Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 4
1.1 Актуальность проблемы 4
1.2 Степень разработанности темы 5
1.3 Цель работы 6
1.4 Задачи исследования 7
1.5 Научная новизна 7
1.6 Теоретическая и практическая значимость работы 8
1.7 Личное участие автора 8
1.8 Степень достоверности и апробация результатов 9
1.9 Публикации 9
2 Обзор литературы 10
2.1 Строение и типы протеасом 10
2.2 Регуляторы протеасом 17
2.3 Роль протеасом в ЦНС 23
2.4 Связь УПС с транскрипционным фактором Zif268 33
2.5 УПС и моноаминергическая система в пластичности ЦНС 34
2.6 Заключение 36
3 Материалы и методы 38
3.1 Животные 38
3.2 Получение осветленных гомогенатов отделов мозга 38
3.3 Определение активностей протеасом 39
3.4 Исследование содержания белков 40
3.5 SDS-электрофорез в ПААГ и Вестерн-блоттинг 40
3.6 Перфузия, фиксация и иммунофлуоресцентное мечение клеток 42
3.7 Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией 43
3.8 Статистический анализ 44
4 Результаты 45
4.1 Протеасомы в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс линии Вистар в эмбриональном и раннем пост-натальном развитии 45
4.2 Связь субъединичного состава протеасом с обменом 5 НТ и DA в головном мозге крыс линий Август и Вистар 52
4.3 Протеасомы в головном мозге мышей, нокаутных по В2т 65
5 Обсуждение 72
5.1 Протеасомы в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс линии Вистар в эмбриональном и раннем пост-натальном развитии 72
5.2 Связь субъединичного состава протеасом с обменом 5 НТ и DA в головном мозге крыс линий Август и Вистар 75
5.3 Протеасомы в головном мозге мышей, нокаутных по В2т 79
6 Заключение 82
7 Выводы 84
8 Список сокращений 86
Список литературы 88
- Задачи исследования
- УПС и моноаминергическая система в пластичности ЦНС
- SDS-электрофорез в ПААГ и Вестерн-блоттинг
- Связь субъединичного состава протеасом с обменом 5 НТ и DA в головном мозге крыс линий Август и Вистар
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из основополагающих свойств нервной системы, обеспечивающих адекватный поведенческий ответ организма на изменяющиеся условия среды, является её пластичность. Синаптическая пластичность считается важным условием адаптивных изменений в мозге, а также компенсации нарушений функционирования нейрональных сетей при нейродегенера-тивных процессах, вызванных наследственными нарушениями либо патологическими воздействиями. Формирование и элиминация синапсов в зависимости от активности нейронов, рост и ликвидация аксонов зависят от интенсивности и специфичности работы убиквитин-протеасомной системы (УПС). В экспериментальных моделях на животных показано, что ингибирование активности протеасом снижает пластичность как нервной, так и иммунной систем. Известно, что при патологиях развития более всего страдают отделы конечного мозга, вносящие наибольший вклад в осуществление когнитивных функций. В связи с этим в настоящей работе исследованы особенности функционирования УПС в эмбриональном и раннем постнатальном развитии коры и гиппокампа, которым принадлежит ведущая роль в осуществлении организации движения и реализации процесса обучения, а также ствола мозга, содержащего ядра жизненно важных центров у млекопитающих. Важно также было изучить особенности функционирования УПС в головном мозге грызунов, развитие которого проходило в генетически обусловленных стрессовых физиологических условиях. Эти исследования мы проводили на двух моделях: мышах, нокаутных по белку /32-микроглобулину (В2т), и крысах линии Август с нарушением обмена моноаминов. У В2т-нокаутных мышей отсутствуют молекулы главного комплекса гистосовместимости класса І (ГКГ I), для которых иммунные протеасомы образуют олигопептиды. В норме молекулы ГКГ I представляют олигопептиды на поверхности клеток, обеспечивая специфические межклеточные взаимодействия. Инбредная линия крыс Август характеризуется нарушениями синтеза моноаминов и выбрана нами ввиду тесной связи моноаминергической системы с формированием эмоций, памяти, мотивации и обучения, а также с диффе-ренцировкой, миграцией нейронов и синаптогенезом. Выявление особенностей функционирования протеасом в реализации молекулярных механизмов нейро-нальной пластичности поможет биологам и медикам продвинуться в понимании ключевых механизмов нарушений развития и функционирования центральной нервной системы (ЦНС).
Степень разработанности темы. С момента открытия протеасом в конце 1980-х годов А. Чехановером (A. Ciechanover), А. Гершко (A. Hershko) и И. Ро-узом (I. Rose), получившими за свое открытие Нобелевскую премию в 2004 г.,
внимание многих научных групп приковано к изучению структуры и функций этого уникального протеолитического комплекса. Исследованию роли протеасом в обеспечении пластичности ЦНС посвящены работы десятков авторов. Имеются данные о важной роли протеасом в обеспечении нейронального и синаптиче-ского гомеостаза. Доказано участие протеасом в процессах синаптической пластичности и долговременной потенциации в ЦНС (Morris, 2006). Известно, что распределение протеасомных субъединиц варьирует в различных отделах головного мозга взрослых особей грызунов (Noda et al., 2000; Ding, Keller, 2001). Протеасомы регулируют уровень специфических белков: NMDA-рецепторных субъединиц, глутаматного транспортера и других белков-переносчиков, участвующих в синаптической передаче. Была выдвинута гипотеза о том, что в ЦНС именно глутаматергическая активность регулирует экспрессию иммунных протеасом через активацию транскрипционных факторов, среди которых Zif268 и CREB (James et al., 2006). Исследования in vivo показывают вовлеченность У ПС в формирование памяти (Choi et al., 2010). Некоторые данные позволяют полагать, что деградация белков играет важную роль на определенном этапе рекон-солидации памяти. Молекулы ГКГ I, представляющие на поверхности клетки пептиды, продуцируемые протеасомами, регулируют синаптическую функцию нейронов и их морфологию (Barco et al., 2005). Показано, что процессы старения в ЦНС связаны с изменениями в структуре и функциях протеасом (Ding, Keller, 2001). Нарушения протеасомной активности наблюдаются при окислительном стрессе и процессах нейродегенерации (Diaz et al., 2003).
Однако перечисленные работы не затрагивали вопроса функционирования пула протеасом и его регуляции в ходе эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития ЦНС млекопитающих, когда пластичность играет критическую роль. Также детально не изучено участие У ПС в проявлениях пластичности мозга у животных с генетически обусловленными отклонениями в функционировании нервной системы, то есть, на моделях нарушения развития нервной системы. В связи с этим нами были изучены особенности функционирования УПС в головном мозге у крыс в период эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития, а также у мышей, нокаутных по В2т, и у инбредной линии крыс Август с метаболическими нарушениями в серотонинергической и дофаминер-гической системах.
Цель работы: Выявить особенности пула протеасом головного мозга грызунов в раннем развитии, а также при генетически обусловленных нарушениях обмена моноаминов и в отсутствие молекул ГКГ I.
Задачи исследования:
-
Изучить изменение пула протеасом (активности протеасом, содержание регуляторов и субъединиц протеасом) в связи с динамикой содержания транскрипционного фактора Zif268 в коре, гиппокампе и стволе головного мозга в эмбриональном (Э19-Э21) и раннем постнатальном (П1-П15) развитии крыс линии Вистар.
-
Изучить особенности пула протеасом, а также экспрессию белка HSP70 и транскрипционного фактора Zif268 в коре, стриатуме и стволе головного мозга у крыс линии Август с генетически обусловленными нарушениями метаболизма моноаминов в ЦНС.
-
Исследовать особенности функционирования протеасом и связанных с ними сигнальных путей в коре, стриатуме, мозжечке и стволе головного мозга у мышей, нокаутных по /32-микроглобулину, входящему в состав молекул ГКГ I.
Научная новизна. Впервые изучена динамика содержания конститутивных и иммунных протеасом, а также регуляторов РА28, РА200 и РА700 протеасом в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс в эмбриональном и раннем постнатальном развитии. Показано повышение уровня иммунных субъединиц LMP2 и/или LMP7 протеасом во всех изученных структурах мозга в периоды развития Э19-Э21 и П7-П15. В период П7-П15 это повышение сопряжено с увеличением содержания транскрипционного фактора Zif268.
Впервые выявлена связь субъединичного состава протеасом с обменом серо-тонина (5-НТ) и дофамина (DA) в мозге крыс. Показана повышенная экспрессия иммунных протеасом, содержащих субъединицы LMP2 и/или LMP7, HSP70 и транскрипционного фактора Zif268 в коре, стриатуме и стволе головного мозга крыс линии Август, отличающихся сниженной активностью ферментов синтеза 5-НТ и DA. Содержание регуляторов РА28, РА200 и РА700 протеасом повышено в коре и снижено в стриатуме крыс Август.
Впервые исследованы особенности функционирования протеасом в различных отделах головного мозга у мышей, нокаутных по В2т. Обнаружено, что фронтальная кора и ствол В2т-нокатуных мышей характеризуются противоположными изменениями в пулах протеасом при постоянном общем уровне протеасом у В2т-нокаутных мышей по сравнению с контрольными животными. Отсутствие в мозге молекул ГКГ I связано с повышенной экспрессией иммунных протеасом и регулятора РА28 протеасом в коре и мозжечке.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты важны для понимания молекулярных механизмов развития и функционирования ЦНС млекопитающих на уровне регуляции работы синаптиче-ских структур и межклеточных взаимодействий. Установленные особенности пула протеасом клеток головного мозга в изменённых условиях выявили потенциальные мишени воздействия (иммунные субъединицы LMP2 и/или LMP7 и регулятор РА28) для будущих разработок терапевтических и генноинженерных подходов в коррекции отклонений функционирования ЦНС.
Личное участие автора. Все эксперименты выполнены непосредственно автором или при его активном участии совместно с сотрудниками лаборатории биохимии процессов онтогенеза ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Автором было изучено изменение пула протеасом в связи с динамикой содержания транскрипционного фактора Zif268 в коре, гиппокампе и стволе головного мозга в эмбриональном (Э19-Э21) и раннем постнатальном (П1-П15) развитии крыс линии Вистар, исследованы особенности функционирования протеасом (активности протеасом, содержания субъединиц протеасом и их регуляторов) в коре, гиппокампе и стволе головного мозга у крыс линии Август с нарушениями метаболизма моноаминов в ЦНС, а также в коре, стри-атуме, мозжечке и стволе головного мозга у мышей, нокаутных по В2т.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты, приведенные в работе достоверны и воспроизводимы, объем выборки достаточен, статистическая обработка проведена с использованием современного программного обеспечения. Работа прошла апробацию на 2-й Всероссийской научной конференции молодых ученых <Проблемы биомедицинской науки третьего тысячеле-тия> (Санкт-Петербург, 2012); на конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2012, 2013); VI российском симпозиуме <Белки и пептидьг» (Уфа, 2013); на 30-м Международном конгрессе по клинической нейрофизиологии (ICCN) сообщества IFCN (Берлин, Германия, 2014); на VII Всероссийской конференции <Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция» (Петрозаводск, 2014 г.).
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на <110> страницах, содержит <28> рисунков, <3> таблицы, <174> источника литературы.
Задачи исследования
При действии на клетки 7-IFN (или aNF) происходит встраивание не конститутивных, а иммунных субъединиц в синтезируемые протеасомы [29,30]. В клетках увеличивается уровень иммунных субъединиц, но содержание POMP в цитоплазме уменьшается. Этот факт объясняется тем, что иммунные протеасомы собираются быстрее, чем конститутивные, что влечет за собой ускоренную деградацию POMP, поскольку он является первым субстратом вновь собранной протеасомы. Кроме того, было показано, что уменьшение уровня POMP влияет на функционирование именно f3bi субъединицы, с которой он связывается аналогично связыванию с /35 субъединицей [31]. Несмотря на то, что сборка иммунных протеасом происходит быстрее, чем конститутивных, их стабильность значительно снижена. Время полужизни иммунных протеасом меньше времени полужизни конститутивных. Это свойство является постоянной характеристикой протеасомы и не зависит от времени или силы воздействия 7-IFN [32]. Синтезирующиеся в клетке аномальные или чужеродные белки подвергаются протеолизу в каталитических центрах иммунных протеасом с образованием потенциальных антигенных олигопептидов со специфическим С-концом, содержащим остатки гидрофобных аминокислот или аргинина [29,33]. Олигопептиды длиной 8-10 аминокислотных остатков являются, как правило, антигенными эпитопа-ми. Более длинные олигопептиды, образуемые иммунными протеа-сомами, укорачиваются до нужной длины под действием аминопеп-тидаз. Антигенные эпитопы соединяются в цитоплазме с белками-транспортерами (ТАРІ и ТАР2, Transporter Associated with Antigen Presentation), переносятся в эндоплазматическую сеть, где связываются с молекулами ГКГ I и выносятся вместе с ними на поверхность клетки в составе трансмембранного пузырька, что служит своеобразной меткой [13,34,35] (рисунок 3).
Убиквитинирование белков-мишеней. Убиквитин или разветвленная цепочка из нескольких молекул убиквитина присоединяются к остаткам лизина в белке-мишени многочисленной системой ферментов убиквитинлигаз ЕЗ (Enzyme 3), каждая из которых специфична в отношении определенной группы белков-мишеней. Вспомогательную роль в убиквитинировании белков играют менее многочисленные факторы Е2 (Enzyme 2), которые связывают убиквитин, и уникальный фактор El (Enzyme 1), который активирует убиквитин. Дальнейшая судьба убиквитинированного белка зависит от структуры метки - размера цепочки полиубиквитина и от того, какие остатки лизина в молекуле убиквитина были использованы для формирования цепочки. УПС высоко специфична и избирательна за счет того, что построена по принципу иерархического усложнения. Фермент Е1 (в клетке он только один) запускает работу УПС, активируя молекулу убиквитина, и передает ее одному из ферментов семейства Е2 (их называют конъюгирующими). Затем в каскад реакций вступает третий участник — представитель семейства ЕЗ-лигаз, сшивающих ферментов. Он принимает убиквитин от Е2, соединяется с белком-субстратом и ковалентно пришивает к нему цепочку убиквитина. Если Е1 не имеет разновидностей, то семейство Е2 насчитывает 13 членов в клетке дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а у млекопитающих — гораздо больше. В семействе ЕЗ сейчас известно более 100 разных лигаз. Структурные аберрации в ферменте Е1 (запускающем УПС) имеют, как правило, летальный эффект, мутации в ферментах Е2 и ЕЗ приводят к многочисленным фенотипическим нарушениям. Белки, предназначенные для деградации и маркированные убиквитином, транспортируются в протеасомы, где связываются с эффекторными субъединицами регуляторных комплексов. Затем с белков удаляется полиу-биквитиновая метка, и белки гидролизуются ферментативным аппаратом протеасом. Эффективное убиквитинирование поврежденных, денатурированных или инактивированных белков позволяет удалить из клетки потенциально токсичные или нефункциональные продукты и генерировать эпитопы для представления их совместно с адгезивными молекулами другим клеткам. Все этапы работы убиквитин-протеасомной системы от выбора белка-мишени до процессинга в про-теасомах строго регулируются многочисленными факторами, чтобы надежно обеспечивать качество клеточного протеома [36-38].
Активность протеасом является центральным аспектом многих клеточных функций, включая контроль качества белков, репарацию ДНК, транскрипцию, рагуляцию клеточного цикла, трансдукцию сигнала и презентацию антигенов [39]. Протеолитические сайты протеасом заключены внутри закрытой бочонкообразной структуры 20S-кора. Для обеспечения доступа субстратов к протеолитическим сайтам требуется активация 20S протеасомы и регуляция активности и специфичности протеолиза. Известны три семейства регуляторов, обеспечивающих доступ к центральной протеолитической камере, с которыми связывается 20S протеасома. Наиболее консервативное семейство включает в себя регулятор PA700/19S у эукариот, PAN у архей и эубактериальный гомолог ARC/Mpa. Эти регуляторы используют гидролиз АТФ для активации деградации белковых субстратов. Регулятор РА700 может связываться с одной или с двух сторон 20S протеасомы, образуя 26S протеасому, и распознает по-лиубиквитинированные субстраты. Два других семейства регуляторов: PA28/11S/REG/PA26 и РА200/В1тЮ - менее консервативны и АТФ-независимы. Их функции понятны лишь отчасти, но достаточно хорошо известны механизмы активации протеасом этими регуляторами [39].
Регулятор РА700. Основным регулятором протеасом является РА700, обеспечивающий АТФ- и убиквитин-зависимый протеолиз. РА700 может фланкировать 20S протеасому с одной или с двух сторон, формируя 26S протеасому. РА700 состоит из 19 субъединиц, образующих биохимически разделяемый субкомплексы — крышку и основание (рисунок 4). Основание располагается в непосредственной близости к воротам протеасомы и состоит из шести гомологичных АТФ-азных (семейство AAA АТФ-аз) субъединиц Rptl-Rpt6, формирующих гексамерное кольцо. Кроме АТФ-аз основание содержит крупные субъединицы Rpnl и Rpn2, а также рецепторы убиквитина Rpnl0 и Rpnl3. Крышка состоит из девяти не-АТФ-азных субъединиц, одна из которыхДрпП, обладает деубиквитинилирующей активностью и располагается близко к поре, сформированной АТФ-азными субъединицами. РА700 разворачивает белковые структуры и проталкивает цепочку аминокислот в протеолитическую камеру протеасомы, используя энергию гидролиза АТФ [40].
УПС и моноаминергическая система в пластичности ЦНС
Пластичность ЦНС обеспечивается взаимодействием между нейронами и глией, а также клетками иммунной системы и является основой для формирования специфических нейрональных связей в процессе обучения и памяти. В процессе развития нервной системы конусы роста следуют определенным траекториям в направлении целевой области и в итоге образуют связи с «правильными» постсинаптическими партнерами. Глиаль-ные клетки и клетки иммунной системы передают сигналы нейронам для оптимального позиционирования аксонов, а также для стабилизации и тонкой настройки аксональных отростков в целевой области. В равной степени нейроны обеспечивают необходимой информацией глиальные клетки, поддерживают их миграцию и правильное позиционирование. Одним из наиболее изученных примеров нейронально-глиальных взаимодействий в процессе развития нервной системы является направляемая глией радиальная миграция нейронов в переднем мозге млекопитающих [81]. Ликвидация аксонов широко распространена при закладке/перенастройке нейрональных сетей как у позвоночных, так и у беспозвоночных, а также наблюдается при патологических состояниях. Показано, что в этом процессе УПС играет ключевую роль [82].
В литературе имеются данные о важной роли протеасом в обеспечении нейронального и синаптического гомеостаза [3, 8]. Показано, что процессы старения в ЦНС связаны с изменениями в структуре и функции протеасом [7,76,83]. Нарушения протеасомной ак тивности наблюдаются при окислительном стрессе и процессах ней-родегенерации [8, 84-87]. Доказано участие протеасом в процессах синаптической пластичности и долговременной пластичности в ЦНС [1, 88]. Протеасомы регулируют уровень специфических белков: NMDA-рецепторных субъединиц, глутаматного транспортера и других белков-переносчиков, участвующих в синаптической передаче [89-92]. Индуцируемая агонистом интернализация рецептора АМРА у млекопитающих регулируется УПС-зависимой деградацией PSD-95 [90,93]. Нарушение убиквитинирования NR1 в гиппокампальных нейронах приводит к повышению уровня NR1 и работы NMDA-рецепторов в прямой зависимости от уровня активности нейронов [94], что свидетельствует об участии УПС в контроле гомеостаза NR1 в синапсах. Также есть свидетельства о том, что уровень рецептора GABAA, ключевого рецептора в ингибировании проведения сигнала, регулируется УПС [95,96].
Кроме контроля рецепторов, непосредственно участвующих в синаптической передаче, УПС регулирует и архитектурные компоненты синапса. Сывороточная индуцируемая киназа SNK в гиппокампальных нейронах индуцируется синаптической активностью и локализуется в дендритных шипиках. Затем SNK фосфорилирует ассоциированный с шипиками гуанозин-трифосфатазо-активируемый белок Rap (или SPAR, постсинаптический белок, регулирующий актин), который подвергается УПС-зависимой деградации, вызывая морфологические изменения в шипиках. Активация SNK в свою очередь зависит от активности рецепторов NMDA, АМРА и потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа (LVGCC) [92]. Активность С-концевой убиквитин-гидролазы LI (UCH-L1), деубиквитинирующего фермента, регулируется активацией NMDA рецепторов, влияя на распределение белков в синапсе, морфологию, размер и плотность шипиков. Этот факт указывает на участие УПС в структурном ремоделирова-нии синапсов, зависимом от активности нейронов [90-94,97-106]. Исследования in vivo показывают вовлеченность УПС в формирование памяти [5, 107-111]. Существующие данных позволяют полагать, что деградация белков играет важную роль на определенном этапе реконсолидации памяти [110,111]. При долговременной по-тенциации в шипики дендритов транспортируются не только рибосомы (для синтеза белков), но и протеасомные комплексы для локальной деградации белковых молекул и образования специфических олигопептидов для ГКГ I и других адгезивных молекул, при этом концентрация протеасом повышается примерно в 8 раз [97,103,106]. Убиквитин-протеасомный путь оказался критическим для формирования памяти у позвоночных [112].
Показано, что активность протеасом в синаптических термина-лях выше, чем в ядрах нейронов [113]. Более того, активность протеасом в этих компартментах по-разному регулируется протеинки-назами. Этот механизм может быть ключевым в основе синапс-специфической пластичности. УПС-зависимая деградация активно участвует в регуляции синаптогенеза и элиминации синапсов в процессе развития [114-116], изменения функций нейротрансмиссии и структурного ремоделирования синапса [90, 92, 102, 104]. Полагают, что некоторые формы ликвидации аксонов в процессе развития имеют общие механизмы с дегенерацией нейронов в ответ на повреждение у млекопитающих [82]. На культуре гиппокампальных нейронов млекопитающих показано, что ингибирование протеасомной активности увеличивает пул повторно используемых везикул на 76%. Из этого следует, что УПС регулирует работу пресинаптических терминалей. Недавно обнаруженная убиквитин-лигаза Fbxo45, которая экспрес-сируется в нервной системе, регулирует передачу нервного импульса путем модулирования синаптического фактора Muncl3-1, инициирующего образование везикул [117].
Таким образом, в ЦНС протеасомы участвуют в процессах контроля экспрессии рецепторов и в образовании архитектурных компо нентов синапсов, а также в регуляции передачи нервного импульса (рисунок 7). Олигопептиды, образованные УПС в нейронах в ответ на снижение активности, служат уникальным молекулярным компонентом контакта этого нейрона с другими, распознающими этот сигнал клетками, и создают возможность образования специфических межклеточных связей и формирования нейрональных сетей. Обобщив приведенные выше данные, можно заключить, что УПС является важным звеном в реализации пластичности нервной системы.
Иммунные протеасомы в центральной нервной системе. Впервые иммунные протеасомы в ЦНС были обнаружены в микроглии, составляющей 5-10% от общего количества клеток в ЦНС мозга и выполняющей наряду с астроцитами антиген-представляющую функцию в ЦНС [118]. В клетках астроцитомы (глиальной опухоли головного мозга, образующейся из астроцитов) человека наблюдается снижение уровня иммунных субъединиц LMP2 и антиген-представляющего транспортера (ТАРІ), коррелирующего со степенью выраженности астроцитомы [86].
Распределение протеасомных субъединиц варьирует в различных отделах головного мозга [2,3]. Пирамидальные нейроны коры и гиппо-кампа имеют высокий уровень содержания протеасом по сравнению с другими отделами мозга [119] и экспрессируют субъединицы иммунных протеасом [8]. Впоследствии было установлено, что это глутама-тергические нейроны [88], и иммунные протеасомы расположены в их дендритах [8]. Была выдвинута гипотеза о том, что в ЦНС именно глутаматергическая активность через активацию транскрипционных факторов, среди которых Zif268 и CREB, регулирует экспрессию иммунных протеасом [4].
SDS-электрофорез в ПААГ и Вестерн-блоттинг
Ввиду того, что иммунные протеасомы продуцируют эпитопы для представления в составе молекул ГКГ I, было решено оценить субъединичный состав пула протеасом у животных, не имеющих ГКГ I.
ХПА протеасом в головном мозге В2т-нокаутных мышей. Обнаружено достоверное увеличение ХПА протеасом во фронтальной коре и снижение ее в стриатуме и стволе головного мозга мышей, нокаутных по В2т, по сравнению с соответствующими отделами головного мозга контрольных мышей C57BL/6 (рисунок 23). При этом ХПА была снижена в большей степени в стволе мозга В2т-нокаутных мышей. Таким образом, фронтальная кора и ствол мозга, являясь структурами с противоположным соотношением нейронов и глиальных клеток, проявляют и наиболее выраженные разнонаправленные изменения ХПА протеасом у В2т-нокаутных мышей в сравнении с контролем. В мозжечке В2т-нокаутных и контрольных мышей ХПА протеасом достоверно не отличалась.
Причиной обнаруженных различий может быть: (а) изменение общего количества протеасом; (б) изменение экспрессии иммунных субъединиц протеасом; (в) изменение соотношения регуляторов РА28 и РА700 [8, 25]. Иммунная субъединица LMP7 протеасом проявляет ХПА, а иммунная субъединица LMP2 - КПА. Но присутствие LMP2 вместо конститутивной субъединицы )3\ оказывает влияние на ХПА [26]. Поэтому необходимо было определить, как изменяется содержание иммунных субъединиц и регуляторов протеасом в коре, гиппо-кампе, мозжечке и стволе головного мозга В2т-нокаутных мышей по сравнению с контрольными мышами C57BL/6
Рис. 23: ХПА протеасом в различных отделах головного мозга мышей C57BL/6 и В2т-нокаутных мышей. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего, достоверное отличие от контроля при р 0, 05, п = 8.
Содержание иммунных субъединиц и регуляторов протеасом в головном мозге В2т-нокаутных мышей. Объем общего пула протеасом оценивали по содержанию в пробах субъединиц cd,2,3,5,6,7, входящих в состав всех форм протеасом, содержание регуляторов РА28 и РА700 протеасом оценивали по субъединицам РА28а и Rpt6, соответственно. По содержанию иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 судили об уровне иммунных протеасом, включающих субъединицу LMP7 и/или LMP2.
Полученные данные говорят о том, что объем общего пула протеасом в изученных отделах головного мозга В2т-нокаутных мышей не изменялся относительно контрольной группы животных (рисунки 24, 25). При этом значительно менялся субъединичный состав протеасом и содержание регуляторов. Во фронтальной коре обнаружено достоверное повышение экспрессии иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28. Это объясняет возрастание ХПА в полном соответствии известными данными о влиянии на нее иммунной субъединицы LMP7 при замещении протеолитической субъединицы /55. То же можно сказать о влиянии на активность регулятора РА28 протеасом, Кора Стриатум Мозжечок Ствол
Rpt6 (48 кДа) NeuN (46, 48 кДа) gFAP (50 кДа) р-актин (43 кДа) Рис. 24: Экспрессия субъединиц al, 2, 3,5, 6, 7, LMP7, LMP2 протеасом, субъединицы РА28а и Rpt6 регуляторов протеасом, белков NeuN и gFAP в различных отделах головного мозга мышей C57BL/6 и В2т-нокаутных мышей по данным Вестерн-блотов белков осветленных гомогенатов с использованием антител к указанным субъединицам. При анализе относительное количество (оптическая плотность блотов) белков нормализовали на содержание /3-актина. облегчающего гидролиз коротких олигопептидов, к которым относится субстрат, используемый нами в экспериментах. В стволе головного мозга В2т-нокаутных мышей обнаружены противоположные изменения относительно коры: экспрессия иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 протеасом снижена (рисунок 25), что выразилось в уменьшении ХПА протеасом относительно контрольных мышей линии C57BL/6.
Стриатум В2ш-нокаутных мышей, как и ствол мозга, характеризовался снижением содержания иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 протеасом относительно контроля (рисунок 25). Стоит отметить, что степень снижения экспрессии регулятора РА28 в стри LMP2
Экспрессия субъединиц cd, 2, 3, 5,6, 7, LMP7, LMP2 протеасом, субъединицы PA28a и Rpt6 регуляторов протеасом, белков NeuN и gFAP в различных отделах головного мозга мышей C57BL/6 и В2т-нокаутных мышей по данным Вестерн-блотов белков осветленных гомогенатов с использованием антител к указанным субъединицам. При анализе относительное количество (оптическая плотность блотов) белков нормализовали на содержание /3-актина. атуме и в стволе четко коррелировала со степенью снижения ХПА в этих структурах у В2т-нокаутных мышей относительно контрольной группы. Это с большой вероятностью говорит о большем вкладе регулятора РА28 в сравнении с субъединицей LMP7 в изменение ХПА в стриатуме и стволе. В мозжечке В2т-нокаутных мышей выявлены более значительные изменения в пуле протеасом в сравнении с другими отделами. Несмотря на то, что ХПА в мозжечке В2т-нокаутных мышей достоверно не изменялась, в нем возрастала экспрессия иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 в большей степени, чем в коре. Также в мозжечке была повышена экспрессия второй иммунной субъединицы, LMP2, и снижена экспрессия регулятора РА700. Два этих фактора, очевидно, нивелировали стимулирующие эффекты иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 на ХПА. Нельзя исключать, что в мозжечке ХПА протеасом регулируется и другими, не известными на данный момент факторами. Заметим, что изменение экспрессии иммунной субъединицы LMP2 было сонаправленно с изменением экспрессии иммунной субъединицы LMP7 во всех отделах мозга В2т-нокаутных животных по сравнению с контрольной группой. Однако изменение экспрессии субъединицы LMP2 было либо менее выраженным (в мозжечке), либо проявлялась только тенденция к этому изменению (в коре, стриатуме, стволе). Полученный результат свидетельствует о том, что иммунные субъединицы LMP7 и LMP2 входят в состав разных форм иммунных протеасом в головном мозге В2т-нокаутных мышей. Иными словами, во всех отделах головного мозга В2т-нокаутных мышей имеется форма, содержащая субъединицу LMP7, а также форма, содержащая субъединицу LMP2, и, возможно, форма, содержащая обе эти субъединицы.
Связь субъединичного состава протеасом с обменом 5 НТ и DA в головном мозге крыс линий Август и Вистар
В стволе отсутствие значительных изменений в пуле протеасом, вероятно, обусловлено его ранним становлением и стабильностью механизмов регуляции пластичности этой древней структуры головного мозга [137,138,167-169]. Стуктуры конечного мозга демонстрируют самую высокую способность к компенсации недостатка моноаминер-гической системы путем активации клеточных (увеличение популяции нейронов и глии) и молекулярных механизмов нейрональной пластичности, а именно транскрипционного фактора Zif268, иммунных протеасом, регуляторов протеасом, и белка теплового шока HSP70 -стресс лимитирующего белка. Стриатум занимает промежуточное положение между стволом и фронтальной корой, являясь ближайшей мишенью для дофаминергических нейронов и средне-удаленной для серотонинергических нейронов. Можно предположить, что дефицит синтеза моноаминов, а, следовательно, и необходимость компенсации, в стриатуме ниже, чем в коре головного мозга.
Транскрипционный фактор Zif268 и У ПС, а именно иммунные про-теасомы, играют важную роль в реализации пластичности головного мозга, что подробно обсуждалось в обзоре литературы. Проведенное нами исследование показало, что содержание Zif268 и иммунных протеасом повышено во фронтальной коре и стриатуме крыс линии Август одновременно с увеличенным содержанием 5-НТ и DA на фоне сниженной активности триптофан- и тирозин-гидроксилаз. Иммуно-гистохимический анализ выявил присутствие значительно большего количества белка Zif268 в цитоплазме клеток на срезах коры головного мозга у крыс линии Август (у Вистар больше в ядре), колока-лизованого с иммунными субъединицами протеасом. Учитывая повышенное содержание Zif268 у крыс линии Август, можно предположить, что это связано с активной наработкой, непрерывным синтезом транскрипционного фактора. Изменения в пуле протеасом в совокупности с повышенной экспрессией транскрипционного фактора Zif268, вероятно, служат адаптационным механизмом коры головного мозга, гарантирующим сохранение когнитивных способностей особей в условия нарушения метаболизма моноаминов.
Изучаемые нами отделы головного мозга В2т-нокаутных мышей можно разделить на две группы по обнаруженным в пуле протеасом изменениям. Первую группу образуют фронтальная кора и мозжечок, характеризующиеся повышеной экспрессией иммунных протеасом и увеличением соотношения регуляторов РА28/РА700 за счет повышения экспрессии регулятора РА28. Ко второй группе относятся стриатум и ствол, в которых, напротив, экспрессия иммунных протеасом и соотношение регуляторов РА28 /РА700 снижены. Существуют данные об увеличении в клетках содержания иммунных протеасом и регулятора РА28 при окислительном стрессе и проявлении ими в этих условиях антистрессорных и адаптивных функций [170,171]. Вероятно, во фронтальной коре и мозжечке, структурах, обеспечивающих сенсорное восприятие, выполнение моторных команд, координацию движений и другие важные функции, иммунные протеасомы и регулятор РА28 играют адаптивную роль для поддержания пластичности нервной системы в отсутствие молекул ГКГ І. В стриатуме и стволе головного мозга В2т-нокаутных мышей при неизмененном уровне общего пула протеасом и сниженном содержании в нем иммунных субъединиц белковый обмен поддерживается преимущественно за счет конститутивных протеолитических субъединиц. Такое разделение ролей протеасом в различных отделах головного мозга В2т-нокаутных мышей, очевидно, участвует в обеспечении целостности функционирования центральной нервной системы в отсутствие молекул ГКГ I. Иммунные протеасомы так же, как и регулятор РА28, впервые были описаны как факторы, индуцируемые под действием 7-интерферона [172]. При этом их роль сводилась исключительно к повышению продукции антигенных эпитопов из чужеродных белков для молекул ГКГ I и участию в развитиии Т-клеточного иммунного ответа. Впоследствии было показано, что при выполнении иммунными протеасомами функций адаптации к окислительному стрессу индукция их экспрессии осуществляется разными сигнальными каскадами, в частности, с участием окиси азота и фактора транскрипции CREB или белков теплового шока [170,173]. Кроме того, HSP70 способствует диссоциации 268-протеасом на коровую частицу 20S и регуляторный субкомплекс РА700 [174]. При этом увеличивается количество проте-асом, содержащих регулятор РА28, встраивающийся на место регулятора РА700 и повышающий протеолитическую активность протеасом в отношении поврежденных окислительным стрессом белков. Обнаруженный нами факт корреляции экспрессии иммунных протеасом, регулятора РА28 и сигнальных белков nNOS и HSP70 во фронтальной коре и стволе мозга В2т-нокаутных мышей дает основание полагать, что данные сигнальные белки включены в регуляцию экспрессии иммунных протеасом и регулятора РА28 и в ситуации, связанной с отсутствием молекул ГКГ I.
Головной мозг В2т-нокаутных мышей отличается от контрольных мышей C57BL/6 клеточным составом: в большей части изученных отделов у нокаутных мышей уменьшено содержание нейронов и аст-роцитов. Этот результат, скорее всего, отражает последствия нарушения миграции нейрональных предшественников из выстилки желудочков головного мозга в отсутствие молекул ГКГ I. Изменения клеточного состава в нервной ткани конечного мозга свидетельствуют о комплексных, специфических нарушениях процессов формирования фронтальной коры и стриатума в онтогенезе В2т-нокаутных животных. Снижение способности к запоминанию у взрослых В2т-нокаутных животных может быть обусловлено изменением структуры нейронных сетей в кортикальных отделах конечного мозга, и, как следствие, снижением пластичности неокортекса.