Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Физиологические факторы, регулирующие миозиновый фенотип скелетной мышцы 11
1.2 Молекулярные механизмы регуляции экспрессии изоформ ТЦМ 12
1.3 Миозиновый фенотип в условиях реальной или моделируемой гравитационной разгрузки 27
1.4 Динамика экспрессии различных миозиновых изоформ в камбаловидной мышце в процессе вывешивания 29
1.5 Молекулярные механизмы экспрессии медленной изоформы ТЦМ при вывешивании 30
2. Организация и методы исследований 39
2.1 Объект исследования 39
2.2 Антиортостатическое вывешивание 39
2.3 Введение L-аргинина и L-аргинина совместно с ингибитором NO-синтазы крысам на фоне 7-суточного вывешивания 40
2.4 Введение ингибитора киназы GSK-3 крысам на фоне 7-суточного вывешивания 42
2.5 Механическая стимуляция опорных зон стопы 43
2.6 Проведение опорной механической стимуляции стопы крыс на фоне 1-суточного и 3-х суточного вывешивания. 44
2.7 Проведение опорной механической стимуляции стопы крысам на фоне 7-суточного вывешивания и введение ингибитора NO-синтазы на фоне опорной механической стимуляции. 45
2.8 Проведение 14-суточного вывешивания 46
2.9 Введение ингибитора МАП-киназы p38 на фоне 3-х суточного вывешивания 47
2.10 Методы обработки биоматериала и анализ данных 47
2.10.1 Выделение ядерной, цитоплазматической и тотальной белковых фракций мышцы 47
2.10.2 Электрофорез с последующим Вестерн-блоттингом 48
2.10.3 Иммуногистохимический анализ поперечных криосрезов мышцы 50
2.10.4 Анализ экспрессии генов 51
2.10.5 Определение уровня оксида азота в миоплазме камбаловидных мышц 52
2.10.6 Статистический анализ данных 53
3. Результаты исследования 54
3.1 Содержание в мышечных ядрах NFATc1 и транскрипционная активность NFATc1 после 1,3,7 и 14 суток вывешивания 54
3.2 Роль снижения уровня оксида азота при вывешивании в инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 после 7 суток вывешивания: GSK-3 -зависимые и GSK-3 -независимые механизмы 57
3.4 Влияние опорной механической стимуляции на функционирование сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 1 и 3 суток вывешивания 68
3.5 Влияние опорной механической стимуляции на функционирование сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 7 суток вывешивания: роль NO-синтазы. 79
3.6 Влияние ингибирования МАП-киназы p38 на содержание в мышечных ядрах NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 3 суток вывешивания 85
4. Обсуждение результатов 91
4.1 Содержание в мышечных ядрах транскрипционного фактора NFATc1 и и транскрипционная активность NFATc1 после 1,3,7 и 14 суток вывешивания 91
4.2 Роль снижения уровня оксида азота при вывешивании в инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 после 7 суток вывешивания 94
4.3 Опорная механическая стимуляция предотвращает инактивацию сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 и снижение экспрессии медленной изоформы ТЦМ после 1 и 3 суток вывешивания 96
4.4 Опорная механическая стимуляция предотвращает инактивацию сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 и снижение экспрессии медленной изоформы ТЦМ после 7 суток вывешивания, при этом ингибирование NO-синтазы блокирует данные эффекты 98
4.5 Влияние ингибирования МАП-киназы p38 на содержание в мышечных ядрах NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 3 суток вывешивания 100
Выводы 102
Список сокращений 103
Список литературы 105
- Молекулярные механизмы регуляции экспрессии изоформ ТЦМ
- Роль снижения уровня оксида азота при вывешивании в инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 после 7 суток вывешивания: GSK-3 -зависимые и GSK-3 -независимые механизмы
- Влияние ингибирования МАП-киназы p38 на содержание в мышечных ядрах NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 3 суток вывешивания
- Влияние ингибирования МАП-киназы p38 на содержание в мышечных ядрах NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 3 суток вывешивания
Молекулярные механизмы регуляции экспрессии изоформ ТЦМ
Тоническая активность волокон скелетных мышц сопровождается повышением базального уровня кальция в волокне, увеличенной продукцией оксида азота II (NO), а также снижением соотношения АТФ/АДФ [1]. Данные вторичные мессенджеры запускают ряд сигнальных каскадов, приводящих в конечном итоге к изменениям в экспрессии генов и соответствующей перестройке мышечного волокна, и играют ключевую роль в запуске процессов адаптации мышцы к тому или иному режиму активности.
В настоящее время наиболее изученными являются два сигнальных каскада, регулирующих экспрессию медленной изоформы ТЦМ: кальцинейрин/NFATc1 и MEF-2/HDAC4. Их взаимодействие позволяет мышечному волокну обеспечивать тонкую настройку регуляции экспрессии медленной изоформы ТЦМ в ответ на действие различных физиологических сигналов [42].
Кальцинейрин представляет собой серин/треониновую фосфатазу, активируемую Ca2+-кальмодулиновым комплексом. Аминокислотная последовательность кальцинейрина высоко консервативна среди эукариот [43]. Кальцинейрин представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической (кальцинейрин А, 58-69 кД) и регуляторной (кальцинейрин B, 16–19 кД) субъединиц [44]. Регуляторная субъединица кальцинейрина содержит 4 кальций связывающих EF-домена. Каталитическая субъединица содержит 4 функциональных домена: непосредственно каталитический, включающий в себя участок взаимодействия с субстратом; участок связывания регуляторной субъединицы (кальцинейрина B); участок связывания кальций-кальмодулинового комплекса; автоингибирующий участок [45]. Возрастание внутриклеточной концентрации кальция приводит к связыванию ионов кальция соответствующими участками регуляторной субъединицы, что ведёт к изменению конформации гетеродимера кальцинейрина и открытию кальмодулин-связывающего участка каталитической субъединицы для доступа кальций-кальмодулинового комплекса [46]. После связывания каталитической субъединицы с кальций-кальмодулиновым комплексом происходит отсоединение её автоингибиторного домена от каталитического участка и субстрат кальцинейрина получает доступ к активному центру фермента [47].
Частичный протеолиз кальцинейрина кальций-зависимой протеазой кальпаином-1 может приводить к отщеплению от каталитической субъединицы автоингибиторного домена и к образованию конститутивно активной формы фермента, которая состоит из 47-кДа фрагмента кальцинейрина А и кальцинейрина В [48]. Показано, что протеолиз кальцинейрина А кальпаином-1 в кардиомиоцитах приводит к транслокации конститутивно активной формы кальцинейрина А в ядра и активации транскрипционной активности NFAT [49].
Одним из субстратов кальцинейрина являются транскрипционные факторы семейства NFAT (ядерный фактор активации Т-лимфоцитов, цитоплазматический). В скелетных мышцах кальцинейрином регулируются четыре транскрипционных фактора данного семейства, NFATcl-NFATc4 [50]. Дефосфорилирование ряда сериновых остатков, расположенных у N-конца молекул NFAT в серин-пролиновом (SP) повторе приводит к изменению конформации данных молекул, экспонированию участков ядерной локализации (NLS) и транслокации в ядро [6, 50]. Внутри ядра NFATc1 связывается с промотором гена медленной изоформы ТЦМ myh7 и активирует транскрипцию этого гена, взаимодействуя с другими транскрипционными коактиваторами, такими как MEF-2D, ацетилтрансфераза p300 и транскрипционный фактор MyoD [51]. Также существуют данные о том, что в активации транскрипции гена медленной изоформы ТЦМ могут принимать участие транскрипционные факторы TEAD1 [52] и MEF-2C [53]. В работе Calabria и соавторов было проведено исследование влияния различных изоформ NFAT на активность экспрессии мРНК генов ТЦМ в волокнах скелетных мышц крысы: авторы работы установили, что экспрессия ТЦМ I зависит только от NFATc1, при этом для поддержания экспрессии ТЦМ IIa и ТЦМ IId/x необходимы NFATc1, NFATc2 и NFATc4. Экспрессия наиболее «быстрой» из изоформ ТЦМ, ТЦМ IIb, зависит лишь от наличия в волокне изоформы NFATc4 [54]. Тем не менее, было показано, что оверэкспрессия NFATc1 может подавлять экспрессию ТЦМ IIb и ТЦМ IId/x в культивируемых миотубах C2C12 [55], а блокирование транслокации NFAT в мышечные ядра с помощью ингибитора кальцинейрина циклоспорина А приводит к активации экспрессии ТЦМ IIb и ТЦМ IId/x в скелетных мышцах крыс [56]. NFATc1 также способен репрессировать активность транскрипционного фактора MyoD, принимающего участие в экспрессии быстрых изоформ ТЦМ [57]. В экспериментах с флуоресцентными репортерами транскрипционной активности NFATc1 in vivo в скелетных мышцах крыс показано, что NFATc1 является сенсором нервно-мышечной активности скелетных мышц: уровень NFATс1-зависимой транскрипции был выше в медленных мышцах в сравнении с быстрыми, при этом в денервированных медленных мышцах его транскрипционная активность снижалась, а при низкочастотной электростимуляции денервированных мышц восстанавливалась. При этом при высокочастотной электростимуляции, соответствующей режиму работы быстрых скелетных мышц, восстановления NFATc1-зависимой транскрипции не происходило [7].
В опытах с флуоресцентным мечением самой молекулы NFATc1 показано, что в камбаловидной мышце NFATc1 локализован преимущественно в мышечных ядрах; при этом уже два часа полной неподвижности камбаловидной мышцы приводят к его экспорту из ядер. При низкочастотной электростимуляции «быстрых» мышц, NFATc1, в быстрых мышцах локализованный преимущественно в цитоплазме, перемещается в мышечные ядра [58]. В экспериментах Calabria и соавторов, в которых изучалось перемещение в ядро различных изоформ NFAT в зависимости от вида электростимуляции в волокнах преимущественно «быстрой» мышцы extensor digitorium longus, было показано, что в покое в ядрах мышечных волокон данной мышцы находится только изоформа NFATc4. При низкочастотной электростимуляции в ядрах локализуются все четыре изоформы NFAT, тогда как при высокочастотной стимуляции, моделирующей активность быстрых двигательных единиц, в ядрах локализуются NFATc3, NFATc4 и, в меньшей степени, NFATc2 [54]. Таким образом, транскрипционные факторы NFAT совместно управляют экспрессией различных миозиновых изоформ в соответствии с режимом сократительной активности скелетной мышцы.
Ферментативная активность кальцинейрина регулируется рядом белковых эндогенных ингибиторов. Наиболее известными из ингибиторов кальцинейрина, экспрессирующихся в скелетных мышцах, являются белки семейства MCIP (также известные как RCAN и DSIR) (модулирующие взаимодействующие с кальцинейрином белки). Экспрессия MCIP1 и MCIP2 в наибольшей степени характерна для медленных скелетных волокон, при этом данные белки могут локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме скелетных волокон [59]. Белки MCIP связываются с каталитической субъединицей кальцинейрина за счёт последовательностей, гомологичных участкам связывания с кальцинейрином молекулы NFAT, и таким образом действуют как конкурентные ингибиторы взаимодействия кальцинейрина с NFAT [59]. Экспрессия гена MCIP2 активируется гормонами щитовидной железы, что, возможно, является одним из механизмов снижения уровня экспрессии медленной ТЦМ при гипертиреоидизме [60, 61]. Экспрессия MCIP1 не зависит от активности гормонов щитовидной железы, однако экспрессия изоформы MCIP1.4 активируется NFAT, таким образом регулируя активность кальцинейрина по принципу отрицательной обратной связи [60]. В скелетных мышцах кальцинейрин могут также ингибировать кальсарцины (FATZ, миозенины). Кальсарцин-1 и кальсарцин-3 (в медленных волокнах) и кальсарцин-2 (в быстрых волокнах), иммобилизуют кальцинейрин на Z-диске саркомера. [62, 63].
Ещё одним регулятором активности кальцинейрина в скелетной мышце является белок миосприн, также локализующийся в Z-диске [64]. Показано, что нокаут гена кальсарцина-2 у мышей способствует активации сигнального пути кальцинейрин/NFAT и изменению миозинового фенотипа в «медленную» сторону [65].
Роль снижения уровня оксида азота при вывешивании в инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 после 7 суток вывешивания: GSK-3 -зависимые и GSK-3 -независимые механизмы
Для того, чтобы выявить роль снижения уровня оксида азота в камбаловидной мышце после 7-суточного вывешивания в снижении экспрессии ТЦМ I() и инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 был проведен эксперимент с введением донора оксида азота (L-аргинина) на фоне 7-суточного вывешивания. Для выявления NO-зависимых (а не аминокислотных) эффектов L-аргинина, применявшегося в качестве донора оксида азота, в эксперимент ввели дополнительную контрольную группу с совместным введением L-аргинина и ингибитора NO-синтазы L-NAME: NO-зависимыми считали лишь те эффекты введения L-аргинина, которые не проявлялись в группе с ингибированием NO-синтазы. Экспериментальные животные были случайным образом распределены по 4 экспериментальным группам: С – группа виварного контроля; 7HS – животные, вывешенные на протяжении 7 суток; 7HS+A – животные, вывешенные в течение 7 суток с ежедневной внутрибрюшинной инъекцией L-аргинина; 7HS+AN - животные, вывешенные в течение 7 суток с ежедневной внутрибрюшинной инъекцией 500 мг/кг L-аргинина и 50 мг/кг ингибитора NO-синтазы L-NAME. Для выявления роли NO-зависимой инактивации GSK-3 в данном предотвращении инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 был проведён эксперимент с фармакологическим ингибированием GSK-3 на фоне 7-суточного вывешивания. В данном эксперименте животные были разделены на 3 группы по 8 животных в каждой: С – группа виварного контроля, 7HS – группа, вывешенная на протяжении 7 суток, 7HS+G – группа, вывешенная на протяжении 7 суток с ежедневным внутрибрюшинным введением ингибитора GSK-3 AR-A014418.
Содержание NO в камбаловидных мышцах экспериментальных животных было измерено по методике, описанной в соответствующем разделе. Уровень оксида азота в камбаловидных мышцах вывешенных животных (7HS) был достоверно снижен на 56% в сравнении с контрольной группой (Рисунок 10.). В группе 7HS+A содержание оксида азота не имело достоверных отличий от группы виварного контроля. В вывешенной группе с введением L-аргинина и ингибированием NO-синтазы содержание оксида азота было достоверно снижено в сравнении с контрольной группой.
Экспрессия мРНК медленной изоформы ТЦМ и быстрой «окислительной» изоформы ТЦМ IIa после 7 суток вывешивания была достоверно снижена, а экспрессия мРНК «быстрых» изоформ ТЦМ IId/x и ТЦМ II B была достоверно повышена (Рисунок 11. A-Г.). В группе 7HS+A снижение экспрессии мРНК медленной изоформы ТЦМ было полностью предотвращено, а степень снижения экспрессии мРНК ТЦМ IIa и степень увеличения экспрессии мРНК ТЦМ IIB была несколько уменьшена. При этом введение L-аргинина не оказало влияния на экспрессию ТЦМ IId/x. В группе 7HS+N уровни экспрессии мРНК всех четырёх исследованных ТЦМ не отличались от группы 7HS: таким образом можно заключить, что все эффекты введения L-аргинина на экспрессию мРНК ТЦМ связаны с его NO-донорными свойствами.
Введение ингибитора GSK-3 привело к предотвращению снижения медленной изоформы ТЦМ в и частичному предотвращению снижения ТЦМ IIа в группе 7HS+G, однако не оказало влияния на экспрессию мРНК ТЦМ IIB и ТЦМ IId/x (Рисунок 12.). Рисунок 12 – ПЦР-анализ содержания медленной ТЦМ I() (А) и быстрых ТЦМ IIa (Б), ТЦМ IIb (В), ТЦМIId/x (Г) в группах C, 7HS, 7HS+G, - достоверные (p0,05) отличия от контрольной группы. & - достоверные отличия от группы 7HS.
Экспрессия мРНК MCIP1.4, которую во многих работах используют в качестве показателя уровня NFAT-зависимой транскрипции [59, 205, 206], достоверно снизилась в группе 7HS (Рисунок 13.). Введение L-аргинина частично предотвратило данный эффект: содержание мРНК MCIP1.4 в данной группе не имело достоверных отличий от контроля. В группе 7HS+N содержание мРНК MCIP1.4 не отличалось от значений группы 7HS. Рисунок 13 – ПЦР-анализ содержания мРНК MCIP1.4 в группах в группах C, 7HS, 7HS+A, 7HS+N - достоверные (p0,05) отличия от контрольной группы, & - достоверные отличия от группы 7HS.
Содержание NFATc1 в ядерной фракции было значительно снижено в группе 7HS в сравнении с контролем; введение L-аргинина предотвращало данные эффекты, тогда как введение L-NAME блокировало влияние L-аргинина (Рисунок 15.). Введение ингибитора GSK-3 предотвращало снижение содержания NFATc1 в ядерной фракции, а также снижение содержания мРНК MCIP1.4 в камбаловидных мышцах вывешенных животных (Рисунки 14, 16.).
Процент фосфорилирования Ser 9 GSK-3 в тотальной белковой фракции в группе 7HS был достоверно снижен на 58% по сравнению с контрольной группой; в группе 7HS+N фосфорилирование GSK-3 было достоверно снижено на 78% в сравнении с контрольной группой (Рисунок 17.). Поскольку фосфорилирование по Ser 9 снижает ферментативную активность GSK-3 [207], можно предположить, что активность GSK-3 в этих группах повышена в сравнении с контролем. В группе 7HS+A фосфорилирование GSK-3 составляло 129% от уровня контроля и не имело достоверных отличий от уровня контроля (Рисунок 17.). Рисунок 17 – Процент фосфорилирования GSK-3 по Ser 9 в группах C, 7HS, 7HS+A и 7HS+N по данным Вестерн-блота. - достоверные (p0,05) отличия от контрольной группы. & - достоверные отличия от группы 7HS.
Введение ингибитора GSK-3 не повлияло вызванное вывешиванием снижение уровня фосфорилирования GSK-3 (Рисунок 18.). Тем не менее, уровень фосфорилирования GSK-3 в группе 7HS+G не отражает её ферментативной активности, поскольку ингибитор GSK-3, применявшийся в данной группе, AR-A014418, ингибирует GSK-3, взаимодействуя с её ATФ-связывающим центром, а не воздействуя на фосфорилирование Ser 9 [208]. Рисунок 18 – Процент фосфорилирования GSK-3 по Ser 9 в группах C, 7HS, 7H+G по данным Вестерн-блота. - достоверные (p0,05) отличия от контрольной группы.
Активность кальцинейрина в скелетной мышце может регулироваться эндогенным ингибитором кальцинейрина, кальсарцином-2 [62].
Экспрессия мРНК кальсарцина-2 и содержание кальсарцина-2 в тотальной белковой фракции после 7 суток вывешивания достоверно возрастало в два раза в сравнении с контролем во всех вывешенных группах, за исключением группы 7HS+A, где экспрессия мРНК и содержание кальсарцина-2 не имели достоверных отличий от контроля (Рисунок 19 A, Б, Рисунок 20 А, Б.). Таким образом, можно сделать заключение, что уровень оксида азота в скелетной мышце регулирует экспрессию кальсарцина-2, при этом (поскольку в группе 7HS+G экспрессия кальсарцина-2 не отличается от группы 7HS), данная регуляция осуществляется независимо от GSK-3. Рисунок 21. Содержание MEF-2D в ядерной фракции в группах в группах C, 7HS, 7HS+A и 7HS+N (А) и в группах С, 7HS, 7HS+G (Б) по данным Вестерн-блота. - достоверные (p0,05) отличия от контрольной группы
Содержание MEF-2D в ядерной фракции камбаловидных мышц было достоверно снижено после первых суток вывешивания, при этом ни введение L аргинина, ни ингибирование GSK-3 не предотвратило данное снижение (Рисунок 21 A, Б.).
Влияние ингибирования МАП-киназы p38 на содержание в мышечных ядрах NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 3 суток вывешивания
Для того, чтобы проанализировать роль активации МАП-киназы p38 в снижении экспрессии ТЦМ I() и инактивации сигнального пути кальцинейрин/NFATc1 после трёх суток вывешивания был проведён эксперимент с введением ингибитора МАП-киназы р-38 VX-745. Эксперимент был проведён совместно с группой исследования катаболических сигнальных путей лаборатории миологии под руководством Т.Л. Немировской. Экспериментальные животные были разделены на группу виварного контроля (С), группу трёхсуточного вывешивания (3HS) и группу трёхсуточного вывешивания с введением ингибитора МАП-киназы p38 (3HS+VX-745). После трёх суток вывешивания уровень фосфорилирования МАП-киназы p-38 по p-38 Tyr 180/Thr182 в группе 3HS был достоверно повышен на 150% в сравнении с группой контроля (Рисунок 42.). В группе 3HS+VX-745 уровень фосфорилирования МАП-киназы p-38 по p-38 Tyr 180/Thr182 был достоверно ниже, чем в группе 3HS, и не отличался от группы контроля (Рисунок 42.). С учётом того, что фосфорилирование МАП-киназы p-38 по p-38 Tyr 180/Thr182 активирует данную киназу [209], можно сделать заключение, что введение VX-745 на фоне вывешивания привело к снижению уровня активности МАП-киназы p-38.
После трёх суток вывешивания в группе 3HS экспрессия мРНК ТЦМ I() достоверно снизилась на 37% в сравнении с уровнем контроля; экспрессия мРНК ТЦМ II a снизилась на 58%, а экспрессия мРНК ТЦМ IIB и ТЦМ IId/x повысилась в 20 раз и в 14 раз, соответственно (Рисунок 43 A, Б, В, Г.). В группе трёхсуточного вывешивания с введением ингибитора (3HS+VX-745) экспрессия мРНК ТЦМ I() составляла 118% от группы контроля и достоверно отличалась от значений группы 3HS. Экспрессия трёх «быстрых» миозиновых изоформ не различалась в группах 3HS и 3HS+VX-745.
Содержание NFATc1 в группе 3HS было недостоверно снижено по сравнению с контрольной группой; тем не менее, экспрессия MCIP1.4 в данной группе была снижена на 82% от контроля (Рисунок 44, 45.). В группе 3HS+VX-745 содержание NFATc1 в ядерной фракции и экспрессия мРНК MCIP1.4 были достоверно повышены в два раза в сравнении со значениями группы 3HS (Рисунок 44, 45.). Рисунок 44 – ПЦР-анализ содержания мРНК MCIP1.4 в группах С, 3HS, 3HS+VX-745. - достоверные (p0,05) отличия от контрольной группы. & -достоверные отличия от группы 3HS.
Содержание TEAD1 и MEF-2D в ядерной фракции в группе 3HS было несколько ниже, чем в контроле, однако отличия между группами С и 3HS не были достоверными (Рисунок 46 A, Б.). В группе 3HS+VX-745 содержание TEAD1 составило 160% от контроля, и достоверно превышало значения групп С и 3HS (Рисунок 46 А)
Снижение содержания MEF-2D в группе 3HS+VX-745 было ещё более выраженным, чем в группе 3HS, и достоверно отличалось от контроля (Рисунок 46 Б.).
Влияние ингибирования МАП-киназы p38 на содержание в мышечных ядрах NFATc1 и экспрессию медленной изоформы ТЦМ после 3 суток вывешивания
Наблюдаемое увеличение уровня фосфорилирования МАП-киназы p-38 после третьих суток вывешивания (3HS) согласуется с ранее полученными данными, однако в цитируемых статьях данное увеличение исследовали после 7 суток вывешивания или на ещё более поздних сроках [12, 181]. Наблюдаемое увеличение экспрессии мРНК ТЦМ IId/x и IIB и снижение экспрессии мРНК ТЦМ IIa и медленной изоформы ТЦМ соответствует ранее полученным данным [13]. Увеличение содержания мРНК медленной изоформы ТЦМ в группе трехсуточного вывешивания с введением ингибитора МАП-киназы p-38 (3HS+VX-745) соотносится с данными Derbre и соавторов о предотвращении трансформации волокон камбаловидной мышцы в «быструю» сторону при применении аллопуринола, приводящего, в частности, к инактивации МАП-киназы p-38 [12].
Несоответствие между сниженной NFAT-зависимой экспрессией мРНК MCIP1.4 и содержанием NFATc1 в мышечных ядрах после трёх суток вывешивания можно объяснить задержкой во времени между транслокацией NFATc1 в ядро и накоплением мРНК NFAT-зависимых транскриптов. Согласно этому предположению, ингибирование МАП-киназы p-38 приводит к предотвращению снижения содержания ТЦМ I() и частичному предотвращению снижения экспрессии мРНК MCIP1.4 после третьих суток вывешивания за счёт предотвращения снижения содержания NFATc1 в мышечных ядрах на первые-вторые сутки вывешивания. Таким образом, мы обнаружили, что ингибирование МАП-киназы p-38 предотвращает вызываемое вывешиванием снижение содержания ТЦМ I() и приводит к увеличению содержания NFATc1 и TEAD1 в мышечных ядрах, а также к активации NFAT-зависимой транскрипции. Вероятно, эффект ингибирования МАП-киназы p-38 на экспрессию медленной изоформы ТЦМ связан с активацией NFAT-зависимых и/или TEAD-зависимых сигнальных механизмов.
Неясным остаётся вопрос о причинах активации p-38 при вывешивании. Существуют данные, позволяющие предполагать, что активация p-38 при вывешивании связана с повышением кальция в миоплазме камбаловидных мышц вывешенных животных и с соответствующей активацией CaMK II, активирующей p-38 [196]. В таком случае, p-38 может быть тем самым кальций-зависимым механизмом инактивации NFATc1 (хотя, возможно, этот механизм не является единственным, действующим в данных условиях).