Введение к работе
Актуальность темы. Эмбриональные стволовые ( ES ) клетки млекопитаюднх - это полученные из эмбрионов млекопитающие недетерминированные плюрипотентные клеткк. ES клетки могут быть получены из- эмбрионов на стадии бластоцисти. На этой стадии эмбрион представлен двумя типами клеток - клетками трофэктодермы, обладающими ограниченными способностями к развитию, к плюрипотентньти клетками внутренней: клеточной массы ( БКК ). дающими «ч-зэ всем типам дифференцированная клеток взрослого организма, включая клетки зародыиевого пути. Клетки ВКН н являются источником получения ES клеток. ES-клетки обладает способностью нормально пролиферировать при соединении с клетками эмбриобласта нормального эмбриона при создании агрегационных или инъекционных -химер. При этом полученные химеры проявляют следующие черты: а) деля полученных химер является очень высокой; б) степень участия ES клеток в формировании химерного организма часто превышает 50%; в) химеризм обычно.является экстенсивных к обычно затрагивает все органы химерных животных. Еще одним существенным свойством ES-клеток является их высокая дифференцировочная активность в условиях,in vivo и in vitro. ',
Р течение более чем десятилетия ES клетки лабораторных животных ( иывей ) чрезвычайно широко использовали в качестве модели изучения эмбриогенеза. В последние несколько лет был опубликован ряд работ по генетической трансформации мы-еиных ES оеткок и получению химерных'грансгенных животных. Оказалось, что инъецированные в полость бласгоцисты 'еретически трансформированные клетки колонизируют половые валики, а введенные гены с:
абильн*11Е&рЗДЯЬНАПэт кліочной линии НОЧНАЯ f^^VHOTEKA." (toot. с*л -- ^х мм. И. А. Г
химерные ткани и через клетки зародышевого пути следующему поколений ( Gossler et al.. 1989; Robertson, 1991; Scftwartsberg et al., 59S9; Thompson et al., 19S9 ). Последнее обстоятельство открывает перспективу разработки новых подходов к получению трансгенных сельскохозяйственных животные. Перенос генов,, опосредованный генетически трансформированными ES клетками имеет ряд преимуществ, особенно в отношении сельскохозяйственных животных. Генетически трансформированные ES клетки можно подвергать скринингу по критериям, наилучшим способом удовлетворяющим требованиям изучаемой экспериментальной проблемы. Целостность конструкции, введенной б ES клетки, всегда может быть проверена перед инъекцией клеток в бластоцисту. Использование ES-клеточных линий соз-. дает возмовность воспроизведения условий эксперимента, что не может быть достигнуто при использовании других методов трансгенеза.
Все выше изложенное, пробудило интерес к получению ES клеток сельскохозяйственных животных. Однако вплоть до настоящего времени не удалось получить ES клетки сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось выделение, идентификация и поддержание в культуре эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов сельскохозяйственных
ЖИВОТНЫХ. "
В соответствии с этим'решались следующие задачи: 1. определить стадию предимплантационного развития эмбрионов кандого из используемых видов сельскохозяйственных
животных, наилучшим образом способствующую дсстяженно указанной цели;
' Z, подобрать такие условия культивирования in vitro эмбрионов сельскохозяйственвых животных, которые сделали бы возможным получение и поддержание в культуре ES клеток;
3. отработать различные методы получения ES клеток;
4. идентифицировать оолучекные эмбриональные клетки
сельскохозяйственных животных.
Научная новизва. Научная новизна работы заключается в том, что впервые в России были получены ES-подобние клетки коров, поддерживаемые в культуре в течение 3-х пассажей. Показана возможность использования фидерного, глоя клеток г рануле эы для получения и поддержания в культуре ЕЗ-подобных клеток коров. Получены данные, подтверждающие наличие в раннем эмбриональном предимплактационвом развитии свиней периода покоящегося эмбрионального диска, в течение которого клетки змбрнобласта находятся в метаболически неактивном состоянии.
Практическая значимость работы. Практическая значимость работы состоит в том, что в процессе экспериментов были разработаны методические рекомендация по выбору условии культа-БИрования in vitro эмбрионов коров и свиней, необходимых для получения эмбриональных стволовых клеток, и по выбору стадий раннего развития эмбрионов коров и свиней; Кроме того, был апробирован иммувохирургнческий способ ( Sorter и Knowles, 1975 ) выделения энбриобластов у эмбрионов свиней.
Реализация результатов исследований. Полученные резульг таты будут использованы при составлении методики получения ' ES клеток сельскохозяйственных ЖЯЕО'ЛЛЯ.
- 4 -Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку:
на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. - февраль 1990 г.
на Всесоюзном совещании "Проблема развития биотехнологии в животноводстве". - Дубровицы. - ВИЖ. - август 1990г.
На Всепольской конференции "Genetyka 2000". Краков ( Польша ). - сентябрь 1992 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, одна из которых на английском языке.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена не 94'страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 21 рисунок. Список литературы включает 113 названий, в том числе 109 иностранных авторов.