Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Свободные радикалы 10
1.2 Стадии перекисного окисления липидов 12
1.3 Биологическое значение перекисного окисления липидов 13
1.4 Антиоксидантная система организма
1.4.1 Токоферол 16
1.4.2 Каталаза 18
1.4.3 Церулоплазмин
1.5 Окислительный стресс 20
1.6 Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита у лактирующих жвачных
1.6.1 Динамика перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в различные стадии лактации 22
1.6.2 Взаимосвязь перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты с молочной продуктивностью 24
1.6.3 Влияние различных факторов на процесс перекисного окисления липидов и антиоксидантную защиту
1.7 Влияние перекисного окисления липидов на активность ферментов в плазме крови 26
1.8 Влияние перекисного окисления липидов на состав липидов молока 29
1.9 Заключение по обзору литературы 33
2. Собственные исследования 37
2.1 Материалы и методы исследований
2.1.1 Первая серия опытов. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита у сухостойных и лактирующих коров 39
2.1.2 Вторая серия опытов. Исследование влияния перекисного окисления липидов на дисперсность молочного жира у коров 42
2.1.3 Методика клинического и биохимического анализа крови, молока и молочного жира 43
2.1.4 Биометрическая обработка результатов 46
2.2 Результаты собственных исследований и их обсуждение 47
2.2.1 Первая серия опытов. Изучение влияния перекисного окисления липидов на лактационную функцию организма коров 47
2.2.1.1 Молочная продуктивность коров 47
2.2.1.2 Содержание продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови у коров 50
2.2.1.3 Содержание антиоксидантов в плазме крови у коров 54
2.2.1.4 Активность ферментов в плазме крови у коров 62
2.2.1.5 Содержание продуктов перекисного окисления липидов в молоке у коров 66
2.2.1.6 Содержание -токоферола в молоке у коров 71
2.2.1.7 Йодное число молочного жира 75
2.2.2 Вторая серия опытов. Влияние перекисного окисления липидов на дисперсное состояние молочного жира 77
2.2.2.1 Молочная продуктивность коров 77
2.2.2.2 Содержание продуктов перекисного окисления липидов в молоке у коров 79
2.2.2.3 Дисперсное состояние молочного жира
3. Заключение 90
4. Выводы 95
5. Практические предложения 97
6. Сокращения, принятые в работе 98
7. Библиографический список 99
- Антиоксидантная система организма
- Влияние различных факторов на процесс перекисного окисления липидов и антиоксидантную защиту
- Вторая серия опытов. Исследование влияния перекисного окисления липидов на дисперсность молочного жира у коров
- Йодное число молочного жира
Антиоксидантная система организма
Как и всякая цепная реакция, перекисное окисление липидов протекает в три стадии: первая – запуск цепи, вторая – разветвление цепи, третья – обрыв цепи. В первую стадию АФК взаимодействуют с жирными кислотами с образованием жирнокислотных радикалов (Храпова Н. Г., 1982): R–H + OH R + H2O На этой стадии образуются в основном диеновые конъюгаты (ДК), то есть вещества с сопряжёнными двойными связями, т.к. по мере протекания реакции атомы водорода отделяются от углеродных цепей жирной кислоты. Легче всего атом водорода отрывается от углерода, находящегося в молекуле жирной кислоты в -положении (Журавлёв А. И., 1964, 1982). Часть жирных кислот окисляется до диенов с несопряжёнными двойными связями (неконъюгированных диенов) (Козлов Ю. П., 1976).
Во вторую стадию жирнокислотные радикалы взаимодействуют с молекулярным кислородом с образованием перекисных радикалов жирных кислот. Перекиси жирных кислот могут снова распадаться на свободные радикалы, которые будут продолжать цепную реакцию: R + О2 R–О-О R–О-О + R–H R + R–О-О-Н R–О-О-Н R–О + OH В третью стадию свободные радикалы объединяются между собой, образуя молекулы: R + R R – R R–О-О + R R–О-О-R Химические реакции ПОЛ заканчиваются образованием различных соединений, главным образом, малонового диальдегида (МДА). Поэтому именно его содержание в крови, плазме или моче обычно используют в качестве показателя конечных стадий перекисного окисления липидов в организме (Draper H. H. et al., 1984).
Около 10 % МДА выводится из организма с мочой (Draper H. H. et al., 1986). Основная его часть окисляется в печени до уксусной кислоты, а последняя, уже во внепечёночных тканях – до углекислого газа и воды. Также МДА может взаимодействовать с аминогруппами белков и аминокислот, образуя Шиффовы основания, в частности, липофусцин (токсин старения) (Барабой В. А., 1993). При пере-кисном окислении ненасыщенных жирных кислот образуются и предельные углеводороды, в основном пентан. Определение его содержания в выдыхаемом воздухе можно применять для оценки уровня ПОЛ в организме (Tappel A. L. et al., 1981; Прилипко Л. Л. и др., 1982).
Реакции свободнорадикального окисления липидов в метаболизме живых организмов могут играть как положительную, так и отрицательную роль. В первую очередь свободные радикалы влияют на структуру биологических мембран.
Учёными установлено, что ферменты, которые находятся в мембранах митохондрий, содержат много железа, которое является инициатором ПОЛ. Вот почему процессы ПОЛ в митохондриях идут наиболее интенсивно (Джафаров А. И. и др., 1985; Кожевников Ю. Н., 1985).
Можно предположить, что продукты ПОЛ из митохондрий генерируют аналогичные реакции в других органеллах и в плазматических мембранах (Джафаров А. И., 1981).
Также известно, что в результате перекисного окисления жирных кислот молекулы мембранных фосфолипидов, входящих в их состав, меняют свою форму с цилиндрической на коническую. В результате этого меняется и структура самих мембран (Кармолиев Р. Х., 2002). Это изменение может оказывать положительное действие, если процессы ПОЛ протекают не слишком интенсивно. В небольших количествах продукты свободнорадикального окисления необходимы для обновления клеточных мембран (Плужников М. С. и др., 1991), для регуляции их проницаемости (Кожевников Ю. Н., 1985), для нормального функционирования митохондрий (Владимиров Ю. А. и др., 1975) и для передачи нервных импульсов по нейронам (Абанькин В. П., 1986). С другой стороны, при усиленном образовании продуктов ПОЛ повышается проницаемость биологических мембран и нарушается работа мембраносвязанных рецепторов и ферментов (Halliwell B., Gutteridge J. М. С., 1986).
Разными авторами насчитывается всего около 240 ферментов, подавляемых продуктами ПОЛ (Матюшин Б. Н., Логинов А. С., 1996). В результате ингибиро-вания этих ферментов нарушаются многие биохимические процессы, например такие, как цикл трикарбоновых кислот.
Химические реакции свободнорадикального окисления не ограничиваются действием только на биологические мембраны. Его продукты также необходимы для синтеза прогестерона (Кожевников Ю. Н., 1985), простагландинов, тромбок-санов и лейкотриенов (Плужников М. С. и др., 1991). Кроме того, они ингибируют деление клетки, а следовательно, регулируют скорость митоза и препятствуют росту опухолей (Журавлёв А. И., Пантюшенко В. Т., 1989). С другой стороны, во время деления клетки перекись водорода разрывает связь между дочерними клетками и, таким образом, способствует завершению митоза (Сторожук П. Г. и др., 1997). Активные формы кислорода участвуют в процессе апоптоза, т.е. запрограммированной смерти клеток в организме (Пескин А. В., 1987).
Свободные радикалы также разрушают ксенобиотики, попавшие в организм (Барабой В. А., 1989) и играют важную роль в процессах фагоцитоза (Сафронова В. Г. и др., 2001).
Противоположно этому, перекиси и гидроперекиси обладают токсическим действием по отношению к клеткам, в которых содержатся. Т.к. эти вещества легко полимеризуются, а полимеры не окисляются с помощью ферментов, они образуют в клетке включения, которые мешают нормальному обмену веществ (Журавлёв А. И., 1975).
Влияние различных факторов на процесс перекисного окисления липидов и антиоксидантную защиту
Содержание диеновых конъюгатов в плазме крови и молоке определяли спектрофотометрическим методом. Пробы для анализа готовили следующим образом. Вначале липиды экстрагировали из субстрата (плазмы или молока) смесью полярного растворителя (изопропанола) и неполярного (гептана), а затем при помощи спектрофотометра измеряли концентрацию диеновых конъюгатов в экстракте (Гаврилов В. Б., Мишкорудная М. И., 1983).
Содержание малонового диальдегида в плазме и молоке определяли по цветной реакции его с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Данная реакция может протекать только в кислой среде при температуре кипения воды. После охлаждения реакционной смеси добавляли бутиловый спирт для экстрагирования продуктов реакции, а затем измеряли оптическую плотность экстрактов на спектрофотометре (Андреева Л. И. и др., 1988).
Концентрацию -токоферола в плазме крови и молоке определяли спек-трофотометрическим методом. Вначале к субстрату добавляли этиловый спирт (полярный растворитель) - для разрушения липопротеидных комплексов, а затем гексан (неполярный растворитель) - для экстракции токоферола. Содержание токоферола в полученном экстракте определяли на спектрофотометре при длине волны 297 нм, т. к. установлено, что именно при этой длине волны растворённый в насыщенных углеводородах -токоферол даёт максимум поглощения ультрафиолетовых лучей (Дудин В. И., 2004). При определении концентрации малонового диальдегида, диеновых конъю-гатов и -токоферола в плазме крови и молоке оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре «Apel PD-303 UV».
Активность каталазы в плазме крови определяли по снижению количества перекиси водорода при реакции с плазмой крови. Содержание перекиси вычисляли по цветной реакции с молибдатом аммония, который добавляли после реакции её с плазмой (Королюк М. А. и др., 1988).
Активность церулоплазмина в плазме крови определяли по реакции окисления под его действием солянокислого пара-фенилендиамина с образованием окрашенных продуктов. Затем известные количества пара-фенилендиамина полностью окисляли бихроматом калия с образованием тех же продуктов, по результатам чего строили калибровочный график (Кальницкий Б. Д. и др., 1988). Активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в плазме крови определяли динитрофенилгидразиновым методом (Райтмана-Френкеля). Продуктами реакции переаминирования, происходящего под действием данных ферментов, являются щавелевоуксусная и пировиноградная кислоты. Оксалоацетат в процессе ферментативной реакции способен превращаться в пи-руват. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде, которую обеспечивает гидроксид натрия, образуется окрашенный гидразин пировиноград-ной кислоты, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству образовавшегося пирувата (Кондрахин И. П. и др., 2004).
Активность креатинкиназы в плазме крови определяли с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. Продуктом реакции является креатин, количество которого, пропорциональное активности фермента, определяли по цветной реакции с -нафтолом (Кондрахин И. П. и др., 2004).
При определении активности каталазы, церулоплазмина, аспартатами-нотрансферазы, аланинаминотрансферазы и креатинкиназы в плазме крови использовали автоматический биохимический анализатор «Chemwell». биохимическом анализаторе «Chemwell» Методика определения перекисного числа молочного жира основана на выделении перекисями йода из йодистого калия. Продукт реакции затем титровали раствором тиосульфата натрия в кислой среде (Инихов Г. С.,1970).
Методика определения йодного числа также основана на йодометриче-ском титровании. Йод выделяли из спиртового раствора перекисями, содержащимися в молочном жире, а затем титровали раствором тиосульфата натрия (Шевченко В. В., 2009).
Количество и размер молочных жировых шариков определяли с помощью камеры Горяева. Молоко, разведенное дистиллированной водой в 25 раз, заправляли в камеру и фотографировали с помощью микроскопа с объективом 40 и окуляром 15. На полученных снимках подсчитывали общее количество молочных жировых шариков, определяли их диаметр и распределяли по 10-ти классам в зависимости от диаметра. Для этого на сетку камеры накладывали окулярную линейку и подсчитывали количество шариков с диаметром 1,00 мкм и менее (1-й класс), от 1,01 до 2,00 мкм (2-й класс), от 2,01 до 3,00 мкм (3-й класс), от 3,01 до 4,00 мкм (4-й класс), от 4,01 до 5,00 мкм (5-й класс), от 5,01 до 6,00 мкм (6-й класс), от 6,01 до 7,00 мкм (7-й класс), от 7,01 до 8,00 мкм (8-й класс), от 8,01 до 9,00 мкм (9-й класс), от 9,01 и более (10-й класс). По этим данным определяли средний диаметр шарика и соотношение мелкой, средней и крупной фракций шариков. К мелким относили шарики диаметром до 2,00 мкм, к средним – от 2,01 до 3,00 мкм, к крупным - свыше 3,00 мкм (Алексеева Н. Ю., 1986).
Вторая серия опытов. Исследование влияния перекисного окисления липидов на дисперсность молочного жира у коров
Разницу между группами на 3-м и 4-м месяцах лактации можно объяснить тем, что ненасыщенные жирные кислоты поступают в молочную железу только из жировой ткани при мобилизации резервов жира. Олеиновая кислота образуется в молочной железе из стеариновой, но источник последней – также тканевые резервы организма. У высокопродуктивных коров, особенно в начале лактации, эти процессы идут интенсивнее (Алиев А. А., 1980).
Вот почему у коров 1-й группы на 3-м и 4-м месяцах лактации содержание ненасыщенных жирных кислот в молочном жире было более высоким, чем у животных 2-й группы, а затем снизилось. У коров же 2-й группы изменения йодного числа не имели закономерного характера. Но у всех животных не отмечено какой-либо связи между динамикой йодного числа и показателями ПОЛ.
Можно было предположить, что при усилении ПОЛ йодное число будет снижаться, поскольку именно ненасыщенные жирные кислоты в первую очередь подвержены воздействию свободных радикалов. Наши же результаты свидетельствуют о том, что йодное число молочного жира зависит не от интенсивности ПОЛ в организме коров, а от поступления в молочную железу ненасыщенных жирных кислот из жировой ткани и от уровня десатурации стеариновой кислоты, также мобилизуемой из тканевых резервов.
Данные о концентрации продуктов ПОЛ в молоке (табл. 18) показывают, что содержание всех продуктов ПОЛ в молоке на первом месяце лактации было относительно высоким, что согласуется с литературными данными (Венцова И. Ю., 2011). Известно, что у коров в это время в организме преобладают процессы катаболизма, что может провоцировать усиление ПОЛ.
Перекисное число молочного жира, то есть содержание в нём перекисей ли-пидов, на 2-м месяце лактации уменьшилось на 39,2 %, на 3-м повысилось на 45,2 % и на 4-м снова снизилось на 22, 0 %. Уровень ДК на 2-м и 3-м месяцах лактации был ниже, чем на 1-м на 39,4% и на 41,0%, соответственно. На 4-м месяце величина этого показателя статистически значимо повысилась и приблизилась к исходному значению. Таблица 18 - Содержание продуктов перекисного окисления липидов в молоке у коров во 2-й серии опытов
Диеновыеконъюгаты,усл. ед.1 Перекисное числомолочного жира,ммоль/кг Малоновыйдиальдегид,мкмоль/л 1-й месяц лактации 1144,6±93,5 6,18±0,30 7,68±0,40 2-й месяц лактации 693,2±77,4 3,76±0,01 6,44±0,26 3-й месяц лактации 675,3±97,5 5,46±0,22 12,71±0,84 4-й месяц лактации 1078,4±118,5 4,26±0,07 9,29±0,59 [ женная на 1000. - Р 0,01, - Р 0,001 при сравнении с предыдущим месяцем лактации. Рисунок 29 - Относительная динамика содержания диеновых конъюгатов в молоке у коров во 2-й серии опытов (величина показателя на 1-м месяце лактации принята за 100 %) Рисунок 30 - Относительная динамика содержания перекисей липидов в молочном жире у коров во 2-й серии опытов (величина показателя на 1-м месяце лактации принята за 100 %) Рисунок 31 - Относительная динамика содержания малонового диальдегида в молоке у коров во 2-й серии опытов (величина показателя на 1-м месяце лактации принята за 100 %) Динамика содержания МДА в молоке имела примерно ту же направленность, что и динамика перекисного числа, но на 4-м месяце лактации по сравнению с 1-м перекисное число было ниже на 31,1 % (Р 0,001), а содержание МДА в молоке, наоборот, выше на 20,1% (Р 0,05).
Таким образом, на 1-м месяце лактации в молочной железе у коров и в жировых шариках наиболее активно протекали реакции первичных и вторичных стадий ПОЛ - образование ДК и перекисей. На 2-м месяце активность всех стадий ПОЛ уменьшилась. На 3-м месяце она опять возросла, причём особенно усилилось окисление ДК до перекисей, а перекисей - до МДА. На 4-м месяце продукция ДК возросла, но интенсивность вторичных стадий ПОЛ (образования перекисей и МДА) заметно снизилась. Также отмечено, что окисление перекисей до МДА в ходе опыта имело некоторую тенденцию к усилению.
Согласно литературным данным, в первый месяц лактации происходит усиление ПОЛ, обусловленное послеродовым стрессом (Степанова И. П. и др., 2005). Это вызвано тем, что в период раздоя в организме коров преобладают процессы катаболизма. При этом мобилизация тканевых резервов жира способствует увеличению пула ненасыщенных жирных кислот, наиболее подверженных перекисному окислению (Алиев А. А., 1980).
Усиление ПОЛ на третьем месяце лактации было связано с начавшейся инволюцией секреторного эпителия в молочной железе у коров, в которой важную роль играют процессы аутофагоцитоза (Медведев И. К., 1993), а они сопровождаются повышенной интенсивностью ПОЛ (Maranon et al., 2008). Первая серия опытов показала, что с 3-го по 5-й месяцы содержание продуктов ПОЛ в плазме крови у коров было повышено. Наибольшее же усиление ПОЛ отмечалось на 4-м месяце лактации и сопровождалось резким повышением уровня ДК в молоке.
Йодное число молочного жира
Динамика содержания продуктов ПОЛ и в плазме, и в молоке у коров обеих групп была примерно одинаковой. Следовательно, найденные нами закономерности характерны для коров как высокой, так и низкой продуктивности.
Содержание -токоферола в молоке у коров на 4-м месяце лактации было несколько ниже, чем на 3-м, на 5-м месяце резко возросло, а на 6-м столь же резко уменьшилось.
Коэффициент корреляции между содержанием -токоферола в плазме и молоке составил: на 3-м месяце лактации -0,03, на 4-м +0,525 (Р 0,05), на 5-м -0,21, на 6-м -0,620 (Р 0,05). Таким образом, между уровнями -токоферола в плазме и молоке положительная связь наблюдалась на 4-м месяце лактации, когда уровень его в молоке был ниже, чем в плазме, а отрицательная на 6-м, когда, напротив, содержание -токоферола в плазме было значительно ниже, чем в молоке. В остальное время она почти отсутствовала.
Обычно токоферол переносится из крови в молоко способом активного транспорта против градиента концентрации. Для этого в мембранах клеток секреторного эпителия молочной железы есть специфические белки-рецепторы. Поступление витамина Е из крови в молоко в этом случае зависит не только от уровня витамина Е в плазме, но также от количества и связывающей способности рецепторов. Вот почему на 3-м, 5-м и 6-м месяцах лактации между концентрацией -токоферола в плазме и в молоке не было прямой корреляции. Но на 4-м месяце лактации из-за усиления ПОЛ структура мембран в железистом эпителии была нарушена, и они были разрыхлены. Вследствие этого, во первых, снизилась секреторная активность молочной железы и уменьшилась молочная продуктивность, а во вторых, уменьшилось количество рецепторов токоферола и нарушилась их структура, что и затруднило его активный транспорт из крови в молоко. Вероятнее всего, на 4-м месяце лактации токоферол попадал в молоко с помощью неспецифических механизмов, поэтому его содержание в молоке было ниже, чем в плазме, и напрямую зависело от последнего. Разрыхление мембран облегчило пассивный перенос токоферола в клетки молочной железы. Усиление же ПОЛ в молочной железе было вызвано усилением аутофагоцитоза, которое обычно имеет место в начале инволюции молочной железы и приводит к затуханию лактации. Мобилизация тканевых резервов токоферола (наиболее активная у высокоудойных коров) способствовала последующему уменьшению активности ПОЛ, восстановлению структуры клеточных мембран в молочной железе, а значит, и механизмов активного транспорта витамина Е в молоко. Оно завершилось только на 6-м месяце лактации, когда интенсивность ПОЛ снизилась.
Йодное число молочного жира на протяжении всей первой серии опыта в обеих группах изменялось без видимой закономерности. У всех животных не отмечено какой-либо связи между динамикой йодного числа и показателями ПОЛ.
Во второй серии опытов мы брали пробы молока у 10 коров 3-4-летнего возраста, в том числе 2 первотёлки и 8 коров 2-й лактации со средним удоем 5251 ± 280 кг за предыдущую лактацию. Результаты исследований второй серии опытов свидетельствуют о том, что наименьший средний диаметр молочных жировых шариков и наибольшее содержание их мелкой фракции было отмечено на 1-м месяце лактации, когда в молоке содержалось много ДК и перекисей. Эти вещества, как известно, вследствие своего детергентного эффекта могут уменьшать поверхностное натяжение биологических мембран, что способствует уменьшению размера молочных жировых шариков и переходу части молочного жира в нестабильное состояние, то есть в частицы, не покрытые мембраной. В этом случае молоко наименее пригодно для сепарирования сливок и сбивания масла. Наибольший средний диаметр молочных жировых шариков и наибольшее содержание их крупной фракции отмечено на 2-м месяце лактации, при низкой интенсивности всех стадий ПОЛ. На 3-м и 4-м месяцах лактации интенсивность ПОЛ несколько увеличилась, что сопровождалось небольшим измельчением жировых шариков, но не достигающим уровня 1-го месяца лактации.
При анализе корреляционной связи по объединённым данным (n=40) выявлены три отрицательные корреляции между уровнем ДК в молоке и долей крупных жировых шариков (r= -0,38; Р 0,01), между уровнем ДК в молоке и средним диаметром молочного жирового шарика (n=40, r= -0,26; Р 0,01) и между пере-кисным числом молочного жира и средним диаметром молочного жирового шарика (n=4, r= -0,83; Р 0,01) и одна положительная корреляция между перекис-ным числом молочного жира и долей мелких жировых шариков (n=4, r= +0,76; Р 0,02).
Полученные данные позволяют предположить, что при повышенном уровне ДК и перекисей липидов в молочной железе, а, следовательно, и в молоке, нарушается структура апикальной мембраны, которая обволакивает шарики в процессе их экструзии в полость альвеол. При этом текучесть мембран снижается, вследствие чего жировые шарики измельчаются, т. е. возрастает доля мелких шариков и снижается доля крупных. Полагаем, что сильнее всего шарики измельчаются под действием ДК в сочетании с перекисями, как это было на 1-м месяце лактации. ДК или перекиси в отдельности также способствуют дроблению жировых шариков, но не настолько сильно, как это было видно на 3-м и 4-м месяцах лактации.
Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что высокое содержание в молоке продуктов перекисного окисления липидов (особенно диеновых конъю-гатов и перекисей липидов) приводит к измельчению молочных жировых шариков за счёт уменьшения поверхностного натяжения в мембранах этих шариков. Наиболее сильно этот эффект выражен при одновременном повышении содержания диеновых конъюгатов и перекисей в молоке.