Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Строение и структура костной ткани 10
1.2 Состав костного матрикса 12
1.3 Регуляторные белки костной ткани 18
1.5 Применение регуляторных белков костной ткани в ортопедии 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 31
2.1 Материалы исследования 31
2.2 Методы исследования
2.2.1 Способ получения низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных 34
2.2.2 Хроматографические методы исследования белков костной ткани 34
2.2.3 Способ моделирования перелома голени у лабораторных мышей 35
2.2.4 Методы исследования сыворотки крови экспериментальных животных 36
2.2.5 Методы исследования костной ткани экспериментальных животных 37
2.2.6 Метод оценки содержания гликогена в печени и мышечной ткани экспериментальных животных 37
2.2.7 Статистические методы исследования 37
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 38
3.1 Экспериментальный анализ условий проведения гель-проникающей хроматографии 38
3.2 Хроматографическое исследование кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных 43
3.2.1 Исследование состава препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани собаки, быка свиньи и кролика с помощью гель-проникающей хроматографии 44
3.2.2 Исследование состава препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани собаки, быка свиньи и кролика с помощью ионообменной хроматографии
3.3 Сравнение биологического действия фракций препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани свиньи и быка, обладающих сродством к катионообменнику 52
3.4 Изучение биологического действия фракций препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка 67
3.4.1 Получение фракций с рассчитанной молекулярной массой 6,5 и 1,3 кДа из препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка 67
3.4.2 Исследование биологического действия фракции белков
костной ткани быка с рассчитанной молекулярной массой 6,5 кДа... 70
3.4.3 Исследование биологического действия фракции белков
костной ткани быка с рассчитанной молекулярной массой 1,3 кДа... 80
Заключение 90
Выводы 95
Список литературы
- Регуляторные белки костной ткани 18
- Способ получения низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных
- Метод оценки содержания гликогена в печени и мышечной ткани экспериментальных животных
- Сравнение биологического действия фракций препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани свиньи и быка, обладающих сродством к катионообменнику
Регуляторные белки костной ткани 18
Костная ткань - специализированный вид соединительной ткани, которая вместе с хрящевой тканью составляют скелет организма. Костная ткань выполняет в организме две основных функции: механическую и метаболическую (John D., et. al, 2005). Механическая функция костной ткани - формирование скелета, который является пассивной частью опорнодвигательной системы, а также обеспечивает защиту жизненно важные органов (Обухова Л.А., Чевагина Н.Н., 2009). Метаболическая функция костной ткани - это, в первую очередь, депонирование кальция и фосфора и поддержание постоянства внутренней среды организма (Taichman R.S., 2005). В костной ткани может содержаться до 90% всего кальция организма. Также она способна депонировать микроэлементы, играющие важную роль в метаболических процессах в организме, такие как цинк, медь, алюминий, марганец, барий и др. (Слуцкий Л.И. 1989; Березов Т.Г. Коровкин Б.Ф. 1998; Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А., 2002; Улумбеков Э.Г., Челышева Ю.А., 2002).
В структуре костной ткани макроскопически выделяют губчатое и компактное вещество (Кирилова И.А. 2011). Микроскопически различают три типа костной ткани: дентиноидную, грубоволокнистую или незрелую и пластинчатую или зрелую костные ткани. Эти разновидности костной ткани различаются строением межклеточного вещества (Burchardt Н. 1983; Заварзин А.А. 2000).
Особенностью дентиноидной костной ткани является отсутствие в толще ее межклеточного вещества костных клеток. У высших позвоночных единственный пример такой ткани это дентин зуба (Заварзин А.А., 2000).
Незрелая костная ткань встречается преимущественно у зародышей. Во взрослом организме ее можно обнаружить в местах черепных швов, в участках прикрепления сухожилий к костям. В незрелой костной ткани коллагеновые волокна расположены неупорядоченно и образуют толстые пучки (Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. 2002; Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н. 2007).
Зрелая костная ткань формирует губчатое и компактное вещество плоских и трубчатых костей скелета, имеет низкую клеточную плотность и упорядоченное расположение коллагеновых фибрилл, которые образуют пластинки. В компактном веществе пластинки формируют концентрические цилиндры - остеоны, а также располагаются на периферии кортикального слоя и между остеонами. В губчатом веществе они образуют трабекулы (Фигурская М. 2007; Киченко А.А. и др. 2011). Во взрослом скелете человека соотношение компактной кости к губчатой равно 4 : 1 (Eriksen E.F., Axelrod D.W.,MelsenF. 1994).
Костная ткань, как и любая соединительная ткань, состоит из клеток и межклеточного вещества. В костной ткани выявлены две линии клеток - это клетки остеобластического ряда и остеокласты (Rauch F. 2006). Они принадлежат к разным клеточным линиям, не имеющим во взрослом организме общих клеток-предшественников, каждая из этих линий снабжена собственными стволовыми клетками (Франке Ю., Рунге Г. 1995; Liao X., et al. 2011). Стволовые стромальные клетки костного мозга являются родоначальниками дифферона клеток остеобластического ряда, который выглядит следующим образом: стволовые клетки, преостеобласты, остеобласты, остеоциты (Pittenger M.F., et al. 1999; Oranger A. , et al. 2014). Остеокласты являются разновидностью макрофагов и развиваются из стволовых клеток крови (Boyle W.J., et al. 2003; Воусе B.F., et al. 2009). В настоящее время принято выделять следующие основные функциональные свойства каждого вида клеток: преостеобласты или камбиальные клетки служат источником остеобластов; остеобласты синтезируют органический матрикс; остеоциты формируют единую транспортную сеть костного матрикса; остеокласты резорбируют костный матрикс (Лоренс Риггз Б., Джозеф Мелтон Л.Ш., 2000; Заварзин А.А., 2000; Vaananen, et al, 2000; Взаимосвязанное функционирование остеокластов и остеобластов образуют сложный процесс, называемый костным ремоделированием. Благодаря этому процессу кость является динамической системой, активно участвующей в метаболических и регенерационных процессах в организме (Корж А.А., Дедух Н.В., 2006). Ежегодно в организме человека перестраивается до 10% общего объема костной ткани (Картамышева Н.Н., Чумакова О.В., 2004; Proff P., Romer Р., 2009; Базарный В.В. и др. 2010). Костное ремоделирование играет ключевую роль в поддержании параметров минерального гомеостаза (Аврунин А.С. и др., 2001).
Межклеточное вещество костной ткани называют костным матриксом, который составляет 90% массы кости (Post Т.М. et al, 2010). Он состоит из неорганической, органической частей и воды (Robey G.P., 1999). Химический состав костного матрикса представлен в таблице 1 (Островский О.В., Храмов В.А., Попова Т.А., 2010). F" 0,5 Неорганический компонент костной ткани определяет ее специфику и наделяет уникальными механическими свойствами. Благодаря своей структуре костный матрикс обладает огромной механической прочностью (Корнилов Н.В., Аврунин А.С., 2001). Неорганическая часть костного матрикса составляет около 65% массы костной ткани и содержит порядка 98% всех неорганических веществ организма (Boivin G., Meunier P.J., 2003). Она в основном состоит из двух химических элементов - кальция и фосфора, образующих кристаллы гидроксилапатита, а также входящих в состав других неорганических веществ (Улумбеков Э.Г., Челышева Ю.А., 2002; Bonucci Е., 2007).
Гидроксиапатит - это преобладающая часть минерализованного матрикса, в меньших количествах костная ткань содержит аморфный фосфат кальция (Аврунин А.С., Корнилов Н.В., Иоффе И.Д., 2000).
Содержание аморфного фосфата кальция зависит от возраста, и может колебаться в широком диапазоне. Его содержание может преобладать в раннем возрасте, в зрелой же костной ткани преобладает кристаллический гидроксилапатит. Аморфный фосфат кальция является лабильным резервом ионов кальция и фосфата (Березов Т.Г. Коровкин Б.Ф., 1998). В состав неорганической части кости также входят бикарбонаты, цитраты, фториды, соли калия, магния, натрия, меди, цинка, железа, стронция, никеля и др. микроэлементы (Мухамеджанов Л.Р., Галиев И.М., 2004; Крымова Т.Г., Колкутин В.В., Добровольская М.В., 2007; Власов А.Ю., Апагуни А.Э., Воронков В.А., 2009). В кости содержится более 50% магния, 40% натрия и 19% микроэлементов всего организма (Bala Y., Farlay D., Boivin G., 2013).
Органическое вещество костей состоит примерно на 90% из коллагена I типа, от 3% до 8% массы приходятся на неколлагеновые белки кости и фосфолипиды, 1% составляют кислые и нейтральные гликозаминогликаны (Brodsky В., Persikov A.V., 2005; Лунева С.Н., Накоскин А.Н., 2004). Прочностные свойства костной ткани определяются совокупностью трех компонентов: коллаген - прочность, протеогликаны - эластичность, кристаллы гидроксиапатитов - жесткость. Подробный состав органического матрикса кости представлен в таблице 2 (Clarke В., 2008; Риге Мелтон III Л. Дж., 2000; Tarnma R., Carbone С, Colucci S., 2014; Grazyna E.S., Deepak V., 2012).
Коллаген, помимо минерального компонента, является основным фактором, характеризующим механические свойства кости (Paschalis E.P.et al., 2004). Молекула коллагена является гетерополимером, состоящим из двух а 1(1)- и одной а2(1)-цепей, первичная структура которых складывается из повторяющейся последовательности триплетов аминокислот глицин-X-Y, где X и Y позиции чаще заняты, соответственно, пролином и гидроксипролином (Viguet-Carrin S., Garnero P., Delmas P.D., 2006; Paschalis E.P.et al, 2003).
Костный матрикс образован коллагеном типа I, хотя были обнаружены в следовых количествах коллагены V, XI, XII типов, так называемые, минорные коллагены. Минорные коллагены принимают участие в регуляции диаметра образующихся фибрилл коллагена I типа (Niyibizi С, Eyre D.R.,1994; Niyibizi С, Eyre D.R., 1989).
Сухожилия и кожа также содержат в составе коллаген I типа. Но коллаген костной ткани обладает характерными особенностями. Он содержит больше оксипролина, чем коллаген сухожилий и кожи. Также отличительной чертой костного коллагена является наличие большого числа межцепочечных поперечных сшивок и, как следствие, меньшая растворимость. Характерной чертой костного коллагена является повышенное содержание фосфата, связанного с остатками серина (Лоренс Риггз Б., Джозеф Мелтон Л.III., 2000)
Способ получения низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных
Костную ткань, выделенную из диафизарной части бедренной кости, освобожденную от мягких тканей и костного мозга замораживали с использованием жидкого азота и измельчали до частиц с диаметром менее 1 мм. Навеску массой 100 г измельченной костной ткани деминерализовали 1,5 М раствором соляной кислоты с добавлением йодацетата. Раствор соляной кислоты добавляли порциями по 100 - 200 мл до стабилизации рН, после чего отделяли осадок от раствора. Для получения белковой фракции 3,5 - 14 Ша фильтрованный через бумажный фильтр (белая лента) надосадочный раствор подвергался диализу с помощью установки с двойной диализной пленкой CelluSep (США). Внутренняя диализная пленка устройства пропускала белки с массами до 14 кДа, внешняя - до 3,5 кДа. Диализ проводили против дистиллированной воды. После диализа раствор, находившийся между диализными пленками, высушили с помощью низкотемпературной вакуумной лиофильной сушки Heto Liolab 3000 (Дания). Таким образом был получен препарат лиофилизированных низкомолекулярных неколлагеновых белков костной ткани с молекулярной массой менее 14 кДа.
При получении и исследовании образцов низкомолекулярных костных белков использовали хроматографическую систему LC-20 Prominence Shimadzu (Япония) для высокоэффективной жидкостной хроматографии, представленную насосом высокого давления серии LC-20 АР, блоком автоинжектора SIL-10 АР, ультрафиолетового детектора SPD-20 А, коллектора фракций FRC-10 А и колонки Shodex (США) Protein KW-2002.5 для гель-проникающей хроматографии, IEC QA-2825 для анионообменной хроматографии и IEC SP-2825 для катионообменной хроматографии. В качестве элюента использовали буферный раствор трис(гидроксиметил)аминометан - соляная кислота (Трис-НС1) концентрацией 100 ммоль/л и рН = 7,5. Для ионообменной хроматографии был использован фосфатный буфер концентрацией 20 ммоль/л. Буфер для катионообменной хроматографии имел рН = 6,8. Линейный градиент концентрации элюирующего раствора создавали использованием 0,00 - 1 М хлористого натрия в 20 мМ фосфатном буфере с соответствующим рН. В качестве калибровочных растворов для гель-проникающей хроматографии использовали набор маркеров молекулярной массы Sigma-Aldrich (США) MWGF 200-1КТ. Закалываемый объем пробы не превышал 1 мл, а концентрация белковых препаратов 40 мг/мл. Скорость потока для гель-проникающей хроматографии - 2 мл/мин, для ионообменной - 3 - 5 мл/мин.
Перелом верхней трети голени осуществляли путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности под диэтиловым наркозом. В соответствии с Патентом РФ № 2456927 от 27 июля 2012 года предварительно наркотизированное животное укладывали на приборном столе на животе. Далее фиксировали голень медиальной стороной на краю приборного стола, находили точку перелома кости в верхней трети голени и затем проводили перелом костей голени путем механического воздействия, перпендикулярно прикладываемого на продольную ось большеберцовой кости, до появления характерного звука перелома, при наличии которого судят об осуществлении перелома. Отсутствие смещения отломков отмечают визуально по сохраненной после манипуляции продольной оси голени. Для исследований собирали сыворотку крови, полученную центрифугированием цельной крови при 3000 об./мин. В сыворотке крови изучали содержание общего белка, глюкозы, неорганического фосфата, общего кальция, магния, активность щелочной фосфатазы, тартратрезистентной кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы. Содержание общего кальция, неорганического фосфата, магния определяли на автоматическом анализаторе Hitachi 902 (США), используя наборы реактивов фирмы «Vital Diagnostics Spb». Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом (Данилова Л.А., 2003). Для исследования активности щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы использовали наборы фирмы «Vital Diagnostics Spb» и анализатор «Stat Fax 1904 Plus» (США). Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозооксидазным методом наборами реагентов «Глюкоза - ФКД» ООО «Фармацевтика и клиническая диагностика».
В костной ткани оценивали изменение содержания воды, кальция и фосфора. У мышей экспериментальных и интактной групп выделяли болыпеберцовую кость обеих конечностей, очищали от остатков мышц и соединительной ткани, помещали в пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивали в течение суток на низкотемпературной вакуумной сушке Heto Lyolab-2000 (Дания). Высушенную костную ткань измельчали в фарфоровой ступке до гомогенного состояния. В гомогенате костной ткани определяли содержание минеральных компонентов - кальция и фосфатов. Минеральные компоненты определяли после сухого озоления навески кости в муфельной печи при температуре 800 С в течение 4 часов. Золу растворяли в 1 мл концентрированной хлороводородной кислоты, количественно переносили в мерные центрифужные пробирки, нейтрализовали раствором щелочи и доводили объем до 10 мл. В полученных растворах определяли концентрацию фосфатов с молибдатом аммония и кальция с о-крезолфталеином наборами реагентов фирмы «Vital Diagnostics SPb».
В печени и мышцах оценивали содержание гликогена. Определение содержания гликогена проводили по следующей методике. К навеске ткани 25-100 мг добавляли 1 мл 30% раствора гидроксида калия и оставляли на водяной бане до растворения, затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли 3 мл этилового спирта и 200 мкл 10% раствора сульфата натрия. Смесь оставляли в темном холодном месте на сутки. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 1500 об./мин. и растворяли в 2,5 мл воды. Далее в полученном растворе проводили определение гликогена с антроновым реактивом (Северин С.Е., Соловьева Г.А., 1989.).
Метод оценки содержания гликогена в печени и мышечной ткани экспериментальных животных
На 3-й сутки после перелома конечности у животных контрольной группы в костной ткани травмированной конечности наблюдалось увеличение содержания воды на 25% и снижение содержания кальция и неорганического фосфата в среднем на 16%. В опытной группе внутрибрюшинное введение фракции препарата КНБКТ свиньи, обладающей сродством к катионообменнику, на 3-й сутки после введения вызывало достоверное увеличение содержания компонентов гидроксилапатита - неорганического фосфата и кальция в костной ткани животных реципиентов по сравнению с контрольными значениями. По сравнению с интактной группой содержание кальция в костной ткани животных опытной группы было ниже, а содержание воды и неорганического фосфата возросло. Выделение фракции, обладающей сродством к катионообменнику, из препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка С помощью катионообменной хроматографии из препарата белков костной ткани быка нами была получена фракция, элюирующаяся в интервале времени выхода 44 - 47 мин., что представлено на рисунке 13. Используя гель-проникающую хроматографию, был изучен состав этой фракции. Хроматографический профиль, полученный при гель-проникающей хроматографии фракции, выделенной с помощью катионообменной хроматографии, представлен на рисунке 14. Время выхода пиков и рассчитанная молекулярная масса компонентов фракции препарата КНБКТ быка, обладающей сродством к катионообменнику, полученные с помощью гель-проникающей хроматографии, представлены в таблице 16.
Хроматографический профиль фракции, обладающей сродством к катионообменнику, препарата низкомолекулярных белков костной ткани быка, полученный с использованием гель-проникающей хроматографии на колонке Shodex Protein KW-2002.5, скорость потока 2,5 мл/мин, светофильтр 276 нм.
Время выхода пиков и рассчитанная молекулярная масса компонентов фракции, обладающей сродством к катионообменнику, препарата низкомолекулярных белков костной ткани быка, полученный с использованием гель-проникающей хроматографии на колонке Shodex Protein KW-2002.5, скорость потока 2,5 мл/мин, светофильтр 276 нм. Время выхода, мин Молекулярная масса, кДа
На полученном хроматографическом профиле фракции, обладающей сродством к катионообменнику, препарата КНБКТ быка имеется пять ярко выраженных пиков. Наибольшей высотой обладают пики, принадлежащие пептидам с молекулярной массой 14,11 кДа и 7,91 кДа. В составе выделенной на катионообменнике фракции костных белков быка присутствуют три пептида, которые ввиду низкой концентрации не дали хроматографический сигнал при анализе этого препарата на гель-проникающей хроматографии. Рассчитанные молекулярные массы этих пептидов составляют 14,11 кДа, 7,91кДаи4,62кДа.
Изменения биохимических показателей сыворотки крови и минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей на 3-й сутки после внутрибрюшинного введения фракции, обладающей сродством к катионообменнику препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка
Биологическое действие фракции препарата костной ткани быка, обладающей сродством к катионообменнику, было исследовано в эксперименте на лабораторных мышах с моделью перелома голени. В результате проведенного эксперимента были выявлены изменения биохимических показателей сыворотки крови и минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей на 3-й сутки после введения полученной фракции дозой 1 мг/кг массы животного. В таблице 17 представлены биохимические показатели сыворотки крови лабораторных мышей на 3-й сутки после внутрибрюшинного введения исследуемой фракции. В таблице 18 представлено содержание минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей на 3-й сутки после внутрибрюшинного введения фракции белков костной ткани свиньи, полученной с помощью катионообменной хроматографии. Таблица 17 - Биохимические показатели сыворотки крови лабораторных мышей с моделью перелома голени на 3 сутки после внутрибрюшинного введения фракции белков костной ткани быка, полученной с помощью катионообменной хроматографии на колонке Shodex IEC SP-2825. Показатель Группа \ ЩФ,Е/л ТрКФ,Е/л Са2+, ммоль/л РО43-,ммоль/л ОБ,г/л Интакт 109,8 85,6-137,1 5,7 5,2-6,6 2,12 1,66-2,31 2,15 1,79-2,48 49,56 46,41-55,74 Контрольная группа 85,5 76,9-113,3 4,97 4,10-6,21 2,73 2,66-2,85 2,55 2,40-3,06 59,5 54,3-66,9 Опытная группа 97,8 88,9-113,5 1,9 1,7-2,1 2,15 1,72-2,29 2,53 2,44-2,65 57,15 53,6-62,0 Примечание: данные представлены в виде медианы; 25- и 75-процентиль - достоверные отличия при уровне значимости р 0,05 в сравнении с контрольным значением - достоверные отличия при уровне значимости р 0,05 в сравнении с интактным значением
Введение фракции препарата КНБКТ быка, обладающей сродством к катионообменнику, вызвало достоверное снижение активности ТрКФ -основного маркера резорбции, которое сопровождалось увеличением содержания неорганического фосфата в сыворотке крови животных опытной группы относительно интактных значений. Показатели активности ТрКФ, содержание общего кальция и неорганического фосфата сыворотки крови животных опытной группы меньше контрольных значений, что говорит о подавлении процесса резорбции костной ткани. Однако введение данного препарата не приводит к стимуляции активности остеобластов, так как достоверных изменений активности щелочной фосфатазы относительно интакной и контрольной групп не наблюдалось.
Сравнение биологического действия фракций препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани свиньи и быка, обладающих сродством к катионообменнику
В условиях современной цивилизации травмы опорно-двигательной системы являются одной из самых распространенных причин, ведущих к инвалидности и смерти. По данным статистики ВОЗ, тяжелые механические травмы среди причин смертности уступают лишь опухолям и сердечнососудистым заболеваниям, особенно у лиц моложе 45 лет (Рынденко СВ. и соавт., 2010; Бюллетень ВОЗ №310: Десять ведущих причин смерти в мире, 2014). Поэтому в настоящее время сокращение сроков лечения больных ортопедотравматологического профиля остается одной из важнейших проблем современности. Актуальной проблемой остается поиск остеопластических материалов и средств стимуляции репаративных процессов в костной ткани (Кирилова И.А., Фомичев Н.Г. и соавт., 2007).
Несмотря на то, что «золотым стандартом» ортопедии является применение аутогенных материалов, продолжает расти интерес к применению костной ткани млекопитающих животных в качестве сырья для получения остеоиндуктивных биоматериалов (Зайдман A.M., Тихонов В.Н., 2011; Кирилова И.А., 2004). Но в то же время существует недостаток информации в вопросах строения костной ткани разных видов животных. В связи с этим целью нашей работы было фракционировать низкомолекулярные белки костной ткани различных видов млекопитающих животных и экспериментально установить их действие на репаративный остеогенез.
Первой задачей исследования было разработать методику получения КНБКТ млекопитающих животных. Методика выделения белков костной ткани заключалась в последовательном использовании кислотной деминерализации раствором соляной кислоты, фракционирования содержимого надосадочной жидкости посредством диализа через двойную диализную пленку против дистиллированной воды и лиофилизация полученной фракции. Таким образом, были получены препараты КНБКТ домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus)
Затем был проведен сравнительный анализ полученных препаратов костной ткани вышеперечисленных видов животных с помощью гель-проникающей и ионообменной хроматографии с целью выявления качественных особенностей в их составе.
Гель-проникающая хроматография продемонстрировала идентичность качественного состава препаратов КНБКТ исследованных млекопитающих животных. Во всех препаратах костных белков в значительных количествах содержится пептид с молекулярной массой 0,32 кДа. Содержание этого пептида в препарате костных белков кролика максимально по сравнению с препаратами других видов животных. Препараты белков костной ткани кролика, свиньи и собаки имеют в составе общий пептид с молекулярной массой в области 4,6 - 6,5 kDa. В препарате костной ткани быка подобный пептид содержится в значительно меньшем количестве.
Несмотря на идентичный качественный состав, количествнное содержание пептидов вырьируется в широком диапазоне. Так в препарате костной ткани собаки количественное содержание белка в 1,6 - 2,3 раза больше по сравнению с препаратами костной ткани других животных. Наименьшим количественным содержанием белка обладает препарат костной ткани быка.
Исследование состава препаратов КНБКТ собаки, быка свиньи и кролика с помощью анионообменной хроматографии подтвердило идентичность их состава. Большинство пептидов в составе полученных препаратов обладают сродством к анионообменнику и, в то же время, обладая низким сродством к катионообменнику.
Второй задачей исследования было выявить на модели перелома голени у лабораторных мышей линии СВА возможность применения низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных для стимуляции репаративного остеогенеза. Для оценки остеоиндуктивных свойств мы использовали следующие биохимические показатели сыворотки крови и содержание минеральных компонентов костной ткани - активность ТрКФ и ЩФ, содержание общего кальция, неорганического фосфата в сыворотке крови и костной ткани травмированной конечности. Также мы изучали изменения показателей энергетического обмена - содержание гликогена в мышцах и печени, уровень глюкозы в сыворотки крови и активность ЛДГ. По данным критериям возможно получить информацию об интенсивности процессов, протекающих в области перелома и оценить общее биологическое действие фракций полученных препаратов костной ткани млекопитающих животных.
Исследование было проведено на 230 лабораторных мышах линии СВА. 195 мышам моделировали перелом костей голени, путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности.
Эксперимент был проведен в два этапа. На первом этапе было проведено сравнение биологического действия препаратов КНБКТ быка и свиньи. Костная ткань этих животных в настоящее время наиболее часто используется для получения остеопластических материалов (Панин A.M., 2004; Фарзин Н., 2005). Из препарата КНБКТ данных животных были получены фракции, сорбирующиеся на катионообменнике. Затем был проведен биохимический эксперимент на мышах с моделью перелома голени для сравнения остеоиндуктивных свойств полученных фракций. Забор биологического материала проводился на 3-й сутки после введения полученных препаратов костных белков.