Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 14
1.1. Онтогенез коры головного мозга крыс 14
1.1.1. Возрастные особенности молекулярных механизмов возбуждения и 18
торможения в коре мозга крыс
1.2. Влияние пренатального стресса на развитие мозга и поведение 20
1.3. Механизмы синхронизации ритмов ЭЭГ 24
1.4. Механизмы эпилептогенеза 25
1.4.1. Гипотезы происхождения спайк-волновой активности при эпилепсии 28
1.5. Виды эпилепсий и эпилептических синдромов и их моделирование 31
1.6. Электрошоковая модель провокации эпилептиформной активности 32
1.7. Пентилентетразоловая модель провокации эпилептиформной активности 36 мозга
1.8. 4-аминопиридиновая модель провокации эпилептиформной активности мозга 38
1.9. Заключение 42
2. Материалы и методы 43
2.1. Экспериментальный материал 43
2.2. Процедура пренатальной гипоксии 43
2.3. Регистрация ЭКоГ в хроническом эксперименте
2.3.1. Операционные процедуры 45
2.3.2. Ход эксперимента 49
2.4. Анализ содержания медиаторов в теменной коре и гиппокампе мозга крыс 52
2.4.1. Определение концентрации белка 52
2.4.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
2.4.3. Анализ белков с использованием иммуноблоттинга 53
2.5. Поведенческие тесты 53
2.5.1. Суок-тест 54
2.5.2. Приподнятый крестообразный лабиринт 58
2.5.3. Тест вынужденного плавания (поведения отчаяния) по Порсолту 58
2.5.4. Тест объектно-пространственного обучения 59
2.6. Моделирование эпилепсии 62
2.6.1. Дозированный электрошок 62
2.6.2. Титрование пентилентетразолом в условиях хронических экспериментов
2.6.3. Интракортикальные микроинъекции 4-аминопиридина в условиях хронических экспериментов
2.6.4. Анализ ЭКоГ при эпилептиформной активности, вызванной аминопиридином и пентилентетразолом
3. Результаты 68
3.1. Формирование электрической активности неокортекса в процессе онтогенеза у крыс с нормальным эмбриогенезом и после пренатальной гипоксии
3.2. Анализ содержания медиаторов в теменной коре и гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию
3.3. Исследование нарушения адаптивного поведения у крыс, перенесших пренатальную гипоксию
3.3.1. Исследование уровня тревожности у крыс в Суок-тесте 79
3.3.2. Исследование уровня тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте
3.3.3. Выявление гиперактивности в тесте вынужденного плавания (поведения отчаяния) по Порсолту
3.3.4 Оценка способности к сложным формам обучения в тесте объектно- 87
пространственного обучения
3.4. Моделирование эпилепсии на крысах с нормальным эмбриональным 89
развитием и перенесших пренатальную гипоксию
3.4.1. Исследование эффектов дозированного электрошокового воздействия в постнатальном онтогенезе
3.4.2 Влияние титрования пентилентетразолом на электрическую активность неокортекса крыс в постнатальном онтогенезе
3.4.3. Влияние интракортикальных микроинъекций 4-аминопиридина на электрическую активность неокортекса крыс в постнатальном онтогенезе
4. Обсуждение 107
5. Заключение 115
Выводы 117
Список литературы
- Гипотезы происхождения спайк-волновой активности при эпилепсии
- Регистрация ЭКоГ в хроническом эксперименте
- Интракортикальные микроинъекции 4-аминопиридина в условиях хронических экспериментов
- Влияние титрования пентилентетразолом на электрическую активность неокортекса крыс в постнатальном онтогенезе
Введение к работе
Актуальность проблемы
Гипоксия или стресс в период пренатального развития является широко распространенной патологией и может приводить к значительным нарушениям в формировании структур и функций головного мозга в последующем онтогенезе (Журавин и др., 2003; Golan et al., 2009; Айламазян и др., 2013). Такая патология эмбриогенеза, в свою очередь, может отражаться на поведении и способности к обучению в индивидуальном развитии, как животных, так и человека. Действие пренатальных средовых факторов на развивающуюся нервную систему – причина многочисленных нарушений развития, которые вносят вклад в патогенез неврологических заболеваний, что является серьезной медико-социальной проблемой. Исследование особенностей созревания мозга в условиях нормального и нарушенного эмбриогенеза у крыс может прояснить механизмы адаптивных перестроек, происшедших в результате патологического воздействия в эмбриогенезе человека.
Известно, что гипоксические воздействия в пренатальный период приводят к изменениям в работе генетического аппарата клетки (Caro, 2001; Rybnikova et al., 2008), нарушению структурно-функциональных свойств клеточных мембран (Mishra and Delivoria-Papadopoulos, 1999) и нейронов в целом (Derrick et al., 2001; Rybnikova and Samoilov, 2015). Выяснено также, что при действии гипоксии на 14 сутки эмбрионального развития крыс наиболее уязвимыми являются пирамидные клетки неокортекса, формирующие функциональные миниколонки, и лабильные шипики, обеспечивающие пластичность нервной системы, что приводит к нарушению поведения и когнитивным дисфункциям (Дубровская и др., 2008; Журавин и др., 2014; Vasilev et al., 2016). Нарушение синаптогенеза (Sousa et al., 2000) и формирования шипикового аппарата дендритов рассматривают в качестве основных факторов патологии развития и когнитивного дефицита (Shapiro and Ribak, 2005; Chen et al., 2010; Sanchez et al., 2012). Можно предположить, что избирательное воздействие пренатальной гипоксии на структуру нервной системы и межклеточные взаимодействия (Zhuravin et al., 2009; Журавин и др., 2014; Vasilev et al., 2016) влияет на общий уровень возбудимости и формирование электрической активности мозга в
постнатальном онтогенезе. Эти изменения могут быть причиной эпилепсии, за счет повышения судорожной готовности (Ahmadzadeh et al., 2010; Sadaghiani et al., 2010).
Показано, что пренатальный стресс повышает чувствительность к
эпилептизации в пилокарпин-индуцированной эпилептической модели у самцов и
самок крыс (Sadaghiani et al., 2010). Тем не менее, роль пренатальной патологии в
патогенезе эпилепсии является спорной. Наблюдаются как просудорожные
(Ahmadzadeh et al., 2010; Sadaghiani et al., 2010; Edwards et al., 2002; Frye et al., 1999), так и противосудорожные (Reddy et al., 2002) последствия нарушения эмбриогенеза в зависимости от сроков стрессирования и используемых моделей эпилепсии. Однако по каким причинам возникают эти изменения все еще не до конца ясно. Поэтому важно выяснить механизмы генерации эпилептиформной активности на разных уровнях организации ЦНС с участием различных структур и медиаторных систем мозга при нормальном и патологическом развитии. В исследованиях на животных получили широкое распространение различные модели эпилепсии. Например, модель фокальный кортикальной эпилепсии с использованием 4-аминопиридина (Weissinger et al., 2004), модель, основанная на системном введении пентилентетразола для выявления роли ГАМКа-рецепторов в гиперсинхронизации (Klioueva et al., 2001), модель с использованием электрошока (Andr et al., 2002) для оценки вовлеченности в эпилептиформную активность ряда структур мозга, от ствола до коры больших полушарий, и многие другие модели. Моделирование эпилептиформной активности позволяет оценить риск развития гиперсинхронизации электрической активности после пренатального стресса, а также приблизиться к пониманию механизмов эпилепсии, ее генерации и распространения у животных и человека на разных стадиях постнатального развития. Последствия пренатального стресса в разные периоды постнатального онтогенеза могут быть различными за счет адаптивных механизмов и функциональных перестроек. Было показано, что локализация очага эпилептиформной активности при моделировании эпилепсии также претерпевает возрастные изменения (Weissinger et al., 2004), поэтому необходимо изучение возрастной динамики процессов гиперсинхронизации у животных с нормальным и нарушенным эмбриогенезом в постнатальном онтогенезе.
Таким образом, пренатальный стресс, нарушая процессы развития ЦНС, по-видимому, приводит к изменениям возбудимости и электрической активности мозга, а
также нарушениям в поведении животных и человека. Изучение возрастной динамики этих показателей у крыс, перенесших гипоксическое воздействие в эмбриональный период, не проводилось. Однако, можно полагать, что такого рода исследование позволит лучше понять процессы нормального и патологического развития мозга в постнатальном онтогенезе.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в исследовании особенностей формирования электрической активности новой коры и изменений уровня возбудимости мозга в постнатальном онтогенезе (в частности, при моделировании эпилепсии) у крыс с нормальным эмбриональным развитием и перенесших пренатальную гипоксию.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие
экспериментальные задачи:
-
Исследовать частотно-временные характеристики электрокортикограммы (ЭКоГ) крыс с нормальным и патологическим развитием в трех возрастных группах (Р20-26, Р30-45, Р90-120) в разных физиологических состояниях в свободном поведении.
-
Сравнить изменения содержания переносчиков глутамата (EAAT1), ГАМК (GAT1) и ацетилхолина (VAChT) в коре и гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию.
-
Оценить возбудимость нервной системы крыс разного возраста с пренатальной патологией при помощи дозированного электрического воздействия.
-
Сравнить устойчивость к эпилептогену пентилентетразолу, антагонисту ГАМКа-рецепторов, у крыс разного возраста с нормальным развитием и перенесших пренатальную гипоксию.
-
Сравнить изменение характера эпилептиформной активности в ЭКоГ, вызванной блокатором калиевых каналов 4-аминопиридином, в онтогенезе крыс с нормальным эмбриогенезом и после пренатальной гипоксии.
-
Оценить уровень тревожности и гиперактивности, а также способность к сложным формам обучения у взрослых крыс с пренатальной патологией.
Научная новизна результатов
Впервые изучены особенности формирования электрической активности
неокортекса у крыс в трех возрастных периодах, соответствующих детскому (Р20-26),
подростковому (Р30-45) и взрослому (Р90-120), перенесших пренатальную гипоксию
на Е14. Выяснено, что у крыс с нормальным эмбриогенезом в процессе постнатального
развития происходит смещение пика спектральной плотности мощности ЭКоГ тета-ритма бодрствования с низкочастотной к более высокочастотной области, в то время как у животных с пренатальной патологией наблюдается обратная тенденция. Также показано, что в процессе постнатального онтогенеза у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, происходит выраженное снижение суммарной спектральной плотности мощности ЭКоГ медленноволнового сна в диапазоне 1-5 Гц.
Впервые показано изменение содержания белков-переносчиков глутамата и аспартата (EAAT1), ГАМК (GAT1) и ацетилхолина (VAChT) в неокортексе и гиппокампе в возрасте P20, Р35 и Р90 у крыс, перенесших пренатальную гипоксию. Продемонстрировано увеличение содержания транспортера глутамата EAAT1 в коре мозга во всех исследованных возрастных группах по сравнению с контролем, в то время как в гиппокампе отмечено его снижение наряду с увеличением транспортера ГАМК GAT1 у взрослых крыс. Также впервые показано снижение содержания переносчика ацетилхолина VAChT в процессе постнатального онтогенеза у крыс, перенесших пренатальную гипоксию.
Впервые исследованы изменения возбудимости мозга крыс разного возраста,
перенесших пренатальную гипоксию на Е14, методами моделирования
эпилептических состояний. Показано, что при использовании электрошока более тяжелые и длительные судороги наблюдается у крыс в возрасте Р20-26 и Р30-45 после пренатальной патологии. При формировании локального очага эпилепсии микроинъекцией 4-апминопиридина впервые было показано, что крысы, перенесшие пренатальную гипоксию, имеют более длительные эпизоды эпилептиформной активности по сравнению с контрольными животными. При системном введении антагониста ГАМКа-рецепторов пентилентетразола крысы с пренатальной патологией в возрасте Р20-26 и Р30-45 продемонстрировали большую, а в Р90-120 – меньшую устойчивость к данному эпилептогену по сравнению с контрольными животными соответствующих возрастных групп.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость данной работы заключается в раскрытии возможных механизмов формирования повышенной возбудимости, вызванной пренатальным стрессом. Продемонстрировано, что пренатальная гипоксия приводит к изменению баланса возбуждающих и тормозных медиаторов в коре мозга и гиппокампе крыс на
разных сроках постнатального онтогенеза. Показано, что в возрасте Р20-26 происходит увеличение возбуждения в коре, в то время как у взрослых крыс (Р90-120) наблюдается компенсаторное торможение со стороны гиппокампа за счет снижения содержания глутамата и увеличения ГАМК в этой структуре, о чем свидетельствуют изменения содержания транспортеров возбуждающих и тормозных аминокислот.
Практическая значимость работы состоит в том, что полученные данные о формировании электрической активности коры мозга в постнатальном онтогенезе крыс, перенесших пренатальную гипоксию, могут быть использованы в анализе спектральной плотности мощности ЭЭГ человека и разработке диагностических критериев смещения баланса возбуждения и торможения при различных патологиях развития. Выявленные аномалии ГАМК-ергической системы мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию, могут быть основой разработки новых фармакологических препаратов для лечения эпилепсии у людей с патологией эмбрионального развития.
Положения, выносимые на защиту
-
В процессе онтогенеза у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, происходит нарушение в формировании тета-ритма ЭКоГ во время бодрствования и дельта-ритма ЭКоГ во время медленноволнового сна.
-
У крыс, перенесших пренатальную гипоксию, в медиаторных системах мозга происходит смещение баланса в сторону возбуждения в возрасте Р20-26 и Р30-45 и торможения в возрасте Р90-120, о чем свидетельствуют изменения содержания переносчиков возбуждающих и тормозных аминокислот.
-
В возрасте Р20-26 и Р30-45 у крыс с пренатальной гипоксией облегчена генерация гиперсинхронизации электрической активности по сравнению с контролем в электрошоковой и 4-аминопиридиновой моделях эпилепсии.
-
У крыс, перенесших пренатальную гипоксию, в возрасте Р20-26 и Р30-45 в генерации гиперсинхронизации электрической активности заметно меньшую роль играет торможение, обусловленное ГАМКа-рецепторами, тогда как в Р90-120 показана большая их вовлеченность при моделировании эпилепсии пентилентетразолом.
Структура и объем диссертации
Гипотезы происхождения спайк-волновой активности при эпилепсии
Эпилепсия представляет собой хроническое заболевание головного мозга, характеризующееся повторными непровоцируемыми приступами нарушений двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных или психических функций, возникающих вследствие чрезмерных нейронных разрядов (Мухин и др., 2004).
Один из возможных механизмов развития эпилептиформной активности обусловлено тем, что клетки генерируют пачки импульсов в результате потенциации глутаматергической синаптической передачи (Дудина, 2005) и изменения активности кальциевых каналов (Avanzini and Franceschetti, 2004). Принципиально, само по себе эти события не являются патологическими, поскольку изменение активности нервных клеток необходимо для обработки информации мозгом (Huguenard, 1998). По этой причине очень важно понимать механизмы как синхронизация эпилептических пачечных разрядов в клетках, так и возможные пути распространение эпилептиформной активности по различным областям мозга (Borbly et al., 2006). Сама синхронизация разрядов, как известно, встречается и в норме, например при генерации ритмов ЭЭГ (Steriade, 2003). Синхронизация активности нейронов может осуществляться за счет синаптических связей между возбуждающими клетками, и, по-видимому, за счет электрического взаимодействия несинаптического типа между их мембранами (Galarreta and Hestrin 1999). Также это может происходить за счет синхронной активности тормозных интернейронов, тормозящих одновременно большое количество клеток, после чего повышается вероятность генерации синхронных разрядов (Дудина, 2005). Наличие замкнутых цепей переключений, таких как лимбическая система (гиппокамп – миндалина – кора), дает возможность эпилептиформной активности распространяться и поддерживаться достаточно долго (Avanzini and Franceschetti, 2004).
Известно, что при некоторых генетических формах предрасположенности к судорожной активности наблюдается снижение эффективности ГАМК-ергического торможения (Карлов и Петренко, 1980; Веретенников и др., 1996; Schwartzkroin, 2009). Показано, что в экспериментальных моделях эпилепсии происходят изменения субъединичного состава ГАМК-ергических рецепторов, а, следовательно, меняется эффективность высвобождения и обратного захвата ГАМК. У пациентов с хроническими формами эпилепсии увеличивается как число ГАМК-ергических рецепторов в синапсах, так и число самих синапсов. В некоторых случаях наблюдается увеличение пресинаптического высвобождения ГАМК (Schwartzkroin, 2009)
В гиппокампе и других структурах коры тормозные интернейроны через свои связи взаимодействуют с пирамидными нейронами, которые возбуждают эти интернейроны через возвратные коллатерали аксонов (Mody et al., 1994). Благодаря этому формируется система с положительными обратными связями, которая способна поддерживать эпилептиформную активность. Повышение внеклеточной концентрации тормозного нейротрансмиттера снижает общую возбудимость сети нейронов за счет тонического торможения. Считается, что это является внутренним механизмом защиты против эпилептогенеза. Возможность данной схемы подтверждается тем, что противоэпилептический препарат тиагабин увеличивает внеклеточную концентрацию ГАМК, блокируя ее обратный захват (uptake) (Avanzini and Franceschetti, 2004). Таким образом, при эпилептогенезе наблюдаются значительные изменения как в возбуждающей глутаматергической, так и в тормозной ГАМК-ергической системах.
Распространение эпилептиформной активности по различным областям мозга может быть значительно облегчено в случае возникновения мутаций генов, кодирующих белки ионных каналов, даже если первичной причиной возникновения эпилепсии была не генетическая мутация (Schwartzkroin, 2009).
Большинство исследователей и врачей-неврологов, занимающихся диагностикой и лечением эпилепсий, сходятся во мнении, что по происхождению идиопатические генерализованные эпилепсии (ИГЭ) являются первично-генетическими (Scheffer and Berkovic, 2003). Идиопатическая эпилепсия обусловлена преимущественно мутациями генов, кодирующих белки ионных каналов или сопутствующие им субъединицы (Steinlein, 2004). В эту группу заболеваний включают эпилепсии с редким улучшением состояния, а также моногенные эпилепсии – более распространенные формы, которые являются семейными (рис. 1). Многие из генов, причастных, как считается, к возникновению ИГЭ, кодируют белки различных ионных каналов и рецепторов нейромедиаторов (Schwartzkroin, 2009). Например, мутации генов KCNQ2 и KCNQ3 одного из подсемейств потенциал-зависимых калиевых каналов, вызывают доброкачественные семейные судороги новорожденных (Cooper, 2010, Rogawski, 2000). Потенциал-зависимые калиевые каналы образованы четырьмя гомологичными полипептидами, формирующими трансмембранную пору (классически названный М-канал) (Bezanilla, 2008). В ЦНС гены KCNQ играют важную роль в регуляции возбудимости нейронов путем контролирования потенциала действия, частности его повторного возникновения, и синаптической передачи. Снижение М-тока, обусловленное мутациями KCNQ2 и KCNQ3, встречается в 20–25 % случаев и свидетельствует о том, что мозг может быть особенно чувствительным к изменениям проводимости калия, обусловленным гипервозбудимостью (Dedek et al., 2001, Cooper, 2010). Мутации в GABRG2, GABRA1 и GABRD были зарегистрированы в аутосомно-доминантной ювенильной миоклонической эпилепсии, генерализованной эпилепсии с фебрильными судорогами плюс, а также детской и юношеской абсансной эпилепсиях. ГАМКа-рецепторы являются пентамерами, и, как правило, состоят из двух субъединиц, двух субъединиц, и содержат одну , , , или -субъединицу. Эти субъединицы формируют хлоридно-селективную центральную пору. После связывания ГАМК, канал открывается, и быстрое увеличение проводимости хлорида подавляет деполяризацию, что приводит к снижению возбуждения нейронов. Некоторые мутации приводят к потере функции рецептора ГАМК, что вызывает снижение торможения и гипервозбудимости нейрональной сети (Schwartzkroin, 2009).
Исходя из этих новых данных о преимущественно генетическом происхождении многих видов идиопатических генерализованных эпилепсий, в том числе детских, становится понятным характерное течение ИГЭ, протекание которых идет стабильно, без улучшений. Дальнейшее изучение каналопатий и нарушений в работе рецепторов способствуют лучшему пониманию механизмов возникновения и развития данных видов эпилепсии и, следовательно, возникновению новых подходов в их диагностике и лечении (Crunelli and Leresche, 2002).
Регистрация ЭКоГ в хроническом эксперименте
Самок крыс линии Wistar подвергали на 14-е сутки беременности воздействию гипоксии в специальной камере емкостью 100 л, содержащей системы терморегуляции, вентиляции, газового анализа и адсорбции выдыхаемого СО2. В ходе эксперимента содержание кислорода в камере снижали с 20,7 до 7,0% и поддерживали на этом уровне в течение 3 часов. Концентрация углекислоты в камере не превышала 0,2%, а температура поддерживалась на уровне 22С. Животных контрольной группы содержали в течение трех часов в камере при нормальной концентрации О2. Животные подвергались пренатальной гипоксии на стадии, когда в головном мозге происходит активная пролиферация нейробластов и начинается формирование исследуемых структур головного мозга. На 14 день у эмбрионов крыс образуется сосудистая зона (Оленев, 1978) и начинается миграция нейробластов в краевую зону, дающую начало неокортексу. Активное формирование гиппокампа происходит на 18 сутки пренатального развития. Таким образом, гипоксическое воздействие на эмбриональный мозг оказывали в критический срок формирования анализируемых структур, в то время, когда они наиболее уязвимы.
Данная модель позволяет получать хорошо воспроизводимые изменения когнитивных функций (Журавин и др., 2010) и изучать динамику и молекулярно-клеточные основы этих нарушений в ходе развития животных, а также использовать их для тестирования различных фармакологических препаратов (Журавин и др., 2011).
Для длительной регистрации электрокортикограммы (ЭКоГ) крысы в хроническом эксперименте особое значение имеют характеристики вживляемых электродов (их материал, толщина, сопротивление), а также надежность их крепления, как на черепе животного, так и при монтаже разъемов, обеспечивающих стабильный контакт с усилителем.
В качестве основного типа электродов, использованных в наших экспериментах для регистрации ЭКоГ крыс и оказавшимся наиболее удачным, были иглы из нержавеющей стали в оксидной изоляции (иглы для су-джок терапии и/или для иглорефлексотерапии диаметром 0,2 мм, «Субал», Россия). Диаметр их кончика составляет около 10-15 мкм, что обеспечивает успешное введение в ткань, низкое повреждающее действие и надежную регистрацию суммарной электрической активности неокортекса. Сопротивление электродов составляло от 20 до 50 кОм. Индифферентный электрод вводился под череп эпидурально и представлял собой анатомически изогнутую хлорированную серебряную пластину. Площадь индифферентного электрода (1-2 мм2) была значительно больше, чем у погружных интракортикальных электродов, что обеспечивало надёжную регистрацию ЭКоГ.
Блоки электродов изготавливали на основе портов Mini USB B.F. 5P SMT Type с использованием игл из нержавеющей стали с оксидной изоляцией, которые впоследствии закреплялись акрилоксидом. Стальные иглы диаметром 0.12 мм и 7 мм длиной обрезали до длины 5 мм, затем удаляли изоляцию на остром конце иглы. После чего 4 иглы припаивали к заранее подготовленному штекерному коннектору Mini USB (ШК1) на расстоянии 1.5 мм друг от друга. Гнездовые коннекторы (ГК1) были выполнены также на основе Mini USB B.F. 5P SMT Type путем подпаивания 4 медных изолированных проводов, длиной 35 см к соответствующим контактам, и ко второму концу каждого провода подпаивали штекерные коннекторы (ШК2_1-4) для гнезд усилителя. Во всей цепи проверяли токопроводность с помощью мультиметра.
Пластину индифферентного электрода помещали в гнездовую часть (ГКИ) разъема для микрочипов SCS-28 DIP с покрытием 5 мкм олова (панель 28 контактов, узкая) и припаивали соответствующим данному типу соединений припоем. Штекерный коннектор (ШКИ1) был изготовлен на основе зажима к SСL-28 DIP с покрытием 0.25 мкм золота путем подпаивания к нему медного провода длиной 30-35 см, ко второму концу провода, подпаивался штекерный коннектор (ШКИ2) для гнезда усилителя.
Три серии экспериментов было проведено на крысах разных возрастных групп. День родов принимали за нулевой день жизни.
Первой группе животных (20-26 дней) операция по вживлению электродов и канюль проводилась в возрасте 17-19 дней постнатального развития, второй группе (30-45 дней) – в возрасте 29-30 дней. Группе взрослых животных операцию проводили в 3 месяца. Животным, перенесшим пренатальную гипоксию, все операционные процедуры проводились по той же схеме, что и контрольным (рис. 2).
Накануне операции крысы подвергались 4-часовой пищевой депривации в 4-недельном и 3-месячном возрасте и 2-часовой – в 3-недельном. Затем животное взвешивали с целью рассчитать точную дозу наркоза. Операцию осуществляли под общей анестезией с использованием стерильных инструментов и оборудования. В качестве общей анестезии использовали Золетил – ветеринарный препарат производства фирмы “Virbac sant animale” в дозировке 100 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно. Операционная фаза наркоза достигалась через 10-15 минут после внутрибрюшинной инъекции препарата, что определяли по отсутствию реакции отдергивания лап и хвоста при сдавливании. В зависимости от продолжительности операции, по необходимости, производили добавочные инъекции золетила в дозе, составляющей - первоначальной дозы, внутримышечно. В некоторых операциях использовался болеутоляющий миорелаксант рометар (ксилазин) внутримышечно в расчете 5 мг/кг.
Во время операции обеспечивался подогрев животного, так как под общим наркозом и при оперативном вмешательстве нарушается терморегуляция организма. Операционное поле на фронтальной поверхности черепа промывали водой, затем сбривали с него шерсть, кожу обрабатывали 5% спиртовым раствором йода. Также проводили местную инфильтрационную анестезию (от 0,5 до 1 мл однократно подкожно), при которой анестезирующим 0.5% раствором новокаина послойно пропитывают мышечные ткани в области операционного поля.
Разрез кожи проводили хирургическими ножницами, полностью удаляя кожный лоскут размером около 1 см2. После этого рассекали мышцы и раздвигали их при помощи хирургических инструментов. Затем удаляли надкостницу путем соскабливания с поверхности черепа. Далее осуществляли резекционную трепанацию черепа путем наложения двух фрезевых борозд в рострально-каудальном направлении длиной 5 мм, шириной 0.3-0.4 мм, пересекая брегму, и одну борозду в затылочной области над мозжечком длиной 1-2 мм, шириной 0.3-0.7 мм, перпендикулярно предыдущим двум бороздам. Расположение борозд: две симметричные для введения блоков электродов, проходящие на расстоянии 1-2 мм латерально от сагиттального шва (в зависимости от возраста животного), от 2 мм рострально до 2 мм каудально от уровня брегмы. Для интракортикальных микроинъекций 4-АП использовали блок канюль, для которого сверлили 2 круглых отверстия – на расстоянии 0.2-0.5 мм латерально от сагиттального шва 0.7 мм рострально и 0,7 мм каудально от уровня брегмы (для экспериментов с подкожным введением ПТЗ блок канюль не вживлялся). Для размещения индифферентного электрода над мозжечком производили фрезевое отверстие на расстоянии 1-1.3 мм каудальнее уровня лямбда, длиной 2 мм и шириной 0.7 мм (рис.3). Краниотомия производилась на глубину кости черепа таким образом, чтобы минимально повредить твердую мозговую оболочку, при необходимости для остановки кровотечения использовали тампонаду ватными шариками, смоченными в растворе перекиси водорода, изотоническом растворе NaCl и стерильную, гемостатическую фибринную губку. Для более надежной фиксации вживляемых электродов на свободной обсушенной поверхности черепа производили насечки, увеличивающие шероховатость и адгезионную способность, в некоторых операциях использовали стальные скобы для увеличения надежности крепления, которые вводились в дополнительные трепанационные отверстия на черепе.
Интракортикальные микроинъекции 4-аминопиридина в условиях хронических экспериментов
В работе использовали 30 самцов крыс линии Wistar. Крысы до оперативного вмешательства содержались при температуре 20-23C, вода и пища ad libitum. Животные разводились в условиях вивария с точной фиксацией дат рождения и возраста: день родов считали за нулевой день. Для эксперимента отбирали только здоровых животных. В работе использовались 2 группы крыс – контрольные и перенесшие пренатальную гипоксию на Е14, которые были разделены на 3 возрастные группы: 20-26 дней, 30-45 дней и 3 месяца – первой группе операцию по вживлению электродов проводили в возрасте 17-19 дней, второй группе в возрасте 29-30 дней, а третьей – 3 месяцев. Далее после восстановительного периода (3-5 дней) проводили эксперименты по одинаковой схеме на обеих группах. Вес крыс в момент операции составлял около 40 г и более, достигая ко времени завершения эксперимента 140-150 г.
После обязательного мониторинга фоновой ЭКоГ через день осуществлялось титрование ПТЗ подкожно по 10 мг/кг каждые 15 минут до достижения генерализованного приступа. Параллельно с регистрацией ЭКоГ проводился видеомониторинг. Раствор для инъекций изготавливали в лабораторных условиях путем разведения сухого вещества ПТЗ в стерильном изотоническим растворе NaCl (0,9%). Концентрация раствора для инъекций ПТЗ составила 2 мг на 0,1 мл, чтобы избежать повреждения тканей вводимым объемом жидкости.
В работе использовали 45 самцов крыс линии Wistar. Крысы до оперативного вмешательства содержались при температуре 20-23C, вода и пища ad libitum. Животные разводились в условиях вивария с точной фиксацией дат рождения и возраста: день родов считали за нулевой день.
Основные результаты были получены на 35 хронических животных в возрасте с 19 дней до 3,5 месяцев (17 крыс, перенесших пренатальную гипоксию на Е14, и 18 контрольных крыс). Интракортикальные микроинъекции веществ производили при помощи Гамильтоновского шприца объемом 25 мкл, оснащенного гибким переходником из полистироловой трубки диаметром 0,3 мм с инъекционной иглой диаметром 0,29 мм. Раствор для микроинъекций изготавливали в лабораторных условиях путем разведения сухого вещества 4-АП в стерильном изотоническим растворе NaCL (0,9%). Концентрация раствора для микроинъекций 4-АП составила 25 мМ, что соответствует концентрации, использованной другими авторами (Wonga et al., 2001, Medina-Ceja et al, 2008,). Перед введением 4-АП осуществлялась регистрация ЭКоГ с параллельным видеомониторингом. Для введения микрообъема вещества, не потревожив крысу и не причинив ей боли, в направляющую вживленную канюлю вводили иглу микроинъектора, превышающую длину направляющей канюли на 0,2 мм. Затем 4-АП вводится в дозировке 0,5-1 мкл в выбранную канюлю. Регистрация ЭКоГ и видео продолжались на протяжении введения вещества, а также 1 час и более (при наличии эпилептиформной активности) после него.
Контрольные эксперименты.
Для ответа на вопрос о том, являются ли зарегистрированные изменения параметров спайк-волновой активности вслед за микроинъекиями 4-АП характерными для определенного возраста животного, или это следствие многократного химического киндлинга (эпилептизации) неокортекса в течение многодневных хронических экспериментов, мы провели контрольное исследование. Была проведена длительная регистрация ЭКоГ крыс в тех же возрастных периодах, что и у экспериментальных групп, но вместо введения 4-АП производили микроинъекции изотонического 0,9% раствора NaCl в тех же объемах. Также следовало проверить, не являются ли эпизоды спайк-волновой активности следствием инвазивного способа установки погружных электродов и введения относительно большого объема жидкости в толщу кортикальной ткани.
Для проведения этих контролей двум крысам линии Wistar в возрасте 25 дней были вживлены погружные электроды и канюли по той же схеме, что и опытным животным (рис. 2). После восстановительного периода, нами была начата серия экспериментов по регистрации ЭКоГ и введению изотонического раствора NaCl. В течение первых 20 или более минут эксперимента регистрировали фоновую ЭКоГ. Далее интракортикальные введения изотонического раствора NaCl (0,9%) производили при помощи микроинъектора, описанного выше, в объеме 0,5-1 мкл. Затем были произведены однократные микроинъекции 25 мМ раствора 4-АП в объеме 1 мкл с предварительной и последующей записью ЭКоГ.
В среде программы регистрации ЭКоГ Bioactivity Recorder v5.44 нами были проанализированы латентные периоды возникновения эпилептиформной спайк-волновой активности (СВА) и длительности эпизодов СВА. Частоты следования спайк-волн внутри эпизодов СВА и спектральная плотность мощности анализировались в среде программы pClamp 10 Software (Molecular Devices) после экспорта из программы для регистрации. Для анализа спектральной плотности мощности выделяли эпохи анализа исходя из длительности приступов – эпизоды эпилептиформной активности анализировались целиком. Спектральная плотность мощности - функция, описывающая распределение мощности сигнала в зависимости от частоты, то есть мощность, приходящаяся на единичный интервал частоты. Имеет размерность мощности, делённой на частоту. Оценка спектральной плотности мощности может выполняться методом преобразования Фурье, предполагающего получение спектра в области частот посредством быстрого преобразования Фурье.
Затем собранные данные экспортировали в программу GraphPad Prism v. 7.0 для расчетов статистических параметров и их анализа. Были вычислены средние значения и ошибки среднего. Все параметры были вычислены с достоверностью P 0,05. В среде программы осуществлялась проверка массива данных на нормальность распределений по тесту Колмогорова-Смирнова, далее определяли достоверность различия средних в выборках по критерию Стъюдента (T-тесту), критерию Манна-Уитни и двухфакторному дисперсионному анализу (two-way ANOVA
Согласно данным литературы, крысята, достигшие возраста 10-12 дней, по степени зрелости головного мозга соответствуют доношенным новорожденным детям (Romijna et al., 1991, Galanopoulou et al., 2009). Соответственно, крысы в возрасте 20-26 дней жизни (Р20-26) с точки зрения сроков постнатального онтогенеза человека достигают 2-6-летнего возраста (Galanopoulou et al., 2009). Крысы в возрасте от 35 до 45 дней (Р30-45) соответствуют пубертатному возрасту подростков, а в 3 месяца (Р90-120) – уже взрослым (Semple et al., 2013).
Данные были получены на 30 крысах с вживленными электродами в свободном поведении трех возрастных групп Р20-26, Р30-45 и Р90-120, что соответствует детскому, пубертатному и взрослому возрасту. У животных наблюдались: в период активного бодрствования -исследовательская активность, груминг, периоды приема пищи и воды; в периоды сна -чередование фаз засыпания, медленноволнового и парадоксального сна. Выделенные поведенческие паттерны сопровождались характерными видами электрической активности на ЭКоГ (рис.14).
При анализе частотно-временных характеристик ЭКоГ крыс, перенесших пренатальную гипоксию, и крыс контрольной группы в процессе онтогенеза были обнаружены значительные изменения в спектральной плотности мощности сигнала ЭКоГ, характерной для данных паттернов физиологической активности.
Влияние титрования пентилентетразолом на электрическую активность неокортекса крыс в постнатальном онтогенезе
Была проведена серия экспериментов по выявлению уровня возбудимости у крыс методом моделирования эпилепсии с применением электрошокового воздействия, совместно с сотрудниками лаборатории «Молекулярных механизмов нейронных взаимодействий» ИЭФБ РАН.
Было обнаружено, что дозы электровоздействия, вызывающие определенную реакцию, с возрастом увеличиваются, причем как у животных с нормальным эмбриогенезом, так и у крыс, перенесших пренатальную гипоксию (табл. 4). Примечательно, что динамика ответов на различные дозы в процессе онтогенеза у этих крыс схожа за исключением подросткового (P30-43) и старого (P500-550) возрастов. У подростков и взрослых крыс, перенесших пренатальную гипоксию, наблюдаются такие же соотношения пороговых доз возникновения исследуемых реакций как у контрольных животных в соответствующем возрасте. Так, у крыс P30-43, перенесших пренатальную гипоксию, пороговые дозы возникновения «дикого бега», клонико-тонических судорог и тонических судорог с полной экстензией задних конечностей статистически не различаются, а у взрослых крыс одинаковые пороговые дозы возникновения клонико-тонических судорог и экстензии задних конечностей превышают почти в 2 раза дозу возникновения «дикого бега».
У старых крыс, перенесших пренатальную гипоксию, в отличие от контрольных животных пороговая доза для «дикого бега» не увеличивается и остается на уровне таковой для взрослых животных. Пороговая доза для «дикого бега» в этой возрастной группе оказывается ниже в 2,7 раза дозы возникновения клонико-тонических судорог и в 4,9 раз дозы возниконовения тонических судорог с полной экстензией задних конечностей. Пренатальная гипоксия повышает чувствительность к электрическому воздействию у животных в отношении дикого бега (в 1-ой – тест Манна-Уитни с р 0,001 и 4-ой - р 0,002 возрастных группах).При этом у старых крыс доза возникновения тонических судорог с полной экстензией задних конечностей превышает дозу возникновения клонико-тонических судорог в 1,8 раз. + - достоверные (р 0,01) различия внутри одной возрастной подгруппы среди животных с нормальным или нарушенным эмбриогенезом между порогом возникновения «дикого бега» и клонико-тонических судорог; А - достоверные (р 0,01) различия внутри одной возрастной подгруппы среди животных с нормальным или нарушенным эмбриогенезом между порогом возникновения клонико-тонических судорог и экстензии
Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Пренатальная гипоксия в некоторых случаях приводила к более сильному и продолжительному судорожному ответу на электрошоковое воздействие в дальнейшем онтогенезе. По степени выраженности судорожной реакции в баллах различия между контрольными и экспериментальными животными наблюдались в 1-й группе (P20-26) при 10 мА (two-way ANOVA, Fisher post-hoc test p 0,01) и 70 мА (two-way ANOVA, Fisher post-hoc test p 0,05), во 2-й группе при 40 мА (two-way ANOVA, Fisher post-hoc test p 0,01), в 4-й группе (P500-550) при 10, 20 , 30 и 60 мА (two-way ANOVA, Fisher post-hoc test p 0,001, p 0,01, p=0,051 и p 0,05, соответственно). По продолжительности судорожной реакции различия между контрольными и экспериментальными животными наблюдались в 1-й группе (P20-26) при 40 мА (two-way ANOVA, Fisher post-hoc test p 0,05) и во 2-й группе (P30-43) при 40 и 60 мА (two-way ANOVA, Fisher post-hoc test p 0,001 и p 0,05, соответственно). Примечательно, что у взрослых животных (P90-120) разницы в исследуемых параметрах между контрольной и экспериментальной группами не обнаружено. При анализе количества крыс, демонстрирующих судорожную реакцию (Табл. 5), было обнаружено, что животные, перенесшие пренатальную гипоксию, в 1-й и 4-й возрастных группах оказались более чувствительными к воздействию слабых токов при развитии «дикого бега» и к воздействию сильных токов при развитии экстензии задних конечностей. Количество животных, демонстрирующих тоническую реакцию без экстензии задних конечностей на воздействие средних токов (30-40 мА и 50-60 мА) в 4-й возрастной группе или экстензию задних конечностей на воздействие средних токов - во 2-й (30-40 мА) и 3-й (50-60 мА) возрастных группах также было больше в группе с пренатальной патологией. Только в двух случаях контрольные крысы оказались более чувствительными к воздействию средних токов (50-60 мА) - при развитии «дикого бега» в 3-й возрастной группе, и к воздействию сильных токов - при развитии клонико-тонических реакций во 2-й возрастной группе. Однако, по крайней мере, у взрослых животных этот феномен может быть объяснен тем фактом, что у всех крыс гипоксической группы при воздействии сильных токов развивалась максимальная судорожная активность, а в контрольной группе значительная часть животных при аналогичном электрическом воздействии реагировала слабее, демонстрируя «дикий бег».
Проведенные эксперименты показали, что структура судорожного ответа у крыс разного возраста контрольных и экспериментальных групп не различается, а при увеличении силы тока наблюдается последовательное усиление судорожной реакции с увеличением ее продолжительности (рис. 28).
Таким образом, крысы, перенесшие пренатальную гипоксию, в Р20-26, Р30-45 и Р500-550, соответствующие детскому, подростковому и старому возрастам демонстрируют большую тяжесть судорог, а младшие группы животных также и их большую длительность по сравнению с контролем, что говорит о большей возбудимости мозга в данных возрастных периодах. Табл. 5. Количество животных в процентах, демонстрирующих судорожные реакции при
Для выявления участия ГАМКа-ергической системы в изменениях баланса торможения и возбуждения при гиперсинхронизации электрической активности мозга у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, было проведено моделирование эпилепсии с применением антагониста ГАМКа-рецепторов пентилентетразола (ПТЗ).
Данные были получены на 49 животных с вживленными электродами, которым вводили повторяющиеся каждые 15 минут подкожные инъекции ПТЗ в дозировке 10 мг/кг. Эксперименты проводились в свободном поведении. Было показано, что подкожные инъекции вызывали, начиная со второй инъекции, спайк-волновую активность с несколько различными параметрами у крыс разных групп.
Показано, что для достижения генерализованных приступов эпилептиформной активности с вовлечением мышечных клонических судорог крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, требуется различное количество инъекций ПТЗ в зависимости от возраста, в то время как крысы контрольной группы не продемонстрировали подобной вариабельности в чувствительности к данному эпилептогену (рис. 29). Так крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, в возрасте Р20-26 было необходимо 10,25±1,03 инъекций, в то время как контрольной группе – 6,11±0,63 (различия по t-критерию с достоверностью p 0.01), в Р30-45 8,92±0,69 и 6±0,37 соответственно (различия по t-критерию с достоверностью p 0.01), в Р90-120 3,75±0,53 и 5,57±0,43 инъекций соответственно (различия по t-критерию с достоверностью p 0.05). Таким образом, видно, что до достижения генерализации крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, необходимо во взрослом возрасте меньше инъекций, чем в детском (t-критерий, p 0.01) и подростковом возрасте (t-критерий, p 0.0001).