздействие на тучные клетки и базофилы, заставляя их в свою очередь дегранулировать (Rothenberg, Hogan, 2006).
Определение общего количества и популяционного состава клеток бронхоальвеолярного лаважа (бронхоальвеолярного смыва)
В острой фазе аллергического воспаления дыхательных путей, как и при любом другом воспалении, наблюдается секреция IL-8, как полагают, клетками эпителия или альвеолярными макрофагами, что влечет за собой кратковременный приток нейтрофилов (Bhakta, Woodruff, 2011; Lommatzsch et al., 2006; Lutfi et al., 2012). Однако, при регулярно повторяющемся воздействии аллергена на респираторный тракт, наблюдается снижение уровня рекрутированных нейтрофилов и развитие Тп2-опосредованного ответа (Bafadhel et al., 2011; Holtzman, 2012). Переключение на ТЬ2-опосредованный ответ зависит от многих факторов, в том числе от транскрипционного фактора NF-HEV - цитокина IL-33, рецепторы к которому экспрессированы на активированных Т-лимфоцитах (Lefrancais, Cayrol, 2013; Liew, 2012; Lloyd, 2010). Дифференцировка С04+-клеток в Th2-эффекторы сопровождается регулируемой на транскрипционном уровне экспрессией IL-4, IL-5, IL-13 и подавлением экспрессии цитокинов, ассоциированных с ТЫ-опосредованным ответом (Renz et al., 2011). IL-4 и IL-13 активируют эндотелий и способствуют повышенной экспрессии VCAM-1, который задерживает циркулирующие эозинофилы (Nakagome, Nagata, 2011). IL-5 стимулирует приток эозинофилов в просвет дыхательных путей и дегрануляцию (Holtzman, 2012). Помимо вышеперечисленных, к ТЬ2-опосредованным цитокинам относятся IL-9, IL-25, IL-31, и IL-33 (Akdis et al, 2011).
Основными продуцентами IL-9 являются Th2. В гораздо меньшей степени продукция IL-9 была описана для тучных клеток и эозинофилов, причем секреция этого цитокина клетками астматиков была выше, чем в контрольной группе (Liu J. et al., 2014). IL-9 ингибирует продукцию цитокинов ТЫ (Blankenhaus et al, 2014; Renz et al., 2011), а также способствует продукции IgE В-клетками, вызывает секрецию хемокинов и слизи клетками бронхиального эпителия. Кроме того, было показано, что IL-9 важен для пролиферации тучных клеток (Ни et al., 2007).
IL-25 также считают про-аллергическим цитокином. Показано, что именно IL-25 ответственен за увеличение числа эозинофилов и CD4+ Т-клеток в легких после стимуляции аллергеном, к которому была вызвана сенсибилизация (Byers, 2014).
IL-31 экспрессируют активированные CD4+ Т-клетки, преимущественно Th2. В небольшом количестве экспрессия IL-31 была замечена для CD8+ Т-клеток. Исследования при помощи мышиной модели аллергического воспаления дыхательных путей показали увеличение экпрессии IL-31 mRNA в легких после провокации антигеном (Baumann et al., 2012). Вместе с открытием множества субпопуляций Т-клеток, присутствующих в здоровом организме в минорных количествах, но прогрессирующих и оказывающих разнообразные эффекты при воспалительных процессах, появилось и множество новых цитокинов тем или иным образом ассоциированных с астмой. Так TGFp, IL-ip, IL-23 и IL-6 ассоциированы с развитием ТЫ 7, которые выявлены в при острой и хронической астме и в свою очередь продуцируют IL-17A (Korn et al, 2009); IL-22 продуцируют Th22 в острой фазе и при осложненной тяжелой астме (Souwer et al, 2010). Кроме того, было продемонстрирована роль IL-9/IL-9R в острой фазе овальбумин-индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей, сопровождающегося IgE-опосредованной анафилаксией (Osterfeld et al., 2010). С активацией Т-регуляторных клеток, пролиферация которых необходима для подавления аллергического воспаления, ассоциируют экспрессию IL-35 (Collison etal.,2007).
В последнее время, особый интерес вызывает влияние так называемых цитокинов врожденной иммунной системы на развитие аллергического воспаления дыхательных путей. IL-la и IL-ip - представители семейства IL-1 цитокинов, в которое также входят IL-18, IL-33 и некоторые другие цитокины. С использованием OVA-индуцированной модели аллергического воспаления дыхательных путей было показано, что введение рекомбинантного IL-la на стадии сенсибилизации приводит к ослаблению основных симптомов астмы. В модели слабо выраженного аллергического воспаления дыхательных путей, вызываемого без использования адъюванта, IL1R1"A нокаутные мыши не проявляли признаков астмы в отличие от контрольных животных. Кроме того, было показано, что аутокринный выброс IL-la клетками эпителия бронхов в ответ на ингаляцию экстракта клеща домашней пыли сопровождался продукцией TSLP, GM-CSF и IL-33 и был необходим для стимуляции Th2. Более того, именно IL-la, но не IL-ip, был необходим для активации Th2 иммунного ответа (Schuijs et зі., 2013). 2.1.2.5. Хемокины
Хемокины и хемокиновые рецепторы регулируют передвижение лейкоцитов к месту воспаления. При аллергическом воспалении дыхательных путей наиболее охарактеризованы следующие хемокины: эотаксины 1,2 (CCL11, 24), RANTES (CCL5), хемотактические моноцитарные белки (МСР-1 - CCL2, МСР-2 - CCL8, МСР-3 - CCL13 и др.) хемокины моноцитарных предшественников (MDC - CCL22) и тимические и регулирующие активацию хемокины (TARC -CCL17) (Lloyd, Brown, 2006).
К хемокинам также относят IL-8 (CXCL8), роль которого в астме описана в предыдущем разделе (Bhakta, Woodruff, 2011; Lommatzsch et al, 2006; Lutfietal.,2012).
Эотаксины, RANTES и относящиеся к MCP хемокины вызывают приток эозинофилов, нейтрофилов, в некоторых случаях макрофагов и дендритных клеток. MDC и TARC отвечают за специфическое привлечение Th2 (Ansel et al., 1999; Dustin, 2002; Lloyd, Brown, 2006).
Помимо IL-8, IL-16 также относят к интерлейкинам со свойствами хемокинов, то есть, обладающим хемотактической активностью. IL-16 был открыт как специфический аттрактант для Т-лимфоцитов (Center, Cruikshank, 1982). Было показано, что он воздействует на клетки, экспрессирующие CD4, непосредственно взаимодействуя с этим рецептором. IL-16 ингибирует пролиферацию Т-клеток, способствует развитию ТЫ-опосредованного ответа, и блокирует Т1і2-опосредованное воспаление путем активации продукции TNF-a, IL-ip, и IL-15 и, соответственно, блокируя синтез IL-4 и IL-5 (Akdis et al., 2011).
Также к хемокиновым цитокинам относят IL-17. IL-17 оказывает хемотактическое воздействие на нейтрофилы, однако, до сих пор не выяснено, является ли это воздействие непосредственным или же IL-17 стимулирует продукцию других хемокинов, которые в свою очередь отвечают за приток гранулоцитов (Akdis et а!., 2011).
Компоненты комплемента анафилатоксины СЗа и С5а являются провоспалительными факторами, отвечающими, как и хемокины, за привлечение клеток в очаг воспаления (Gressner et al., 2007). Также СЗа и С5а принимают участие в развитии аллергического воспаления при астме, в частности ответственны за образование отека и обуславливают бронхоспазмы. Механизм действия компонентов комплемента долгое время оставался не изучен. Как оказалось впоследствии, к развитию ТЬ2-опосредованной сенсибилизации и воспаления приводит связывание рецептора к С5а (C5aR) на ранних стадиях, однако если блокировать C5aR на эффекторной стадии аллергического воспаления или при устоявшемся заболевании астмой, то проявляется ярко-выраженный супрессорный эффект (Kohl et al, 2006; Lambrecht, 2006).
Характеристика острой и эффекторной фазы аллергического воспаления дыхательных путей
Клетки костного мозга мыши выделяли путем их вымывания из бедренных и болыпеберцовых костей охлажденным фосфатным буфером (PBS). После гомогенизации полученного материала пипетированием примесь эритроцитов удаляли путем гемолиза с помощью гемолизирующего буфера (0.83% NH4C1; 0.004% EDTA; 0.084% NaHC03) с последующими отмывками фосфатным буфером. Нейтрофилы из суспензии клеток костного мозга мыши выделяли методом отрицательной магнитной селекции с использованием коммерческого набора Neutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Германия) на магнитных колонках LS Coloumns + MidiMACS Separator (Miltenyi Biotec, Германия) согласно рекомендациям производителя. Чистоту популяции выделенных клеток оценивали с помощью детекции специфических маркеров нейтрофилов мыши Ly-6G (Gr-1) и CDllb (антитела Ly6G-FITC и CDllb-PE, eBioscience, США) методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Ряд экспериментов проводили с использованием клеточных образцов из части популяции клеток КМ, оставшейся после выделения нейтрофилов и содержащей фагоцитирующие клетки других типов, в частности моноцитарного ряда.
Для выделения человеческих нейтрофилов периферическую кровь здоровых доноров собирали закрытым способом в стерильные гепаринсодержащие пробирки (Vacutube, Италия). Фракцию полиморфоядерных лейкоцитов, содержащую преимущественно нейтрофилы, выделяли из цельной крови (не позднее 2 ч после забора крови) с помощью коммерческого разделяющего раствора Polymorohprep (AXIS-SHIELD, Норвегия), следуя рекомендациям производителя. После выделения клетки отмывали от разделяющей среды двукратным центрифугированием в растворе Хэнкса (ПанЭко, Россия). Чистоту популяции выделенных клеток оценивали с помощью детекции специфических маркеров нейтрофилов человека CD66b (антитела CD66b-FITC, BioLegend, США) методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Определение внеклеточной концентрации нуклеотидов проводили на планшетном флуориметре GLOMAX Multudetection System (Promega, США) при помощи флуоресцентного нуклеотид-связывающего красителя Sytox-Green (Life Technologies, США). Для определения эффекта БТШ70 данный белок добавляли к образцам в концентрации 10 дг/мл. В контрольные образцы добавляли референтный белок БСА, схожий с БТШ70 по физико-химическим характеристикам, в той же дозе.
Измерение общего и внеклеточного уровня АФК проводили соответственно методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции (Lundqvist, Dahlgren, 1996) с использованием планшетного люминометра GLOMAX Multudetection System (Promega, США). Перед измерениями подготовленные клеточные суспензии переводили в раствор Хэнкса, содержащий 10-4 М люминола или изолюминола. Для анализа в лунки белого плоскодонного 96-луночного планшета (SPL Life Science, Корея) вносили по 2х105 клеток в объеме 200 дл. БТШ70 (Invitrogen, США) и БСА (Sigma, США) добавляли в лунки до конечной концентрации 0.1-5 дг/мл за 30 мин до индукции «окислительного взрыва». Регистрацию внутриклеточного уровня АФК проводили методом люминол-зависимой хемилюминесценции в присутствии во внеклеточном пространстве скэвенджеров АФК каталазы (Sigma, США) и супероксиддисмутазы (Sigma, США) в концентрациях 2000 U/мл и 100 U/мл соответственно (Nosal et al., 2011). Наряду с этим, для оценки уровня внутриклеточного содержания АФК использовали метод проточной цитофлуориметрии с применением 2 ,7 -дихлорфлуоресцеин диацетата (DCF-DA) (Sigma, США) - флуоресцентного зонда кислородных радикалов, проникающего в клетки, в концентрации 10 дМ (Testa et al, 2011).
Для внесения в клеточные культуры использовали раствор рекомбинантного БТШ70 в PBS. В качестве контроля в этих опытах использовали такие же дозы раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США) в PBS. В серии экспериментов, направленных на оценку эффектов возможной контаминации рекомбинантного белка бактериальным эндотоксином (ЛПС) использовали коммерческие препараты липополисахарида стенок бактерий Escherichia coli (Sigma, США).
Индукция «окислительного взрыва» Для активации клеток, приводящей к лавинообразной продукции АФК («окислительный взрыв»), были использованы хемотактический пептид N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP) (Sigma, США) (Panaro, Mitolo, 1999) в концентрации 1-20 дМ, форбол 12-миристат 13-ацетат (РМА) (Sigma, США) в концентрации 8-2000 дМ (Castagna et al., 1982), кальциевый ионофор А23187 (Serva, Германия) в концентрации 10 дМ (Pressman, 1976). Для оценци влияния БТШ70 на «окислительный взрыв» использовали те же дозы белка, что и для спонтанной продукции АФК.
Для направленного подавления интенсивности продукции АФК ферментным комплексом NADPH-оксидазы использовали ингибитор р47рпох-субъединицы этого комплекса - апоцинин (Calbiochem, Германия) (Touyz, 2008) в концентрации 15 дМ и ингибитор флавинсодержащих ферментов дифенилениодоний - DPI (Sigma, США) (O Donnell et al, 1993) в концентрации 1.5 дМ. Ингибиторы вносили в образцы клеток за 15 мин до добавления белков.
Для получения аутологичного БТШ70 для инрафарингеального введения мышам использовали БТШ70, получаемый из гомогената внутренних органов сингенных мышей с последующей аффинной хроматографией на АТФ-агарозе. 3.3.1. Получение гомогенатов печени и почек мышей
Печень и почки мышей гомогенизировали при помощи лабораторных инструментов и процеживали через сито 100 мкм (SPL Life Sciences, Корея). Гомогенат растворяли в лизирующем буфере и измельчали вначале механически с помощью гомогенатора Ultraurrax (IKA, Германия), затем ультразвуком с использованием ультразвукового диспергатора УЗДН-А (УКРРОСПРИБОР, Украина). Степень разрушения контролировали визуально с помощью микроскопа Axiovert 40 (Zeiss, Германия). Гомогенат центрифугировали 30 мин при 3200 об/мин с использованием центрифуги SORVALL (Thermo Scientific, США); полученный супернатант центрифугировали 45 мин при 10000g с использованием центрифуги J-21 (Beckmann, США) и фильтровали через фильтр 0.22 мкм (Millipore, Германия).
Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии на АТФ-агарозе АТФ-агарозу (Sigma, США) выдерживали в 10х объеме буфера D 3 часа. Затем колонку с АТФ-агарозой последовательно промывали 1М раствором NaCl, 5мМ раствором АДФ в буфере D и буфером D.
Гомогенат внутренних органов мышей разводили лизирующим буфером и двукратно пропускали белковый раствор через колонку. Для более эффективного связывания колонку с белковым раствором инкубировали в течение 20-40 минут при комнатной температуре, после чего собирали фракцию не связавшегося материала. Далее колонку последовательно промывали лизирующим буфером (2 объема колонки), Буфером D (4 объема) и 0.5 М NaCl в Tris-буфере (2 объема). Избыток соли удаляли 1 объемом Буфера D, после чего, производили элюцию белка 3 мМ АТФ в Буфере D (2-5 объемов колонки). При необходимости элюат концентрировали при помощи лиофильной сушки SpeedVac Concentrator (SAVANT, США).
Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре активированных нейтрофилов
Как и ожидалось, апоцинин - специфический ингибитор сборки мембранного комплекса NADPH-оксидазы, взаимодействующий с субъединицей p47phox указанного фермента (Touyz, 2008), в дозе 15 дМ практически полностью подавлял продукцию АФК в используемых моделях. Внесение fMLP в клеточные культуры в присутствии этого ингибитора не приводило к типичной лавинообразной продукции АФК, поэтому при практически нулевой амплитуде «окислительного взрыва» (по сравнению с фоновыми значениями уровня АФК) эффект БТШ70, очевидно, не мог быть зарегистрирован (рис. 29 а, б). Однако присутствие апоцинина в дозе 10 дМ, не вызывающей абсолютного подавления продукции АФК, в образцах клеток не отменяло ингибирующий эффект БТШ70 на фоновую продукцию АФК в данной модели (рис. 30 а, б). Это указывает на то, что антиоксидантный эффект БТШ70 достигается, вероятнее всего, не за счет его взаимодействия с субъединицей NADPH-оксидазы p47phox, обеспечивающей транслокацию цитозольных субъединиц NADPH-оксидазы к плазматической мембране. В пользу этого утверждения также говорит тот факт, что ингибирующий эффект БТШ70 проявляется практически сразу после его добавления (рис. 28), тогда как для интернализации этого белка требуется не менее 15 мин (Сапожников и др., 2011). Возможно, что обусловленное БТШ70 снижение активности NADPH-оксидазы связано с взаимодействием этого протеина с другими субъединицами данного ферментного комплекса или с рецепторами клеточной поверхности нейтрофилов.
Далее был проведен анализ эффектов БТШ70 в присутствии в клеточной культуре DPI - неспецифического ингибитора флавинсодержащих ферментов, в том числе и NADPH-оксидазы, а именно - ее трансмембранной субъединицы gp91phox, представленной на клеточной поверхности, т.е. доступной для прямого взаимодействия с внеклеточным пулом БТШ70. DPI в избыточной концентрации (1.5 дМ) существенно, но не полностью, подавлял в наших моделях уровень фоновой продукции АФК и амплитуду «окислительного взрыва» в образцах клеток КМ мыши без нейтрофилов и фракции нейтрофилов КМ, а также в образцах нейтрофилов, выделенных из периферической крови человека. Полученные результаты продемонстрировали, что, как и в экспериментах с апоцинином, внесение экзогенного БТШ70 в культуры клеток, инкубируемых в присутствии DPI, приводило к снижению общего и внеклеточного фонового уровня продукции АФК (рис. 30 в, г), а также к достоверному снижению амплитуды fMLP-индуцированного «окислительного взрыва» (рис. 29 в, г). л
Влияние БТШ70 на fMLP-индуцированную продукцию АФК нейтрофилами мыши в присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы.
Оценку влияния БТШ70 на «окислительный взрыв» в присутствии 15 цМ специфичного ингибитора NADPH-оксидазы - апоцинина (а, б) и 1.5 цМ неспепифического ингибитора NADPH-оксидазы DPI (в, г) проводили путем сравнения нормированных по показателям котрольных активированных клеток значений амплитуды «окислительного взрыва».
Оценка общего (а, в) и внеклеточного (б, г) уровня продукции активных форм кислорода проводилась методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции соответственно. 1 - контрольные клетки, инкубированные с ингибиторами NOX, 2-2.5 цг/мл референтного белка БСА, 3-2.5 цг/мл БТШ70. Приведены средние значения ± т; п=4; - р 0.05. 1
Оценку влияния БТШ70 на фоновую продукцию АФК в присутствии 10 цМ специфичного ингибитора NADPH-оксидазы - апоцинина (а, б) и 1.5 цМ неспецифического ингибитора NADPH-оксидазы DPI (в, г) проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню значений хемилюминесценции через 5 мин после добавления БТШ70. Оценка общего (а, в) и внеклеточного (б, г) уровня продукции активных форм кислорода проводилась методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции соответственно. 1 - контрольные клетки, инкубированные с ингибиторами NOX, 2-2.5 цг/мл референтного белка БСА, 3-2.5 цг/мл БТШ70. Приведены средние значения ± т; п=4; - р 0.01, - р 0.001.
Важно отметить, что в отношении иммуномодулирующего действия экзогенных рекомбинантных БТШ70 до сих пор не прекращается дискуссия об обусловленности многих зарегистрированных эффектов контаминацией используемых препаратов белка липополисахаридами бактериального происхождения. В наших исследованиях использовались препараты человеческого рекомбинантного БТШ70, очищенного от LPS с помощью полимиксина. Однако, этот метод не гарантирует полного отсутствия примеси эндотоксинов. Поэтому, несмотря на ожидаемую разнонаправленность действия эндотоксина и БТШ70 на продукцию АФК фагоцитирующими клетками, мы провели отдельную серию экспериментов, посвященных анализу эффектов ЛПС в наших моделях. В результате данной серии экспериментов было продемонстрировано, что бактериальные ЛПС в низких концентрациях не влияют на фоновый уровень АФК в нейтрофилах КМ мыши, а эндотоксины в высоких концентрациях вызывают повышение этого уровня (рис. 31). Следовательно, возможная контаминация используемого в наших экспериментах БТШ70 липополисахаридом не может быть причиной ингибирующих эффектов этих протеинов, обнаруженных в наших моделях.
Это подтверждается также отсутствием достоверного ингибирующего эффекта у препаратов белка, загрязненных эндотоксином, в отличие от очищенного БТШ70 (рис. 31). Зарегистрированное отсутствие существенной реакции клеток КМ на ЛПС в низких концентрациях говорит также о принципиальном преимуществе использования модели тестирования влияния внеклеточных БТШ70 на продукцию АФК фагоцитирующими клетками в сравнении с многими другими моделями, применяемыми для анализа иммуномодулирующих эффектов БТШ70, в которых препараты белка и примесь эндотоксина обладают однонаправленной иммуностимулирующей активностью, что не позволяет провести корректную оценку действия БТШ70.
Влияние оценивали путем сравнения нормированных по базовому уровню значений хемилюминесценции через 5 мин после добавления - 2.5 цг/мл очищенного БТШ70 (2), 2.5 цг/мл неочищенного БТШ70 (3) или ЛПС в концентрациях: 0.05 (4), 0.5 (5), 5 [дх/мл (6). 1 - интактные клетки. Приведены средние значения ± т; п=3; достоверные различия с р 0.05 обозначены .
Как было показано ранее, при использовании модели аллергического воспаления дыхательных путей, временный приток нейтрофилов в дыхательные пути наблюдается в острой фазе воспаления, тогда как наступление эффекторной фазы, напротив, характеризуется снижением количества нейтрофилов в дыхательных путях и супрессией нейтрофил-опосредованного иммунного ответа относительно острой фазы. Так как костный мозг является основным источником привлекаемых на периферию нейтрофилов, потенциал нейтрофил опосредованного ответа должен коррелировать с активностью нейтрофилов костного мозга.
В данном был также проанализирован уровень продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами костного мозга мышей с острой и эффекторной фазой аллергического воспаления дыхательных путей (рис. 33-рис. 33).
Спонтанная продукция АФК нейтрофилами коррелировала с долей нейтрофилов в КМ и была заметно снижена у мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей. Индуцированная продукция АФК нейтрофилами, выделенными в острой фазе аллергического воспаления, значительно возрастала по сравнению с нейтрофилами нормальных и сенсибилизированных мышей (рис. 33 а). В тоже время, выделенные из костного мозга мышей на стадии эффекторной фазы аллергического воспаления нейтрофилы демонстрировали снижение индуцированной продукции АФК (рис. 33 б).