Введение к работе
Актуальность проблемы. Инактивация и поглощение нейтрофилами бактерий является основным мехакгамом зашиты организма хозяина на ранних стадиях бактериальной инвазии. Обычно через 2-4 часа после внедрения инфекции начинается интенсивный выход нейтрофилов в ткани, задержка может привести к генерализации инфекции (Маянский, 1989). Способность фагоцитов к самостоятельному движению в значительной мере определяет эффективность их выхода в очаг воспаления.
Высокая реактивность нейтрофилов к разнообразным изменениям внутренней среды у больных делает их важным объектом клинико-диагностических исследований
Одним из показателей функционального состояния нейтрофилов является их подвижность. Снижение подвижности нейтрофилов крови наблюдали при заболеваниях различной этиологии: бактериальных и вирусных инфекциях, онкологических заболеваниях, ожоговой болезни, некоторых наследственных заболеваниях, связанных с дефектами лейкоцитов (Quie et aL, 1978; Repo, 1987). По-видимоиу, механизмы нарушения подвижности нейтрофилов во всех этих случаях различны, об этом свидетельствует разнообразие токсических факторов выделяемых в кровь и способных угнетать подвижность нейтрофилов. Из бактериальных факторов угнетающим действием обладают экзотоксины, лнпополисахариды, ненасыщенные свободные жирные кислотыхемоаттрак1ангы в высоких концентрациях, из сывороточных факторов - агрегированные иммуноглобулины и факторы комплемента, из тканевых факторов - гистамин, лейкотриены, кроме этого возможна аутоинтоксикация иейтрофилов токсическими продуктами генерируемыми пероксидазной системой при их активации различными стимулами
Диагностика функциональных изменений нейтрофилов может оказаться полезной для объективной оценки тяжести интоксикации и возможности осложнений заболевания, раннего распознавания септических состояний, а также для поиска специфических средств коррекции нарушений функций нейтрофилов.
в настоящее время в клинических исследованиях подвижности нейтрофилов широко применяются методы разработанные 20-30 лет назая это метод миграции под агарозой и миграции в миллипоровских фильтрах. Достоинство этих методов в простоте и дешевизне, но есть и существенные недостатки: во-первых регистрируется интегральная подвижность по перемещенио клеточного фронта, т.е. по самым быетрым клеткам в популяции, во-вторых, эти методы исключают анализ подвижности индивидуальных клеток, в-третьих, для получения достоверной картины перемешения требуется значительное время (как минимум несколько часов).
Альтернативным этим методам исследования интегральной подвижности является визуальный метод исследования движения нейтрофипов на стеклах под микроскопом. Исследование индивидуальной подвижности нейтрофилов на стеклах имеет давнюю историю (Hasten, Wilkinson, 1988), прогресс в этой области исследований был связан с автоматизацией регистрации и анализа данных.
В 80х годах появляются полуавтоматические преобразователи оптического изображения в электрические сигналы - т.н. дигитайзеры (Howard, 1982; Shields, Haston, I985) и полностью автоматизированные методы регистрации и анализа подвижности клеток на базе систем обработки изображений на ЭВМ (Fisher et al, 1989; Туманов и др. 1990).
До последнего времени автоматизированные методы применялись только в экспериментальных исследованиях, нами впервые этот метод применен для экспресс-анализа подвижности лейкоцитов у больных. Метод позволяет получать интегральную картину поведения клеточной популяции и одновременно изучать индивцдуальное поведение клеток в норме, патологии и при различных экспериментальных воздействиях.
Исследование механизмов амебоидного движения открывает новые пути к модификации этой важной клеточной функции при лечении различных заболеваний, например, в ускорении заживления ран или притуплении воспалительной реакции при действии противовоспалительных препаратов, угнетающих выход в ткани лейкоцитов, а также задержки инвазии раковых клеток (Stossel, 1993).
Цель исследования, Изучение механизмов угнетения и стимуляции подвижности нейтрофилов и поиск специфических средств коррекции нарушений.
Задачи исследования,
1. Разработка методе регистрации и анализа подвижности индивидуальных
клеток и клеточкой популяции.
-
Определение границ нормы подвижности.
-
Исследование зависимости нарушения подвижности нейтрофилов у больных
с хирургическими заболеваниями от тяжести состояния и хирургического вмешательства.
4. Разработка прогностических критериев по различным параметрам
подвижности нейтрофилов у больных и доказательство принципиальной
возможности оценки специфики нарушений подвижности.
5. Исследование механизмов действия различных хемокинетиков в связи с
возможным использованием для специфической коррекции нарушений
подвижности нейтрофилов.
Научная новизна. Разработано уникальное программное обеспечение для регистрации и анализа подвижности нейтрофилов, по многим параметрам превосходящее известные зарубежные анапогн Впервые детально исследована гетерогенность популяции нейтрофилов по скорости движения, площади клеток и геометрии их траекторий движения. Применение средних для популяции показателей среднеквадратичного удаления позволило получить принципиально новые данные о различии механизмов действия двух хемокинетиков - альбумина и FMLP. Фурье-анализ изменений площади нейтрофилов выявил несколько типов угнетения подвижности при действии вторичных посредииков.
В клинических исследованиях метод автоматической регистрации и анализа подвижности нейтрофилов применяется впервые в мире. Впервые обнаружено хемокинетическое действие серотонина и его защитное действие на нейтрофилы больных с интоксикатионным синдромом. Вводится новый прогностический показатель для больных - сдвиг частотных характеристик спектра изменения площади нейтрофилов.
практическая значимость работы, Исследование носит как прикладной так и фундаментальный характер. В клинической пракгике может найги применение для оиенки тяжести интоксикации, прогноза течения заболевания и в качестве экспресс-метода ранней диагностики сепсиса, а также для оценки эффективности лечебных мероприятий. Фунааментальный аспект проблемы заключается в изучении клеточных и молекулярных мехакизмоа двигательной активности нейтрофипов и ее нарушений, а также в поиске путей специфической коррекцик
Внедрение в практику. Разработанный коллективом авторов в содружестве клшшко-биохимической лаборатории и лаборатории кибернетики Института хирургии им. А.В.Вишневского метод апробирован на больных из отделения гкойных ран и ожогового центра Института хирургии им. АВ.Вишневского, а также больных из МОНИСИ и 2й Московской городской инфекционной 6ольницы.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
разработан метод автоматической регистрации и анализа подвижности нейтрофилов, позволяющий проводил, оценку изменений двигательной активности нейтрофилов в норме, патологии и при рззличных фармакологических воздействиях по большому числу показателей;
-
- определены показатели нормы подвижности и выявлены нарушения подвижности при заболеваниях различной этиологии;
3 показана информативность метода при оценке тяжести состояния больных с
раневой инфекцией и эффективности проводимого лечения;
4 - с помощью фармакологических воздействий в эксперименте смоделированы
нарушения подвижности и показана принципиальная возможность различения типов нарушения, связанных с активацией и регуляцией;
5 исследованы механизмы действия хемокинетиков, как наиболее вероятных
кандидатов на роль протекторов при интоксикационном синдроме;
6 - показана зашитная роль серотонина при нарушениях подвижности у
больных с интоксикационным синдромом.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на Всесоюзном рабочем совещании по программе "Внутриклеточная сигнализация и ее использование для управления функциями организма и биотехнологии"
(Москва, 1987); на заседании секции физиологии клетки Московского физиологического общества (Москва, 1989); їм заседании Всесоюзного общества информатики и вычислительной техники, секши "Информатика в медицине" (Москва, 1990); на I Международном конгрессе патофизиологов (Москва, 1991); на симпозиуме стран СНГ "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород 1993); на симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигяализании" (Москва, 1993); на XII научно-практической конференции "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1994); на XVI Европейском конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Мадрид, 1995); Доклад на Президиуме РАМН о работе временной межинсппугской группы по теме: "Роль серотонина в организме человека и животных. Синдром серотониновой недостаточности." (Москва, 1995).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 статей.
Структура и объем работы. Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, экспериментальную часть с изложениеи результатов исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 200 стр. и иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами. Список литературы содержит 254 источника, из которых 29 на русском языке и 225 на иностранних