Введение к работе
.,..* .^..„^
Уа^'.АетуАяьность проблемы. Интерес к выяснению закономерностей формирования функций нервной системы в раннем онтогенезе, восходящий к классическим трудам И.М.Сеченова (1878), И.Р.Тарханова (1879),
ВТПрейёра-(РгёуёгТ ""1882)7" Района Кахаля (Cajal,г 1908), Дх. Когхилла
(Coghill, 1927) и других, не ослабевает до настоящего времени (Анохин, 1968; Богданов, 1972; Богданов, Геворгян, 1983; Бурсиан, 1983; Волохов, 1951, 1966; Войно-Ясенецкий, 1974; Орбели, 1958; Шулейкина, 1969; Фарбер, 1969; Hamburger, 1948, 1981; Hughes, 1968; Jacobson, 1969, и др.). Выяснение особенностей функционирования нервной системы в раннем онтогенезе и возрастных изменений тех или иных нервных функций представляет интерес как в практическом, так и в теоретическом отношении. В практическом аспекте вахно иметь точные представления о возникновении и хронологии развития основных функциональных характеристик нервных клеток, таких как возбудимость, хемочувствительность, образование синаптических контактов и особенности их функционирования и др. Важные теоретические обобщения, основанные в значительной сте- , пени на онтогенетическом материале (Анохин, 1968; Геккель, 1940; Орбели, 1958; Северцов, 1939; Cajal, 1908; Hamburger, Levi-Montalcihi, 1948, и др.), благодаря бурному накоплению новых данных дают основания полагать, что возможности онтогенетического подхода далеко не исчерпаны и в этом аспекте.
Вопрос о функциональных свойствах незрелых нейронов является одним из наиболее важных для понимания различных особенностей организации нервных процессов в раннем онтогенезе. Многие важные аспекты становления этих свойств нейронов в онтогенезе достаточно широко обсуждались в ряде монографий и обзоров (Богданов, Геворгян, 1984; Будко, 1985; Максимова, 1979; Шулейкина, 1979, 1985; Purpura, 1971; Crain, 1976; Sritzer, 1979, 1982, и др.), К сожалению, ввиду противоречивости и недостаточности имеющихся в литературе прямых данных (см. Максимова, 1979; Шулейкина, 1979, 19Э5) многие важные вопросы, связанные с функционированием нервных клеток на ранних стадиях развития, остаются до настоящего времени недостаточно ясными. К числу таких вопросов относятся механизмы электровозбудимости, сроки их формирования и их особенности в основных структурных отделах нервных клеток - соме, дендритах и аксоне, механизмы инициации и распространения возбуждения в незрелых нервных клетках, способность их к ритмическим разрядам, особенности процессов синаптического возбуждения и торможения в незрелых нейронах, а также возрастная динамика этих и ряда других фундаментальных свойств нервных клеток.
Основные трудности электрофизиологического исследования нервных клеток в раннем онтогенезе связаны с их значительно меньшими, чем у
зрелых нейронов, размерами, я легкой повреждаемостью, что требует значительно более деликатных манипуляций, чем при работе со зрелшш клетками. Важно отметить, что большинство имеющихся в литературе сведений о функциональных особенностях незрелых нейронов, особенно до 1980-х годов, было получено исследователями, не обладавшими достаточным опытом регистрации потенциалов нервных клеток и не уделявшими, как об этом можно судить по публикациям, должного внимания качеству регистрации, что могло привести к существенным ошибкам в оценках элехтрофизиологических характеристик нейронов. Важно также отметить, что в противоположность достаточно богатой литературе по электрофизиологическим свойствам зрелых нейронов, в отношении соответствующих свойств у незрелых нейронов ввиду крайней недостаточности имеющихся в литературе сведений возможность критически оценить те или иные результаты путем сравнения дабых разных исследований, в большинстве случаев отсутствует, тем более что в разных работах даже на одной и той же структуре одного и того же объекта стадии развития редко совпадали. Эти особенности имеющихся в литературе данных требуют особой осторожности в оценках, что, как показывает конкретный анализ литературы по тем иди иным принципиальным вопросам, приведенный в соответствующих главах диссертации, имело место далеко не всегда и привело к ряду недостаточно адекватных представлений о зрелости и незрелости применительно к функциям нервных клеток на ранних стадиях развития.
Цель и задачи исследования. Целью исследования было, на основе критического анализа имеющихся в литературе сведений об электрофизи- ологических свойствах незрелых нейронов и закономерностях их структурно-функционального созревания, электрофизиологическое и морфологическое изучение эмбриональных мотонейронов и их синаптических входов. Выбор этик нейронов обусловлен не только существованием специального интереса к ним ввиду того, что они представляют собой "общий конечный путь" (Ч. Шеррингтон, 1911) в моторной реализации конкретных потребностей организма на основе различных интегративных процессов, но также и ввиду того, что физиология зрелых нервных клеток наиболее подробно разработана на этом типе нейронов (Костюк, 1957, 1964; Шаповалов, 1975, 1979; Eccles, 1957, 1964, 1971; Burke, Rudomin, 1977).
Конкретными задачами исследования были;
-
Изучение особенностей инициации и пространственой организации процесса генерации потенциале действия в эмбриональных мотонейронах.
-
Изучение возрастной динамики и особенностей проведения импульсов в аксонах развивающихся нейронов.
-
Выяснение особенностей функциональных взаимодействий между мотонейронами на эмбриональных стадиях развития.
-
Выяснение сроков замыкания рефлекторной дуги в эмбриональном спинном мозге и особенностей сенсо-мотонейронных взаимодействий на ранних стадиях формирования рефлекторной дуги.
-
Идентификация конкретных тормозных синаптических путей в эмбриональном спинном: мозг е^выяснениеособенностей тормозных процессов
в эмбриональных нейронах и их роли в эмбриональном спинном мозге.
6. Выяснение функциональных особенностей эмбриональных нейронов
в зависимости от миелинизадии их аксонов в связи с дифференцировкой
начального сегмента аксона.
Научная новизна.
-
Разработан препарат изолированного суперфузируемого спинного мозга куриного эмбриона,, позволяющий существенно повысить уровень электрофизиологических исследований на этом классическом объекте ней-роэмбриологии. Приоритет автора в этом вопросе признан на международном уровне, и данная работа получила развитие в некоторых других направлениях благодаря использованию разработанной методики в Институте физиологии им. А.А.Богомольца АН Украины К.В.Баевым с сотрудниками, в США в университете штата Коннектикут в лаборатории Л.Ланд-мессер (L.Landmesser), а также в Университете штата Айова и в Наци-овальном Институте Здоровья в Бетезде (Мериленд) М.О'Донованом (M.O'Donovan).
-
С помощью внутриклеточной регистрации потенциалов исследованы свойства потенциалов действия и различных постсинаптических потенциалов в эмбриональных мотонейронах начиная с 10-11-го дня развития.
-
Показано, что на всех указанных стадиях развития мотонейроны имеют потенциалы покоя, практически не отличающиеся от потенциалов покоя зрелых мотонейронов, и способны генерировать потенциалы действия, основные электрофизиологическпе характеристики которых также мало отличаются от аналогичных в зрелых мотонейронах.
-
Измерены скорости проведения в моторных аксонах в период с 6.5-го по 18-й день развития эмбриона и в сенсорных нейронах в период с ю-го по 16-й день развития.
-
Обнаружено существование механизма возвратного торможения в спинном мозге куриного эмбриона, аналогичного Реншоу-торможению в спинном мозге млекопитающих, начиная с 10-го дня развития. Установление этого факта является первой демонстрацией данного механизма в спинном мозге пемлекопитающих и дает основания для обобщений относительно эволюции данного механизма.
-
Показано существование электрических взаимодействий между эмбриональными мотонейрояамн, аналогичное описанному в зрелом спинном мозге и в раннем постнатальном онтогенезе.
-
Показано, что рефлекторная дуга замыкается в спинном мозге куриного эмбриона ва 7,5-й день развития. На 10-дневных и более старших эмбрионах показана чисто возбуждающая природа прямых синаптичесхих влияний первичных афферентов на мотонейроны. Показана чувствительность эмбриональных мотонейронов К глутамату, являющемуся наиболее вероятным медиатором возбуждения в зрелом спинном мозге, начиная с 6.5-го дня развития.
-
Показано, что постсиваптичесхое тормохеняе присутствует в спинном мозге эмбриоаа ва всех стадиях, ва которых удавалось качественно регистрировать потенциалы мотонейронов с помощью внутриклеточных микроэлектродов (начиная с 10-го дня развития). Установлено, что основные свойства тормозных постсинаптических потенциалов (ТПСП) в эмбриональных мотовейронах практически не отличаются от свойств ТПСП в зрелых мотопей/ронах, включая их зависимость от трансмембранного распределения иовов хлора, близость потенциала реверсии к потенциалу покоя н шунтирующее действие на мембрану, проявляющееся в эффективном угнетений потенциалов действия.
-
Установлено существование в спинном мозге эмбриона различных тормозных путей к мотонейронам: нисходящего, опосредуемого волокнами вентральных и латеральных столбов белого вещества, и рефлекторного полисинаптичесхого. С помощью выявления растормаживающих эффектов стрихнина и бесхлорной среды показана возмохвость существования тормозных процессов в иатернейронном аппарате, активно ограничивающих диффузное распространение возбуждения, ухе на ранних стадиях развития.
-
Показана чувствительность постсинаптической мембраны эмбриональных мотонейронов к гамма-ами&омасляной кислоте (ГАМК) а глицину, являющимся наиболее вероятными медиаторами тормохевия в зрелом спинном мозге, начиная с б,5-го дня развития. С помощью антагонистов данных аминокислот пихротоксина и стрихнина показана специфичность их действия ухе на наиболее ранних из исследованных стадий развития.
-
Выявлены принципиальные различия в топографии аксонной зоны инициации импульса в эмбриональных мотонейровах до и после начала миелинизации, позволившие сформулировать гипотезу о двух типах ин-тегративной деятельности нейронов в зависимости от лаличия или отсутствия в их аксоне структурно дифференцированного начальвого сег-мевта.
Теоретическое и практическое значение работы. Представленные в работе экспериментальные данные позволяют существенно конкретизировать, а в отношении ряда вопросов и пересмотреть существующие представления об особенностях функционирования нервных клеток на эмбрво-
нальных стадиях развития. В частности, не нашло подтверждения рас
пространенное представление о функциональной незрелости эмбриональных
нейронов, основанное на исследованиях с недостаточно жесткими крите-
риями оценки возможных изменения состояния клеток в результате введе
ния в них микроэлектрода.-Собственный экспериментальный материал де
монстрирует достаточно высокую "зрелость" многих электрофизиологии
ческих характеристик сшшальных мотонейронов куриного эмбриона на
всех стадиях, когда удавалось удовлетворительно зарегистрировать их
потенциалы с помощью внутриклеточных микроэлектродов - начиная по
крайней мере с Ю-го дня инкубация.
Проведенные исследования позволяют глубже представить функциональные возможности эмбриональной нервной системы. Показанное в работе раявее формирование ряда высохоспециализяроваввых систем, таких как система возвратного торможения мотонейронов, моносинаптическая рефлекторная дуга, длинные нисходящие ггроприоспиналыше (а возможно, также и супраспинальные) связи и некоторых других систем мехнейронных взаимодействий свидетельствуют о том, что причиной функциональной незрелости эмбриональной нервной системы, а тем более нервной системы новорожденных, является не традиционно предполагавшаяся функциональная незрелость нервных клеток и их взаимодействий, а некоторые другие свойства. Полученные данные позволили выявить, наряду со значительно более низкими скоростями проведения импульсов и более высокими значениями входного сопротивления незрелых нейронов, также и принципиально новый функциональный аспект, связанный с изменением типа инте-гративной деятельности нейронов в ходе диференцировки начального сегмента аксона на ранних стадиях миелинизации.
Сформулированная в работе гипотеза о новом функциональном аспекте миелинизации имеет широкую приложимость как в нормальной физиологии нервной системы, так и в ряде ее специальных разделов и позволяет глубже понять особенности нервных процессов на домиелиновых стадиях развития как в онто- так и в филогенезе, а также в клинике демиелиии-зирующих заболеваний. Эта гипотеза позволяет по-новому оценить патологические процессы, происходящие при демиелинизирующих заболеваниях и может быть использована для разработки методов их ранней диагностики.
Полученные в работе, результаты и обобщения могут быть использованы в лекционых курсах по общей физиологии нервной системы, клинической нейрофизиологии, онтогенетической физиологии и некоторых специальных разделах нормальной физиологии нервной системы. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработан препарат изолированного суперфузируемого спинного
мозга куриного эмбриона, открывший широкие возможности для систематических микроэлехтродных и нейроанатомических исследований на этом классическом объекте нейроэмбриологии.
2. С помощью внутриклеточной регистрации потенциалов в сочетании
с жесткими критериями оценки качества регистрации и исключения се
лекция более продвинутых в своем развитии клеток микроэлектродом по
казано, что в плане основных характеристик потенциалов покоя и потен
циалов действия мотоиейровы являются вполне "зрелыми" ухе к 10-му дню
эмбрионального развития. В то хе время скорость проведения импульсов
в их аксонах на этих стадиях развития как и в течение всего эмбрио
нального периода крайне низка, причем сравнение ее\скоростью проведе
ния импульсов в зрелых аксонах сходного диаметра свидетельствует о
незрелости мембранных процессов, ответственных за проведение импуль
сов в аксонах.
-
Ухе на ранних стадиях развития электровозбудимость присутствует как в аксоне, так и в сомадендритной мембране нервной клетки, о чем свидетельствует наличие соответствующих компонентов у потенциала действия эмбриональных нейронов, причем амшштудно- временные характеристики соответствующих компонентов практически не отличаются от соответствующих характеристик в зрелых мотонейронах. В то хе время впервые разработанный и экспериментально проведенный анализ топографических особеностей ахсонных компонентов потенциала действия свидетельствует о существенных перестройках аксовной зоны инициации импульса я ходе дифференцирован начального сегмента аксона на ранних, стадиях миелинизации.
-
Сформулирована гипотеза о новом функциональном аспекте миелинизации, согласно которой выделяются два основных типа интегративной деятельности нейронов в зависимости от наличия или отсутствия у них пространственно ограниченного начального сегмента аксона, что, в свою очередь, определяется наличием или отсутствием у аксона миелиног.ой оболочки.
-
Ухе на довольно ранних стадиях эмбрионального развития в спинном мозге формируются различные возбуждающие и тормозные входы на мотонейроны, о чем свидетельствует наличие как возбухдающих, так и тормозных постсинаптичесхих потенциалов (ВПСЯ и ТПСП, в их спонтанной и вызванной электрической активности. Ухе на 6-8-й день развития мотонейроны обнаруживают чувствительность к аппляцируемым глутамату, являющемуся наиболее вероятным медиатором возбухдения в зрелом спинном мозге, и гамма-аминомасляной кислоте и глицину, являющимся в зрелом спинном мозге медиаторами тормохения.
-
Показано, что ухе на ранних стадиях эмбрионального развития в
спинном мозге формируется ряд высокоспециализированных систем мех-нейронных взаимодействий. В частности, ухе к 10-му дню развития у куриного эмбриона в достаточно высокой степени сформированы система возвратного Реншоу-торможения мотонейронов, электрические взаимо-действиямехду-мотонейронами,__ моносинаптическая рефлекторная дуга,
длинные нисходящие проприоспинальяые пути. В интернейронном аппарате
присутствуют тормозные системы, ограничивающие, хотя и не столь эффективно, как в зрелом спинном мозге, возникновение и диффузное распространение спонтанных вспышек возбуждения я длительных последействий в ответ на различные внешние воздействия.
7. Представленные данные о Реншоу-тормохении являются первой демонстрацией этого механизма в спинном мозге немлекопитаюпцис и дают основания для предположения, что в ходе эволюции этот механизм возник у общего предка птиц и млекопитающих в классе рептилий. Апробация работы. Результаты докладывались па различных научных заседаниях в Институте эволюционной физиологии н биохимии им. И.М. Сеченова АН СССР (ныне РАИ) в период с 1981 по 1991 г., на заседаниях секции нейроонтогенеэа Лениградского (ныне Санкт-Петербургского) общества физиологов (1983, 1988, 1989), на межлабораторном семинаре в Институте проблем передачи информации АН СССР (1984), на УШ всесоюзной конференции по электрофизиологии центральной нервной системы (Ереван, 1980), УШ, XI и X всесоюзных совещаниях по эволюционной физиологии (Ленинград 1982, 1986 и 1990), XIY съезде всесоюзного физиологического общества (Баку, 1983), международном симпозиуме "Роль афферентного притока в созревании функций мозга" (Суздаль, 1984), всесоюзной конференции "Развивающийся мозг" (Тбилиси, 1984), 4-м международном симпозиуме по нейроонтогенезу (Прага, 1985) , на межлабораторных семинарах в Институте ВНД и нейрофизиологии (Москва, 1985, 1988), 4-й и 5-й всесоюзных конференциях "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1985, 1990), всесоюзной конференции "Исследования глутаматергических синапсов (Ленинград, 1987), 4-м съезде армянского физиологического общества (Ереван, 1987), з-й всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1990), 3-м всемирном конгрессе ИБРО по нейропаукам(Монреаль, 1991) и 11-м международном симпозиуме "Поза и походка: механизмы управления" (Портленд, США, 1992) и международном симпозиуме памяти академика С.В.Аничкова "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (Санкт-Петербург, 1Э92).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, описания объекта и основных, методических приемов исследования и 6 экспериментальных глав с обзорами литературы, предшествующими нэло-