Нейропротективное действие ключевых протеиназ гемостаза Горбачева Любовь Руфэльевна

Введение к работе

Актуальность проблемы

Исследование механизмов регуляции нейродегенеративных процессов при инсультах, травмах мозга, болезнях Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона и др., – одна из важнейших проблем современной физиологии, направленная на разработку новых подходов к лечению этих тяжелых заболеваний.

Известно, что система свертывания крови и её протеиназы одни из первых в организме осуществляют запуск сложной ответной реакции на повреждающее воздействие. Увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) при критических состояниях приводит к появлению в нервной ткани ключевых сериновых протеиназ системы свертывания крови, таких как тромбин, фактор Xа (ФХа) и активированный протеин С (АРС), у которых, наряду с протеолитической активностью в отношении специфических белковых субстратов, обнаружены свойства сигнальных молекул – клеточных регуляторов процессов воспаления, репарации тканей, в том числе нейрорепарации, нейродегенерации и др. (Esmon, 2005; Ossovskaya, Bunnett, 2004; Hollenberg, Houle 2005; Strukova, 2001, 2006). Более того, обнаружена экспрессия мРНК протромбина и ФХа в мозге. (Striggow et al., 2001; Wang et al., 2002; Pompili et al., 2004; Rohatgi et al., 2004).

Тромбин - ключевой фермент свертывающей системы крови, образуется в результате ограниченного протеолиза протромбина фактором Ха свертывания крови в участках повреждения ткани, в том числе нервной, при травме, ишемических и геморрагических инсультах, нарушении ГЭБ при воспалении, гипертензии, эпилептическом статусе. Тромбин может индуцировать ретракцию отростков нейронов, пролиферацию глии и модулировать процессы гибели нейронов, в зависимости от концентрации и времени воздействия (Струкова и др., 2005; Henrich-Noack et al., 2005). Функции другой сериновой протеиназы свертывания крови - ФХа - вне гемостаза и воспаления мало известны.

Сериновые протеиназы регулируют функции клеток через трансмембранные рецепторы, активируемые протеиназами (PARs), сопряженные с G-белками (Coughlin, 2000, 2005; Hollenberg, Houle, 2004; Saito, Bunnett, 2005). Протеиназы расщепляют одну пептидную связь во внеклеточном домене PAR и новый N-конец рецептора («привязанный лиганд») активирует рецептор. К настоящему времени клонированы четыре подтипа PAR (PAR1, 3, и 4 - рецепторы тромбина, PAR2 - рецептор трипсина, триптазы тучных клеток, ФXa и др.), но есть основания полагать, что это семейство имеет большое число подтипов PAR и агонистов. Экспрессия PARs обнаружена в областях мозга, наиболее уязвимых для ишемического повреждения, среди них - кора, стриатум, гипоталамус, гиппокамп и мозжечок (Rohatgi et al., 2004). Изменение экспрессии данных рецепторов наблюдали при травмах, воспалении и ишемии мозга. Данные о роли PAR и протеиназ гемостаза в травматическом и ишемическом повреждении мозга крайне противоречивы. Обнаружено, что при повреждении, нейровоспалении и ишемии активация PAR2 ведет к подавлению гибели клеток (Kawabata et al., 2005; Noorbakhsh, 2005), активация PAR1 - к повреждению мозга (Olson, 2004), а активация PAR1, PAR2 и PAR4 в астроцитах имеет нейропротективное действие (Wang et al., 2007). Тромбин рассматривают как фактор гибели, так и как фактор выживания нервных клеток (Киселева и др., 2005; Suo et al., 2004; Vergnolle et al., 2005). Так, внутримозговое введение тромбина в высоких концентрациях повреждает нейроны, снижает когнитивные функции у крыс (Mhatre et al., 2004), вызывает апоптоз в дофаминергических нейронах (Choi et al., 2003). Вместе с тем, тромбин защищает астроциты и гиппокампальные нейроны от гибели, вызванной гипогликемией и окислительным стрессом (Henrich-Noack et al., 2005). Внутримозговое введение низких доз тромбина (прекондиционирование) уменьшает повреждения мозга, вызываемые последующим введением высоких доз тромбина, внутримозговыми кровоизлияниями или церебральной ишемией (Masada et al., 2000; Sokolova, Reiser, 2008). Обнаружена как повреждающая провоспалительная, так и протекторная противовоспалительная функция не только тромбина, но и других протеиназ, в том числе ФХa, который активирует PAR2 и PAR1 (Olson et al., 2004; Noorbakhsh et al., 2005; Feistritzer et al., 2005). В фибробластах ФXa повышает внутриклеточный кальций и стимулирует пролиферацию, продукцию проколлагена через PAR1 (Blanc-Brude et al., 2005).

АРС – мультифункциональный фермент, участвует в регуляции не только свертывания крови, но также воспаления и апоптоза, проявляя антивоспалительные и цитопротекторные свойства (Riewald et al., 2002; O'Brien et al., 2006). Рекомбинантная форма АРС (дготрекогин альфа) снижает смертность пациентов от тяжелого сепсиса (Abraham et al., 2005). Молекулярные основы антивоспалительного и анти-апоптотического действия APC еще не выяснены. АРС ингибирует апоптоз и блокирует воспаление, изменяя профиль экспрессии генов в эндотелиальных клетках (Griffin et al., 2007), снижает образование провоспалительных цитокинов активированными моноцитами (Joyce et al., 2004). APC индуцирует протективные гены, активируя либо эндотелиальный рецептор протеина С (EPCR) (Esmon, 2005, 2007), либо каскад рецепторов EPCR-PAR1 (Ruf, 2005). Поэтому исследования экспрессии PARs и EPCR нейронами и их участия в действии APC на клетки представляется весьма перспективным для выяснения механизмов анти/проапоптотического действия APC. Известно, что использование в терапии тромботических инсультов тканевого активатора плазминогена (tPA) связано с риском развития осложнений- геморрагий, эксайтотоксичности (Kaur et al., 2004). Поиск новых нейропротекторов при эксайтотоксичности, вызванной tPA - весьма перспективная задача (Mosnier, Griffin, 2006).

В последнее время активно изучают протективные функции белков теплового шока (HSP) (Hooven et al., 2004; Salehi et al., 2006; 2007). Обнаружено, что в PAR1-опосредованном изменении формы астроцитов под действием тромбина принимает участие белок теплового шока 90 (HSP90) (Pai et al., 2002). Показано специфическое взаимодействие PAR1 с HSP90 в дрожжах (Pai et al., 2001). На основании этих данных рецептор тромбина PAR1 включен в список клиентных белков, взаимодействующих с цитозольной формой HSP90. Известно, что ингибитор HSP90, гелданамицин, блокирует АТФазную активность HSP90 и предотвращает его взаимодействие с клиентными белками. Механизмы участия HSP90 в действии тромбина и APC на нейроны мозга еще не изучены.

Одним из важнейших пусковых механизмов развития нейродегенеративных процессов при инсультах, травмах мозга, болезнях Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона и др., является гиперстимуляция глутаматных рецепторов (Hossain, 2005), приводящая к эксайтотоксичности, которая является причиной повреждения и гибели клеток. В настоящей работе для изучения роли ключевых протеиназ гемостаза в нейропротективных и нейродегенеративных процессах использована модель глутаматной эксайтотоксичности. Первичная культура нейронов является удобной экспериментальной моделью для изучения нейродеструктивных процессов, вызываемых глутаматом, так как цитологические и биохимические характеристики культивируемых нейронов близки тем, что наблюдаются у нейронов in situ (Хаспеков, 1995). Эксайтотоксичность – пусковой механизм нейрональной смерти (некротической и апоптотической) при многих неврологических нарушениях, таких как инсульт, травма, глаукома, рассеянный склероз или нейродегенеративные заболевания. При острой фокальной ишемии головного мозга в межклеточном пространстве значительно повышается содержание нейротрансмиттера глутамата, токсическое действие которого на нейроны вызывает быстрое и неконтролируемое увеличение [Ca²⁺]_i (Orrenius et al., 2003). Массивный вход Са³⁺ в нервные клетки по каналам ионотропных глутаматных рецепторов нарушает гомеостаз этого внутриклеточного мессенджера, запускает каскад внутриклеточных реакций, которые завершаются быстрой или отсроченной гибелью клеток механизмами апоптоза или некроза (Berliocchi et al., 2005).

В процессе гибели нейронов и других клеток, участвующих в воспалении, пролиферации, ангиогенезе и др. участвует транскрипционный фактор NF-kB (гетеродимер NF-kBр65 и р50). Получены данные о том, что активация NF-kB в нейронах, которая ведет к деградации его ингибиторов IkBs и транслокации NF-kB в ядро, вносит вклад как в гибель клеток при ишемии мозга (Schneider et al., 1999; Zhang et al., 2005; Crack et al., 2006), так и в выживание нейронов, повышая экспрессию антиапоптотических генов (Karin, Lin, 2002; Nakano et al., 2006).

Роль PAR рецепторов в действии ФXa на выживаемость/гибель культивируемых нейронов мозга при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом, ранее не изучалась. Отсутствуют данные о влиянии АРС на нейроны в условиях токсического действия глутамата и тромбина на клетки. Не известен рецепторный механизм действия АРС на нейроны гиппокампа и его влияние на активность транскрипционного фактора NF-kB в этих клетках.

Таким образом, актуальность и перспективность исследования роли ключевых сериновых протеиназ гемостаза, а также рецепторов, активируемых протеиназами, в процессах нейропротекции и нейродегенерации не вызывает сомнений и представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины и фармакологии.

Цель исследования

Выяснение механизмов влияния ключевых протеиназ системы гемостаза: тромбина, фактора Ха и активированного протеина С (АРС) на выживаемость нейронов мозга при эксайтотоксичности.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние тромбина, ФХа и АРС в широком диапазоне концентраций (от пМ до нМ) на выживаемость и кальциевый гомеостаз культивируемых нейронов гиппокампа и коры мозга крысы в норме и при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом. Оценить вклад IP₃-рецепторов эндоплазматического ретикулума нейронов в действие протеиназ на внутриклеточную концентрацию кальция.

2. Исследовать экспрессию рецепторов, активируемых протеиназами (PARs), и эндотелиального рецептора протеина С (EPCR) в кортикальных и гиппокампальных нейронах в норме и при токсическом действии глутамата.

3. Изучить вклад подтипов рецепторов, активируемых протеиназами в реализацию нейропротекторных эффектов тромбина и ФХа на гиппокампальные нейроны мозга при глутаматной эксайтотоксичности.

4. Исследовать участие рецепторов EPCR, PAR1 и белка теплового шока 90 (HSP90) в защитном действии АРС на гиппокампальные нейроны мозга крысы при токсичности, вызванной глутаматом.

5. Изучить вклад транскрипционного фактора NF-kB в гибель/выживание культивируемых гиппокампальных нейронов крысы при эксайтотоксичности и участие его в механизме нейропротекторного действия АРС.

Положения, выносимые на защиту:

1. Протеиназы гемостаза в зависимости от концентрации могут вызывать как протекторное, так и повреждающее действие на клетки нервной системы. Тромбин, ФХа и АРС в узком диапазоне низких концентраций (пМ - нМ), не достаточных для участия в процессах свертывания крови, защищают гиппокампальные и кортикальные нейроны от гибели, вызванной высокими концентрациями глутамата. Высокие концентрации протеиназ вызывают гибель нейронов, сопоставимую с действием токсических концентраций глутамата.

2. Рецепторы, активируемые протеиназами, необходимы для реализации протекторного действия протеиназ системы гемостаза. Для нейропротекторных эффектов протеиназ необходима протеолитическая активность ферментов. Тромбин защищает гиппокампальные и кортикальные нейроны от глутаматной эксайтотоксичности через PAR1, ФХа - через неизвестный подтип PAR. Два рецептора – EPCR (эндотелиальный рецептор протеина С) и PAR1 необходимы для нейропротекторного действия АРС на нейроны мозга крыс при эксайтотоксичности.

3. Тромбин через PAR1 вызывает быстрое и транзиторное увеличение внутриклеточного кальция в гиппокампальных и кортикальных нейронах механизмом, опосредуемым преимущественно через IP₃-рецепторы эндоплазматического ретикулума.

4. Прединкубация клеток с тромбином или ФХа повышает количество нейронов, восстанавливающих низкий уровень внутриклеточного кальция после действия высоких концентраций глутамата.

5. Действие токсических концентраций глутамата и тромбина на нейроны гиппокампа вызывает транслокацию в ядро одной из субъединиц NF-kB – NF-kBp65. Hизкиe концентрации протеиназ стабилизируют цитоплазматический комплекс NF-kB. АРС защищает нейроны от гибели, блокируя активацию NF-kB в нейронах, вызванную токсическими воздействиями.

6. Рецепторы, активируемые протеиназами, обладают высокой пластичностью и, в зависимости от состояния нейрона, изменяется их экспрессия. Соотношение подтипов PAR различно в коре и гиппокампе, что может определять и их разную чувствительность к протеиназам. Экспрессия подтипов PAR зависит от возраста нейронов. Протеиназы гемостаза осуществляют контроль экспрессии собственных рецепторов PAR в нейронах мозга по принципу обратной связи.

7. Протекторное действие протеиназ на клетки мозга при повреждении и эксайтотоксичности позволяет отнести их к клеточным регуляторам физиологических и патофизиологических процессов.

Научная новизна

Впервые обнаружено, что:

активированный протеин С (в низких (пМ) концентрациях) оказывает прямое анти-апоптотическое действие на культивируемые нейроны мозга при эксайтотоксическом действии глутамата и высоких концентраций тромбина;

в нейронах гиппокампа и коры крысы экспрессируется эндотелиальный рецептор протеина С (EPCR). Уровень экспрессии EPCR модулируется под действием тромбина и глутамата;

протекторное действие АРС на нейроны мозга реализуется через два типа рецепторов – EPCR и PAR1 при участии HSP90;

гиппокампальные нейроны более чувствительны (на два порядка) к действию АРС, чем кортикальные;

тромбин и ФХа в низких концентрациях повышают способность гиппокампальных нейронов восстанавливать базальный уровень внутриклеточного кальция после длительного глутаматного воздействия;

токсические концентрации глутамата и тромбина вызывают активацию транскрипционного фактора NF-kB в нейронах гиппокампа и коры, транслокацию в ядро субъединицы NF-kBp65 и отсроченную гибель нейронов;

АРС защищает нейроны от гибели, блокируя активацию транскрипционного фактора NF-kB, вызванную глутаматом или тромбином.

Теоретическая и практическая значимость

Важность работы для фундаментальной науки и практической медицины обусловлена необходимостью понимания молекулярных механизмов нейропротекторного действия протеиназ гемостаза при эксайтотоксичности, которая является одним из основных компонентов ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний.

Показано, что исследованные протеиназы - тромбин, ФХа и АРС - в узком диапазоне низких концентраций через активацию подтипов PAR, защищают гиппокампальные и кортикальные нейроны от гибели при эксайтотоксичности. Протекторное действие тромбина на нейроны при эксайтотоксичности реализуется через PAR1, ФХа - через неизвестный подтип PAR, а АРС - через EPCR и PAR1.

Нейропротекторное действие тромбина и ФХа обусловлено уменьшением дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при глутаматной эксайтотоксичности. АРС защищает нейроны от гибели, блокируя активацию NF-kB, вызванную токсическим действием на нейроны высоких концентраций глутамата или тромбина.

Полученные данные о протекторном действии протеиназ в низких физиологических концентрациях на клетки при эксайтотоксичости позволяют отнести тромбин, ФХа и АРС к клеточным регуляторам физиологических и патофизиологических процессов.

Данные о прямом цитопротекторном действии протеиназ гемостаза могут служить основой для разработки новых подходов к лечению травматических и ишемических повреждений нервной ткани и создания на базе агонистов и антагонистов рецепторов PAR препаратов с анти-апоптотическими, анти-воспалительными и репаративными свойствами, защищающими клетки от гибели и восстанавливающими ткани при терапии данных повреждений.

Результаты этой работы могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии, патофизиологии и фармакологии. Данные о новых функциях протеиназ гемостаза вне системы свертывания могут быть включены в курсы лекций по теме «Физиология и патофизиология гемостаза», «Нейрофармакологии».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на I Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005); 4^thи 5^th International Symposium Focus 2006, 2008:Cerebral Ischemia and Stroke (Magdeburg, 2006, 2008); 18^th International Congress of Fibrinolysis and Proteolysis (San Diego, 2006), XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); 3^rd Intern Congress ”Neuroscience for Medicine and Psychology” (Sudak, Crimea, Ukraine, 2007); XXI Congress of ISTH (Geneva, 2007); VI Международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2007); XIX International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Vienna, 2008); докладывались на отечественных и международных конференциях: «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. современные достижения» (Ярославль, 2005); «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006, 2007); «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006); «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, 2007); «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2006, 2007); «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2007). Результаты работы обсуждались на заседаниях кафедры физиологии человека и животных МГУ им. М.В.Ломоносова и лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ГУ НЦЗД РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на стр., состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована рисунками, содержит таблиц.