Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 13
1.1.1. Локализация и тканевые (физиологические) ниши ММСК 13
1.1.2. Особенности ММСК, культивируемых при разном содержании
1.1.2.1. Жизнеспособность 15
1.1.2.2. Иммунофенотип и морфология 16
1.1.2.3. Пролиферация 17
1.1.2.4. Дифференцировка 18
1.1.2.5. Энергетический метаболизм 19
1.2. Влияние окислительного стресса на свойства ММСК 20
1.2.1. Моделирование окислительного стресса in vitro 21
1.2.2. Механизмы действия АФК 23
1.2.3. Антиоксидантная система защиты клетки 28
1.2.4. Механизмы поддержания устойчивости ММСК к окислительному стрессу 32
1.3. Роль HIF в функционировании ММСК, культивируемых при разном содержании О 2 33
2. Материалы и методы 36
2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы 36
2.2 Приготовление сред для культивирования ММСК
2.2.2 Приготовление ростовой среды 38
2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток 38
2.3 Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека 38
2.3.1 Получение первичных культур ММСК и их дальнейшее культивирование 38
2.3.2 Культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода 39
2.3.3 Криоконсервация культивируемых ММСК
3 2.4 Моделирование окислительного стресса с помощью перекиси водорода 40
2.5 Приготовление лизатов ММСК для оценки ферментативной активности 40
2.6 Характеристика ММСК из жировой ткани человека
2.6.1 Оценка жизнеспособности клеток 40
2.6.2 Функционирование прооксидантной системы клеток
2.6.2.1 Содержание в клетках активных форм кислорода 41
2.6.2.2 Содержание в ММСК ТБК-активных продуктов 42
2.6.3 Функционирование антиоксидантной системы ММСК
2.6.3.1 Определение активности каталазы 42
2.6.3.2 Определение активности супероксиддисмутазы 42
2.6.3.3 Определение активности глутатионпероксидазы 43
2.6.4 Оценка функционального состояния митохондрий ММСК
2.6.4.1 Выявление митохондрий и характеристика их трансмембранного потенциала 43
2.6.4.2 Оценка интенсивности дыхания ММСК 44
2.6.4.3 Определение уровня АТФ 44
2.7 Определение уровня экспрессии генов в ММСК 45
2.7.1 Выделение тотальной РНК, обратная транскрипция 45
2.7.2 Определение уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией и окислительным стрессом 46
2.7.3 Определение уровня экспрессии генов HIFla и HIF3a 46
2.8 Статистическая обработка результатов 47
3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Характеристика ММСК при культивировании в условиях различного содержания кислорода (20%, 5%, 1%) 48
3.1.1. Жизнеспособность 48
3.1.2. Активность прооксидантной системы
3.1.2.1. Содержание АФК 49
3.1.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 53
3.1.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 54
3.1.4. Функциональное состояние митохондрий ММСК 55
3.1.4.1 Характеристика трансмембранного потенциала 5 5
3.1.4.2 Интенсивность дыхания 57
3.1.4.3 Уровень АТФ 59
3.1.5. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов 61
3.2. Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода 67
3.2.1. Жизнеспособность 67
3.2.2. Активность прооксидантной системы
3.2.2.1. Содержание АФК 68
3.2.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 70
3.2.3. Функционирование антиоксидантной системы.
Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 72
3.2.4. Функциональное состояние митохондрий 76
3.2 4.1. Характеристика трансмембранного потенциала 76
3.2.4.2 Интенсивность дыхания 79
3.2.5. Экспрессия генов HIF-la и HIF-3a 82
3.2.6. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов 85
3.3. Влияние Н202 на ММСК
3.3.1. Жизнеспособность 87
3.3.2. Активность прооксидантной системы
3.3.2.1. Содержание АФК 89
3.3.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 90
3.3.3. Функционирование антиоксидантной системы.
Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 91
3.3.4. Экспрессия генов, связанных с окислительным стрессом 93
Заключение 96
Выводы 98
Список литературы
- Иммунофенотип и морфология
- Моделирование окислительного стресса in vitro
- Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека
- Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода
Введение к работе
Актуальность проблемы
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) или мезенхимальные стволовые клетки вызывают интерес исследователей с момента их открытия А.Я. Фриденштейном как колониеобразующих единиц фибробластов (Фриденштейн, 1970; Fndenstein, Gorskaja, Kalugina, 1976; Fndenstein, Chailakhjan, Lalikina, 1976). В ходе многочисленных работ было показано, что ММСК присутствуют в организме в качестве тканевого резерва, участвуя в физиологической и репаративной регенерации путем дифференцировки в различные типы клеток мезенхимального происхождения и выработки паракринных факторов, которые способствуют повышению выживаемости поврежденных клеток и активации резидентных прогениторов (Pittenger, Martin, 2004; Dazzi, Ramasamy, Glennie et al., 2006; Буравкова, Андреева, Григорьев, 2012; Wei, Yang, Han, 2013; Buravkova, Andreeva, Gogvadze et. al., 2014). По последним данным клетки со свойствами ММСК могут быть выделены практически из всех органов и тканей, при этом различия между ними невелики (Kolf, Cho, Tuan, 2007; Май, Hindocha, Май et al., 2011).
Показано, что ММСК являются перспективным инструментом, применимым в регенеративной медицине при лечении заболеваний, связанных с нарушением кровообращения (Al-Khaldi, Al-Sabti, Galipeau et al., 2003; Pittenger, Martin, 2004; Iwase, Nagayaa, Fujii et al., 2005; Nakagami, Maeda, Morishita et al., 2005; Moon, Kim, Kim et al., 2006). Однако эффективность применения клеточной терапии в данном случае зависит от устойчивости клеток к повреждающим воздействиям, среди которых важную роль отводят окислительному стрессу. Известно, что устойчивость клеток к окислительному стрессу определяется большим числом факторов, в том числе содержанием кислорода в среде при культивировании in vitro (Theus, Wei, Cui et al., 2008; Peterson, Aly, Lerman et al., 2011).
Традиционно ММСК культивируют в СОг-инкубаторах, где уровень углекислого газа приближен к тканевому (5%), а содержание кислорода соответствует таковому в воздухе (20%), что многократно превышает значения in vivo. Несмотря на это, такие условия обозначают как нормоксические, а снижение содержания кислорода, в том числе до физиологических значений, называют гипоксией. Показано, что в условиях содержания Ог, близких к физиологическим (4-7%) (Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007; Гринаковская, Андреева, Буравкова и др., 2009; Pattappa, Heywood, de Bruijn et al., 2011), и при его значительном снижении (до 1%) клетки поддерживаются в менее коммитированном состоянии (Basciano, Nemos, Foliguet, 2011). В то же время культивирование при 1% Ог повышает пролиферативную активность (Weijers, Van Den Broek, Waaijman et al., 2011; Рылова, Буравкова, 2013). До сих пор нет единого мнения о том, какую концентрацию
кислорода необходимо использовать при культивировании ММСК (Mohyeldin, Garzon-Muvdi, Quinones-Hinojosa, 2010; Beegle, Lakatos, Kalomoiris et al., 2015).
Особого внимания требует изучение влияния содержания кислорода на функционирование ММСК в условиях окислительного стресса. Перспектива применения ММСК при лечении заболеваний, сопровождающихся ишемией и гипоксией, обусловливает необходимость проведения исследований, посвященных устойчивости ММСК к окислительному стрессу и оптимизации условий культивирования.
Цель и задачи исследования
Цель работы: оценка показателей окислительного стресса и энергетического метаболизма в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (ММСК) из жировой ткани человека при культивировании в среде с различным содержанием кислорода.
Задачи:
1. Исследование устойчивости ММСК к окислительному стрессу при различном
содержании кислорода в среде культивирования.
-
Изучение про- и антиоксидантной активности ММСК при культивировании в условиях 20%, 5% и 1% Ог и его кратковременном изменении.
-
Исследование влияния парциального напряжения кислорода в среде культивирования на функциональное состояние митохондрий ММСК.
-
Анализ уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией, в ММСК при культивировании в среде с содержанием кислорода от 20% до 1%.
-
Определение динамики уровня экспрессии генов а-субъединиц транскрипционных факторов семейства ИГР в ММСК при постоянном культивировании в среде с 20%, 5% и 1% кислорода и его кратковременном изменении.
Научная новизна
Получены новые данные, свидетельствующие о меньшей активности ферментов антиоксидантной защиты и концентрации ТБК-активных продуктов в культивируемых ММСК при 5% кислорода по сравнению с 20% и 1% Ог.
Впервые показано, что ММСК, постоянно культивируемые при повышенном (20%) и пониженном (1%) содержании кислорода более устойчивы к моделируемому окислительному стрессу (Н2О2) по сравнению с клетками, культивируемыми в условиях, близких к тканевым (5% Ог).
Впервые продемонстрировано, что увеличение экспрессии гена HIF-la в ММСК происходит на ранних этапах снижения содержания Ог, а продолжительность его зависит от степени выраженности гипоксии. Дальнейшее уменьшение содержания мРНК HIF-la сопровождается ростом экспрессии геиа HIF-3a.
Получены новые данные, свидетельствующие о снижении количества потребляемого кислорода, трансмембранного потенциала митохондрий, синтеза АТФ, а также активации гликолиза в ММСК при понижении уровня Ог, что сопровождается увеличением экспрессии генов переносчиков глюкозы SLC2A1, SLC2A4 и глюкозо-6-фосфат-изомеразы GPI.
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенное исследование позволило продемонстрировать влияние содержания кислорода в среде культивирования на редокс-статус ММСК, что имеет большое значение для развития фундаментальных и прикладных исследований в области регенеративной медицины.
Полученные в настоящей работе данные показали, что наименее повреждающее действие на культивируемые ММСК оказывает среда с содержанием кислорода 5%, при этом устойчивость к окислительному стрессу возрастает при культивировании в условиях 20% и 1% 02.
Экспериментальные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов адаптации прогениторных клеток к гипоксии. ММСК быстро адаптируются к уменьшению содержания кислорода в среде: через 24 ч после снижения Ог наблюдается изменение экспрессии большинства генов, функционирующих в условиях гипоксии и участвующих в процессах пролиферации, гликолиза и апоптоза. Наиболее активно в ответ на снижение содержания кислорода изменяется экспрессия металлотионеинаМТЗ.
Положения, выносимые на защиту
-
ММСК, культивируемые при повышенном (20%) и пониженном (1%) содержании кислорода испытывают слабый окислительный стресс, который сопровождается увеличением активности антиоксидантной системы ММСК, следствием чего является повышение устойчивости клеток к моделируемому окислительному стрессу.
-
В ММСК при 5% и 1% кислорода происходит снижение функциональной активности митохондрий, что проявляется в снижении уровня потребления кислорода, величины трансмембранного потенциала и продукции АТФ, клетки поддерживают нормальный метаболизм и жизнеспособность за счет увеличения вклада гликолиза.
-
В ММСК увеличение экспрессии гена HIF-la происходит только на ранних этапах снижения содержания Ог, а его продолжительность зависит от степени выраженности воздействия. Дальнейшее уменьшение содержания мРНК HIF-la сопровождается ростом экспрессии renaHIF-За.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на XI, XII, XIII и XIV Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных Дню Космонавтики (Москва, 2012, 2013, 2014, 2015), III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), 7th Fraunhofer Life Science Symposium associated with the 7th Annual Congress of the German Society for Stem Cell Research (GSZ) (Leipzig, Germany, 2012), VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвященной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013), V Всероссийской научно-практическая конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), 9th Fraunhofer Life Science Symposium (Leipzig, Germany, 2014), Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society EU (Genova, Italy, 2014).
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 7 статей в журналах из перечня ВАК РФ.
Работа выполнена при поддержке программы Отделения физиологии РАН и гранта РФФИ № 14-04-32267 мол_а.
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН, протокол № 5 от 19 мая 2015 г.
Структура и объем диссертации
Иммунофенотип и морфология
Несмотря на многочисленные попытки, до сих пор не было найдено специфического маркера, который позволил бы однозначно идентифицировать ММСК. Анализ принятого в настоящее время сочетания поверхностных молекул, наличие или отсутствие которых характеризует данный тип клеток (Dominici, Le Blanc, Mueller, 2006), не выявил зависимости от содержания кислорода в среде культивирования. Так, было показано, что при 20% и 5% ( культуры ММСК из жировой ткани человека не различались по количеству клеток, несущих специфичные маркеры стромальных предшественников (CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин), при этом в обоих случаях не были обнаружены клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндотелия и гемапоэтических клеток-предшественников (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit) и HLA-DR) (Буравкова, Гринаковская, Андреева, 2009). Не обнаружено различий в экспрессии CD90, CD73, CD54, CD105, CDllb, CD34 и при культивировании аналогичных клеток в условиях 20%, 5% и 1% ( (Рылова, Андреева, Гогвадзе и др. 2012). В экспериментах Choi, Pingguan-Murphy, Wan Abas et al. (2014) при 21% и 2% Ог не различалось количество ММСК из жировой ткани человека, на поверхности которых присутствовали CD 105, CD90, CD73 и не были обнаружены CD45, CD34, CD19, CD14 и HLA-DRDPDQ.
В то же время выявлено, что культивирование при разном содержании кислорода приводит к значительным морфологическим изменениям ММСК. Наблюдения за клетками в условиях 20%, 5%, 3% и 1% Ог в течение 4 пассажей показали наличие высокой гетерогенности культуры при атмосферном содержании кислорода на ранних этапах, сменяющееся возрастанием количества крупных распластанных клеток и уменьшением доли фибробластоподобных ММСК. В условиях, наиболее приближенных к физиологическим (3-5% Ог), в культуре преобладали клетки классической веретеновидной формы (60-100 мкм), т.е. гетерогенность популяции снижалась и поддерживалась на протяжении всего исследования. При 1% ( на ранних пассажах обнаруживались клетки небольшого размера (40-60 мкм), однако далее они стали заменяться на крупные и распластанные, характерные для культур при 20% Ог. Авторы связывают увеличение гетерогенности культуры, проявляющееся в появлении крупных распластанных клеток, с повреждающим действием завышенного и заниженного (по отношению к физиологическому) содержания Ог (Рылова, Буравкова, 2013). 1.1.2.3. Пролиферация
В настоящее время в связи с применением ММСК в клеточной терапии большое количество работ посвящено оптимизации наращивания клеточной массы в условиях in vitro. При этом большое внимание уделяется протоколам с использованием пониженного содержания кислорода, поскольку при их применении многими исследователями была отмечена активация пролиферации по сравнению с клетками при 20% 02. Так, Fehrer, Brunauer, Laschober et al. (2007) зафиксировали значительное увеличение числа удвоений популяции ММСК из костного мозга при длительном культивировании (100 суток) в условиях 3% Ог. Choi, Pingguan-Murphy, Wan Abas et al. (2014) показали, что количество клеток при 2% ( достоверно превышает таковое при атмосферном содержании кислорода, начиная с 7 суток культивирования. При этом авторы отметили снижение времени удвоения популяции при пониженном содержании Ог более, чем в 2 раза. В работе по исследованию пролиферации ММСК из жировой ткани при 5%, 3% и 1% Ог отмечалось, что в течение первого пассажа пролиферативная активность клеток не изменилась по сравнению с таковыми в 20% (. Дальнейшее культивирование в течение второго пассажа активировало пролиферацию ММСК при 5%, 3%, 1% Ог и снижало в условиях 20% Ог. При этом наблюдалось сокращение времени лаг-фазы кривой роста культуры при всех вариантах пониженного содержания кислорода. Далее во всех клетках наблюдалось постепенное снижение пролиферативной активности, максимально низким время удвоения популяции было при содержании Ог, наиболее близком к физиологическому (5%), тем не менее скорость деления клеток при 3% и 1% Ог превышала таковую в условиях 20% Ог более чем в 2 раза (Рылова, Буравкова, 2013). В обзоре Csete (2005) также отмечается, что практически все стволовые клетки пролиферируют быстрее в условиях пониженного (близкого к физиологическому), но не критического содержания Ог.
Стоит отметить, что в среде с 5% Ог не обнаружено увеличения активности теломеразы, вследствии чего авторы предполагают, что активация пролиферации при пониженном содержании кислорода не является результатом трансформации клеток. Было обнаружено увеличение уровня экспрессии генов, отвечающих за вступление клеток в клеточный цикл и позитивно регулирующих пролиферацию (FOSB, FOSL1, PCNA, CCND2, CKS2, CDKN2C) (Рылова, Буравкова, 2013). В исследовании Lee, Xia, Kim et al. (2009) отмечается, что увеличение интенсивности деления ММСК из жировой ткани при снижении содержания кислорода может быть опосредовано интенсификацией синтеза таких ростовых факторов, как VEGF и bFGF, находящихся под контролем HIF.
Способность к дифференцировке в различные типы клеток мезенхимального происхождения является одной из главных причин использования ММСК в регенеративной медицине. В ходе многочисленных экспериментов было показано, что содержание кислорода в среде культивирования, помимо воздействия на морфологию клеток и их пролиферацию, оказывает влияние и на этот параметр.
D Ippolito, Diabira, Howard (2006) продемонстрировали эффект ингибирования дифференцировки ММСК в остеогенном направлении при 3% Ог по сравнению с клетками в условиях атмосферного содержания кислорода. При этом в условиях пониженного содержания кислорода была обнаружена положительная регуляция экспрессии таких маркеров «стволовости» как Oct-4, REX-1 и hTeRT, которая поддерживалась даже в дифференцировочной среде. Salim, Nacamuli, Morgan et al. (2004) не обнаружили различий в способности к остеогенной дифференцировке между клетками при 21% и 2% Ог, однако, отметили ее снижение при кислородном голодании (0,02% (). В этих условиях было выявлено уменьшение уровня экспрессии транскрипционного фактора Runx2, необходимого ММСК для дифференцировки в остеобласты (Komori, 2010). По-видимому, это было опосредовано снижением уровня экспрессии ВМР2, который действует как активатор Runx2 через Smad сигнальный путь. Xu, Liu, Qu et al. (2013) отмечают возможность действия пониженного содержания кислорода через положительную регуляцию сигнального пути Notch и последующее ингибирование активности Runx2. Другие авторы также отмечают снижение дифференцировки ММСК в остеогенном направлении при низком содержании ( (Malladi, Xu, Chiou et al., 2006; Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007; Iida, Takeda-Kawaguchi, Tezuka et al., 2010).
Моделирование окислительного стресса in vitro
Для определения активности ферментов и содержания ТБК-активных продуктов из ММСК готовили лизаты с помощью M-PER Plus Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit. Клетки на чашках Петри дважды промывали PBS, и лизировали реагентом M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent с добавлением ингибиторов протеиназ Protease Inhibitor Coctail при 4С. В полученных лизатах методом Бредфорд определяли содержание белка.
Для приготовления реактива Бредфорд 5 мг кумасси G250 растворяли в 2,5 мл спирта, добавляли 5 мл ортофосфорной кислоты, доводили объем до 50 мл и фильтровали. Для проведения реакции брали клеточный лизат и реактив в соотношении 1:50, перемешивали пипетированием и измеряли оптическую плотность при 540 нм.
Жизнеспособность ММСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора Annexin V-FITC/PI согласно инструкции производителя. Аннексии V, меченый FITC, в присутствии ионов Са и Mg взаимодействует с фосфатидилсерином, который в норме находится во внутреннем слое фосфолипидного бислоя мембран клеток, а при апоптозе, когда клетка теряет способность поддерживать ассиметричность локализации мембранных фосфолипидов, перемещается во внешний монослой. Некротические клетки определяли за счет связывания с пропидия йодидом, который при необратимом повреждении клетки проходит через клеточную мембрану и взаимодействует с малой бороздкой ДНК.
Для проведения анализа жизнеспособности исследуемую культуру клеток (не менее 100 тысяч на пробу) дважды отмывали от среды культивирования PBS, открепляли от пластика раствором трипсин-ЭДТА, инактивировали трипсин двойным объемом полной среды, ресуспендировали клетки и переносили в пробирку для проточного цитофлуориметра. Далее клетки центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, удаляли супернатант и добавляли 100 мкл предварительно разведенного холодного связывающего буфера, 5 мкл пропидия йодида, 1 мкл аннексина. Пробы инкубировали 10 минут при 4С, затем в каждую добавляли 400 мкл однократного связывающего буфера, ресуспендировали и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Для детекции активных форм кислорода в ММСК использовали 2 7 -дихлорфлуоресцеин диацетат, который пассивно диффундирует через мембрану, внутри клетки при действии эстераз гидролизуется и окисляется внутриклеточными активными формами кислорода с образованием флуоресцирующего продукта, который может быть визуализирован.
Для окрашивания клеток H2DCFDA, растворенный в ДМСО, вносили в среду культивирования ММСК в конечной концентрации 20 цМ. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37С и в соответствующей газовой среде. Клетки дважды промывали PBS, снимали с чашек Петри раствором трипсин-ЭДТА, ингибировали трипсин избыточным количеством среды культивирования, клеточную суспензию переносили в пробирки, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Среду сливали, к осадку добавляли 400 мкл PBS, ресуспендировали и анализировали клетки на проточном цитофлуориметре. Количество АФК на клетку определяли по средней интенсивности флуоресценции. 2.6.2.2 Содержание в ММСК ТБК-активных продуктов
Для определения уровня ТБК-активных продуктов (Ко, Godin, 1990) в микропробирку с крышкой к 500 мкл клеточного лизата добавляли 300 мкл 20% раствора ТХУ и 500 мкл 0,5% раствора ТБК. В контрольной пробе клеточный лизат заменяли аналогичным объемом лизис-буфера. Смесь нагревали при 95 С в течение 30 минут с помощью термостата «Термит» (НПО ДНК-Технология, Россия), охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали в течение 5 минут при 12 000 g. Оптическую плотность опытных образцов измеряли при длинах волн 532 и 585 нм относительно контрольной пробы. Концентрацию ТБК-активных продуктов выражали в мкмоль МДА/мг белка, используя коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК (1,56 10 М" см" ).
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли с помощью методики Королюка, Ивановой, Майоровой (1988). Реакцию запускали добавлением 0,1 мл лизата ММСК к 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода. В холостой пробе лизат заменяли 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность развивающейся окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которую вместо перекиси водорода вносили 1 мл воды. Активность фермента выражали в мкМ НгОг/мин. на 1 мкг клеточного белка, используя
Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в неэнзиматической системе феназинметасульфата (ФМС) и НАДН (Матюшин, Логинов, Ткачев, 1991). Лизат ММСК вносили в количестве 10 мкл на 300 мл среды инкубации, состоящей из 0,1 М фосфатный буфера (рН 7,8), 0,33 мМ ЭДТА, 0,41 мМ НСТ, 0,01 мМ ФМС и 0,8 мМ НАДН. Реакцию запускали добавлением НАДН и регистрировали прирост оптической плотности за 5 мин. при длине волны 540 нм. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50%-го ингибирования восстановления НСТ. Расчет вели по формуле: E = (100 - E0 100 I Ek) I 50 мкг белка, где Eo и Ek - среднее значение прироста экстинции за 1 мин. в опытной и контрольной пробах соответственно. Активность СОД выражали в усл. ед. на 1 мкг белка.
Для определения активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) в две микропробирки вносили 25 мкл лизата и 25 мкл 31,88 мМ раствора восстановленного глутатиона. Полученную смесь инкубировали 5 мин при 37 С. Затем в опытную пробирку добавляли 5 мкл 13,8 мМ раствора Н2О2, встряхивали на вортексе и оставляли в термостате. Через 1 мин в контрольную и опытную пробы добавляли по 0,1 мл холодного 10% раствора ТХУ, после чего в контрольную пробирку добавляли 5 мкл 13,8 мМ раствора Н2О2. Обе пробирки встряхивали и помещали в холодильник на 10 мин, затем центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин и 4С. К 50 мкл надосадочной жидкости добавляли по 1 мл фосфатного буфера (рН 8,0), 5 мкл реактива Эллмана, тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность опытной пробы по сравнению с контрольной при 412 нм. Для определения скорости неферментативного окисления восстановленного глутатиона исследовали пробы, в которые вместо лизата добавляли аналогичный объем дистиллированной воды.
Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека
Показано, что одним из наиболее быстро реагирующих компонентов механизма клеточного ответа на гипоксию, обеспечивающим приспособление ММСК уже к небольшому снижению содержания кислорода в среде, является транскрипционный фактор HIF (hypoxia-inducible factor), представляющий собой гетеродимер, в состав которого входит одна из трех существующих изоформ а-субъединицы (HIF-Іа, HIF-2а или НГР-За) и Р-субъединица (HIF-ip). Мы не обнаружили отличий между экспрессией генов HIF-la и HIF-2a при стандартном (20% Ог) культивировании ММСК и снижении Ог в среде до 5%. Однако, постоянное культивирование при 1% Ог привело к повышенной в 4 раза экспрессии другой изоформы а-субъединицы этого транскрипционного фактора - HIF-За, при этом экспрессия HIF-la и HIF-2a несколько снижалась (в 1,47 и 2,41 раза соответственно).
Следует отметить, что транскрипционный фактор HIF не только выступает в роли сенсора тканевой гипоксии, но и координирует процесс адаптации клетки к пониженному содержанию кислорода, регулируя многие метаболические процессы. При этом его активация может не зависеть от напряжения кислорода (Dery, Michaud, Richard, 2005), а быть обусловленной плейотропным действием факторов роста и посттрансляционными модификациями (Lee, Вае, Jeong et al., 2004). Отсутствие повышенной экспрессии HIF-la в условиях длительного культивирования клеток при 5% Ог и понижение при 1% Ог, возможно, отражает адаптивные, необходимые для поддержания функционального статуса ММСК, уровни активности транскрипционного фактора, сформировавшиеся в результате баланса синтеза и деградации HIF-la на уровне белкового продукта, однако, этот вопрос требует дальнейших исследований.
Анализ экспрессии блока апоптоз-ассоциированных генов не выявил отличий от контроля в ММСК при культивировании в среде с содержанием кислорода 5%, а при 1% Ог было обнаружено снижение экспрессии индукторов апоптоза (ВАХ, DAPK3), что согласуется с данными о высоком уровне жизнеспособности клеток при достаточно низком содержании Ог.
В среде культивирования с пониженным содержанием кислорода в ММСК наблюдается увеличение экспрессии гена глюкозного транспортера 1 (SLC2A1), с чем, вероятно, связана стимуляция поглощения глюкозы клетками (Dos Santos, Andrade, Boura et al., 2010). Помимо этого при 5% Ог увеличивается экспрессия другой изоформы данного транспортера - SLC2A4, а в условиях 1% Ог возрастает экспрессия гена глюкозо-6-фосфат изомеразы, что хорошо согласуется выявленным переключением энергетического матаболизма с окислительного на гликолитический.
Нами было показано, что при пониженном содержании кислорода для ММСК, как и для некоторых других типов клеток (Yamasaki, Nomura, Sato et al., 2007), характерно увеличение экспрессии гена МТЗ, продукт которого вовлечен в процессы хелатирования металлов, клеточной пролиферации и апоптоза. Наиболее значительно (в 9,95 раза) количество мРНК МТЗ возрастало при культивировании клеток в условиях жесткой гипоксии (1% Ог). Особое внимание следует обратить на то, что при 1% Ог в ММСК в 2 раза повышается экспрессия гена VEGFA, продукт которого способствует пролиферации и оказывает антиапоптотическое действие, что делает ММСК применимыми в клеточной терапии (Pons, Huang, Arakawa-Hoyt et al., 2008). Помимо этого в данных условиях для ММСК показано увеличение экспрессии лептина. Как известно, лептин стимулирует пролиферацию, в том числе и стволовых клеток, и участвует в регуляции процессов дифференцировки и секреции цитокинов (Gainsford, Willson, Metcalf et al., 1996).
Таким образом, в условиях умеренной гипоксии (5% Ог) по уровню экспрессии исследуемых генов клетки незначительно отличаются от нормоксии (20% Ог), несмотря на выраженные изменения морфологии и пролиферативной активности (Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б., 2013). При культивировании в среде с низким содержанием Ог (1%) помимо изменения экспрессии генов, кодирующих проапоптотические белки, регуляторы метаболизма и пролиферации, повышается уровень экспрессии генов ряда паракринных факторов, благодаря чему ММСК могут более эффективно поддерживать жизнеспособность в условиях гипоксии и участвовать в регенеративных процессах.
При изучении краткосрочных эффектов изменения содержания кислорода в среде культивирования использовали как понижение процентного содержания кислорода в газовой фазе с 20% и 5% до 1% (моделирование гипоксии), так и повышение - с 1% до 5% и 20% ( (моделирование реоксигенации).
В ходе наших экспериментов ни один из вариантов 24-часового изменения содержания кислорода в среде культивирования не оказывал влияния на жизнеспособность ММСК из жировой ткани человека (табл. 9). Тем не менее, рядом авторов выявлен положительный эффект гипоксического прекондиционирования - кратковременного снижения содержания кислорода в среде культивирования перед трансплантацией клеток в ишемизированные области (Ни). Такое воздействие способствует сохранению жизнеспособности ММСК, которые при обычных условиях погибают практически через 4 суток (Toma, Pittenger, Cahill et al., 2002). Гипоксическое прекондиционирование повышает экспрессию таких ростовых факторов как HGF, VEGF, IGF-1 (Wang, Crisostomo, Herring et al., 2006; Crisostomo, Wang, Markel et al., 2008).
Как было показано, гипоксия активирует РІЗ/Akt сигнальный путь, что способствует повышению жизнеспособности клеток в результате прямого воздействия на проапоптотические белки или модуляции клеточного метаболизма (Datta, Brunet, Greenberg, 1999). Отмечается, что к механизмам, способствующим выживанию ММСК в данных условиях, относятся использование гликолитического пути и продукция глюкозо-6-фосфатазы для использования глюкозы (Mylotte L.A., Duffy A.M., Murphy M. et al., 2008; Lord-Dufour, Copland, Levros et al., 2009).
В данной серии экспериментов с целью изучения ответа ММСК на кратковременное изменение содержания кислорода в среде культивирования проводили снижение уровня Ог в газовой фазе с 20% и 5% до 1% и повышение с 1% до 5% и 20% на 6 ч и 24 ч.
В отличие от клеток, постоянно культивируемых при разном Ог, кратковременное изменение его содержания повлияло на содержание АФК в ММСК.
В наших экспериментах наиболее восприимчивыми с точки зрения содержания АФК оказались клетки, постоянно культивируемые при 5% Ог. Как повышение уровня Ог до 20%, так и снижение до 1% в данном случае сопровождались возрастанием количества АФК (рис. 16). Достоверное изменение данного показателя наблюдалось уже через 6 ч после начала действия гипоксии. При повышении уровня Ог до атмосферного через 24 ч наблюдалось наиболее значительное увеличение уровня внутриклеточных АФК.
Кратковременное снижение кислорода с 20% до 5% приводило к снижению АФК в клетках (рис. 15). Через 6 ч в этих условиях наблюдалась тенденция к уменьшению данного показателя, а через 24 ч отличия стали достоверными. Действие среды с 1% ( на начальном этапе сопровождалось тенденцией к уменьшению количества АФК в клетках, однако, через 24 ч данный показатель выравнивался или даже несколько превышал начальное значение.
В ММСК, постоянно культивируемых в условиях низкого содержания Ог (1%), при увеличении его содержания до 20% и 5% на короткий промежуток времени достоверных изменений в содержании АФК не наблюдалось (данные не представлены).
Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода
Перекись водорода часто используется в качестве классической модели окислительного стресса из-за своих уникальных биохимических свойств, таких как относительно длительный период полураспада и растворимость в липидах и водной среде (Droge, 2002). Н2О2 легко проникает через мембрану, быстро устанавливается равновесие ее концентраций внутри и вне клетки.
При исследовании чувствительности ММСК из жировой ткани человека к окислительному стрессу, вызванному широким диапазоном концентраций Н2О2, использовали величины LD5, LD15 и LD50 - концентрации Н2О2 в среде культивирования, при которых через 24 ч погибает 5%, 15% и 50% клеток соответственно. Для определения LD использовали удельную концентрацию (пмоль/кл), поскольку ранее показано, что на жизнеспособность клеток влияет не конечная концентрация Н2О2 в среде, а то ее количество, которое приходится на клетку (Бурова, Люблинская, Шатрова и др., 2012). В результате проведенных экспериментов на клетках трех разных доноров было выявлено, что для ММСК, культивируемых при 20% Ог, LDi5 и LD50 составляют 10,7±1,45 и 13,3±0,83 пмоль/кл., для ММСК при 1% 02 - 11,2±0,73 и 13,7±0,33 пмоль/кл. соответственно. При 5% 02 чувствительность к действию Н202 возрастала, показатель LD15 зарегистрирован на уровне 8±1 пмоль/кл., что достоверно ниже, чем в ММСК при 1% 02, а удельная концентрация Н202, соответствующая LD50, имела достоверно более низкое значение (11,3±0,33 пмоль/кл.) по сравнению с клетками при 20% и 1% 02. Значения LD5 во всех трех группах регистрировались на уровне 6-8 пмоль/кл (рис. 32). Таким образом, по устойчивости к перекиси водорода ММСК из жировой ткани человека сравнимы с дермальными фибробластами (Бурова, Люблинская, Шатрова и др., 2012).
Как известно, обработка перекисью водорода помимо непосредственного влияния приводит к образованию различных форм АФК, например, супероксида, перекиси водорода и гидроксильного радикала, которые способны повреждать ДНК, белки и липиды мембран клетки (Cadenas, 1989). В нашей работе более сильное изменение содержания внутриклеточных АФК вызывала низкая концентрация Н2О2. Наблюдаемое уменьшение величины данного показателя при увеличении дозы воздействия обусловлено, по-видимому, пермеабилизацией мембран в результате окислительного стресса и вытеканием красителя в среду. Оценка содержания внутриклеточных АФК в ММСК проводилась через 24 после начала воздействия Н2О2, при этом отмечено относительно небольшое увеличение количества внутриклеточных АФК. Аналогичную картину наблюдали исследователи в экспериментах с клетками HeLa (Непряхина, 2009). Проведенный ими детальный анализ зависимости накопления АФК в клетках от времени воздействия Н2О2 выявил наиболее интенсивное увеличение продукции АФК на начальных этапах воздействия (2 ч). Можно предположить, что накопление АФК компенсируется благодаря увеличению активности антиоксидантных систем клетки.
Перекись водорода в концентрации LDs способствовала повышению количества внутриклеточных АФК при всех вариантах культивирования, однако, не вызывала окислительного стресса, о чем свидетельствует отсутствие изменений в содержании ТБК-активных продуктов - маркеров перекисного окисления липидов (рис. 34).
Увеличение содержания ТБК-активных продуктов в клетках происходило при действии перекиси водорода в концентрации LD15. Наибольшего среднего значения данная величина достигала в ММСК при 5% 02.
Достоверных различий в уровне активности каталазы при действии пероксида водорода в течении 24 ч также не было обнаружено, однако, при 5% Ог после обработки Н2О2 в дозе LDis наблюдалась тенденция к увеличению уровня активности данного фермента. Достоверных изменений на уровне каталазы на исследуемом временном отрезке не наблюдалось, что, возможно, может объясняться более ранней ее активацией (рис. 35).
Изменение активности каталазы в ММСК, культивируемых при разном содержании Ог, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах LD5 и LD15. Данные представлены в виде M±m, n=3. Повышение активности СОД в 1,15-1,25 раз при всех вариантах условий культивирования наблюдалось после воздействия Н2О2 в дозе LD15, а также при 1% ( и наиболее интенсивно (в 1,7 раз) при 5% Ог после LD5 (рис. 36). О о
Перекись водорода в дозе LD15 способствовала увеличению в 1,7 раза активности глутатионпероксидазы при обработке клеток при 5% кислорода (рис. 37). В других условиях достоверных изменений не отмечалось. w и «
Таким образом, на временном отрезке 24 ч от начала действия пероксида водорода на клетки самыми чувствительными компонентами антиоксидантной системы ММСК являются СОД и ГП. Активность ферментов при действии Н2О2 наиболее интенсивно увеличивается в клетках при 5% кислорода.
При рассмотрении уровня экспрессии генов, связанных с окислительным стрессом, изучали гены 7 изоформ глутатионпероксидазы, 3 изоформ супероксиддисмутазы и каталазы после обработки клеток при 20% кислорода перекисью водорода в дозе LD15. Было обнаружено увеличение количества мРНК GPX1, GPX7, SOD1 и SOD2 (табл. 14), что согласуется с полученными нами данными об активности указанных ферментов. Таблица 14. Изменение экспрессии генов некоторых ферментов в ММСК, культивируемых в среде с 20%
В условиях окислительного стресса в зависимости от типа клеток аналогичное воздействие способствует увеличению экспрессии генов CAT и GPX1 (Braun, 2012). Как показано в экспериментах по моделированию окислительного стресса в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, обработка Н2О2 может активировать различные сигнальные пути, в том числе NADPH оксидазу и сопровождаться повышением количества Ог" (Li, 2001). Данный факт не противоречит результатам проведенных измерений активности СОД.
Также в нашей работе показано, что ГП принимает более активное участие в элиминации пероксида водорода по сравнению с каталазой. Wijeratne, Cuppett, Schlegel (2005) установили подобную закономерность на клеточной линии Сасо-2. В экспериментах этих авторов активность каталазы не изменялась в зависимости от количества добавляемой Н2О2, в то время как активность ГП при высоких концентрациях пероксида увеличивалась в несколько раз.