Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) периваскулярной локализации как компонент мезенхимального резерва организма 17
1.1. Идентификация МСК in situ 18
1.2. Выявление перицитоподобных клеток in situ 20
1.3. Характеристика перицитоподобных клеток in vitro 26
1.4. Факторы микроокружения в тканевых (физиологических) нишах малодифференцированных стромальных клеток 33
Глава 2. Морфологические и функциональные особенности МСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека (жтМСК) при тканевом («физиологическом «) содержании О2 34
2.1. Морфология, иммунофенотип, жизнеспособность 36
2.2. Пролиферация и миграция 42
2.2.1. Влияние концентрации факторов роста на пролиферацию 44
2.2.2. Влияние плотности посадки на пролиферативную активность и жизнеспособность 46
2.3. Дифференцировка 49
2.4. Клеточные органеллы и внутриклеточные активные формы кислорода (АФК) 58
2.5. Секреторная активность 61
Глава 3. Влияние «физиологической» гипоксии на транскриптом жт МСК 72
3.1. Биологические процессы, с которыми связаны гены с измененной экспрессией 77
3.2. Изменение экспрессии HIF и регулируемых ими генов 80
3.3. Дифференциальная экспрессия генов, кодирующих продукты, регулирующие пролиферацию 85
3.4. Изменение экспрессии генов основных компонентов цитоскелета, белков соединительнотканного матрикса и ключевых молекул, участвующих в его ремоделировании 86
3.5. Анализ дифференциальной экспрессии генов, кодирующих биологически активные медиаторы 88
3.6. Изменение экспрессии генов, связанных с «пластичностью» жтМСК 91
3.7. Дифференциальная экспрессия генов, продукты которых вовлечены в межклеточные взаимодействия 91
Глава 4. Взаимодействие мультипотентных мезенхимальных стромальных и иммунокомпетентных клеток 94
4.1. Иммуносупрессивные эффекты МСК 95
4.2. Механизмы реализации иммуномодуляторных эффектов МСК 97
4.3. Влияние факторов микроокружения на иммуномодуляторные эффекты МСК 101
4.4. Характеристика взаимодействия жтМСК с аллогенными МНК при различном содержании О2 в микроокружении 103
4.4.1. Анализ суспензионной фракции МНК в монокультуре и сокультуре с жтМСК 100
4.4.2. Характеристика фракции МНК, прикрепленных к жтМСК 107
Глава 5. Гемопоэз-поддерживающая активность жтМСК при тканевом уровне О2 в микроокружении 118
5.1. МСК. как компонент кроветворной ткани 118
5.2. Паракринные и контактные взаимодействия в гемопоэтической нише 120
5.3. Концентрация О2, как фактор регуляции функций стволовых и прогениторных клеток 123
5.4. Моделирование кроветворного микроокружения ex vivо 126
5.5. Компарментализация ГСПК при взаимодействии с МСК in vitro 127
5.6. Модификация межклеточного взаимодействия стромальных и гемопоэтических предшественников в условиях пониженного содержания О2 130
5.6.1. Взаимодействие пкМНК и жтМСК при различном содержании О2 в среде культивирования 132
5.6.1.1. Характеристика суспензионной фракции пкМНК-1 после сокультивирования с жтМСК при 20% и 5% О2 134
5.6.1.2. Характеристика адгезированных пкГСПК-0 после сокультивирования с жтМСК при 20% и 5% О2 140
5.6.1.3. Влияние жтМСК и различной концентрации О2 на гемопоэтические клетки-потомки пкГСПК-0 (популяции пк-ГСПК1,2) 148
5.6.2. Паракринные медиаторы и молекулы, опосредующие контакты пкГСПК 4
1,2 и жтМСК 159
Глава 6. Использование МСК из жировой ткани для стимуляции ранних этапов формирования костной мозоли при экспериментальном переломе у крыс 168
Заключение 173
Выводы 182
Список сокращений 184
Список литературы
- Выявление перицитоподобных клеток in situ
- Влияние плотности посадки на пролиферативную активность и жизнеспособность
- Дифференциальная экспрессия генов, кодирующих продукты, регулирующие пролиферацию
- Влияние факторов микроокружения на иммуномодуляторные эффекты МСК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Результаты исследований последних десятилетий внесли значительный вклад в расширение наших представлений об участии клеток стромального дифферона в обеспечении тканевого гомеостаза и физиологического ремоделирования. Важную роль в этом компартменте играют мультипотентные мезенхимальные стромальные/стволовые клетки (МСК) [Caplan,1991; Horwitz et al., 2005], впервые описанные А.Я.Фриденштейном с коллегами (1960-70 гг.) как остеогенные стволовые или стромальные стволовые клетки костного мозга.
Результаты, полученные как in vitro, так и in vivo, продемонстрировали, что МСК представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, способную, с одной стороны, к самообновлению, а с другой – обеспечивающую формирование более коммитированных клеточных элементов тканей мезенхимального происхождения (кость, жировая ткань, хрящ и некоторые другие). Кроме того, МСК могут отвечать на хемоаттрактивные стимулы и мигрировать в поврежденные ткани-мишени, обеспечивая репарацию, поддерживать гемопоэз, а также подавлять иммунный ответ при аутологичном и аллогенном введении [Caplan, 2007; Da Silva Meirelles et al., 2008; Murphy et al., 2013].
Адекватная интерпретация получаемых экспериментальных данных и эффективное
использование пула малодифференцированных стромальных предшественников
невозможны без всестороннего исследования физиологии МСК с учетом их места и роли в конкретном тканевом контексте. В связи с этим изучение влияния факторов микроокружения на функциональную активность этих клеток является важной фундаментальной задачей современной клеточной физиологии.
Логично предположить, что в реализации свойств МСК одним из определяющих
факторов является их специфическое микроокружение, или тканевая ниша, в которой они
локализованы. Среди сложного комплекса прямых межлеточных взаимодействий, влияния
соединительнотканного матрикса, паракринных медиаторов важнейшую роль в определении
«миссии» МСК играет парциальное давление кислорода. Его концентрация и ее изменения
могут быть детерминирующими факторами, определяющими роль МСК в формировании
тканевого гомеостаза. Для тканей организма характерна существенно меньшая, чем
атмосферная, концентрация О2, которую сейчас принято обозначать как «физиологическая»
гипоксия [Ivanovic Z., 2009], физиоксия [Carreau et al., 2011] или «in situ нормоксия»
[Eliasson & Jnsson, 2010]. Очевидно, что низкое парциальное давление О2 может
существенным образом модифицировать ответ стромальных клеток на сигналы микроокружения. В связи с вовлечением в репаративные/регенеративные процессы МСК
оказываются в условиях с различным парциальным давлением кислорода и должны
обладать высокой степенью О2-опосредованной пластичности.
Показано, что постоянная экспансия МСК при концентрации О2, близкой к значениям
в тканях (1-10%), существенным образом изменяет их вне зависимости от тканевого
источника. В таких гипоксических условиях увеличивается пролиферативная активность
МСК [Fehrer et al.. 2007; Grayson et al., 2007; Буравкова и др., 2009; Dos Santos et al., 2010;
Valorani et al., 2010] и их способность к образованию КОЕ-Ф [Fehrer et al., 2007; Iida et al.,
2010]. При этом дифференцировка в остео- и адипогенном направлении замедляется [Fehrer
et al., 2007; Гринаковская и др., 2009; Valorani et al., 2010], а хондрогенная – напротив,
усиливается [Wang et al., 2005; Khan et al., 2010]. В основе этих изменений лежит серьезная
перестройка метаболизма МСК. Недавно мы продемонстрировали, что постоянная
экспансия МСК при 1-5% О2 по сравнению со стандартным 20% приводит к изменениям их энергетического статуса за счет увеличения гликолитической составляющей в образовании АТФ [Buravkova et al., 2013]. Поддержание недифференцированного статуса МСК при низком парциальном давлении О2 подтверждается увеличением экспрессии основных генов «стволовости»: Oct-4, Sox2, Nanog, SSEA-4 и др. [Fehrer et al., 2007; Iida et al., 2010; Valorani et al., 2010; Basciano et al., 2011].
Целый ряд экспериментальных фактов указывает на то, что во взрослом организме МСК могут локализоваться не только в костном мозге, но и популировать другие тканевые ниши. Поиск и характеристика таких источников являются предметом значительного научного интереса. Получение МСК из целого ряда тканей позволило предположить, что они могут быть локализованы в каких-то сходных тканевых локусах [Covas et al., 2008; Murray et al., 2014]. Расположение в периэндотелиальной области кровеносной системы, пронизывающей все ткани организма, представляется идеальной тканевой нишей для МСК, как предполагали еще в первой трети XX века отечественные исследователи [Maximow, 1927; Щелкунов, 1935]. В настоящее время популяция периваскулярных клеток, распространенная по всему организму, привлекает к себе внимание в связи с попытками объяснить наличие во взрослых дифференцированных тканях малодифференцированных клеток стромы, обладающих широким потенциалом. По крайней мере часть из них in vitro обладает свойствами клеток, которые сейчас принято называть МСК: при культивировании они быстро адгезируют к субстрату, активно пролиферируют, несут соответствующие поверхностные маркеры, способны дифференцироваться в клетки хряща, кости, жировой ткани, и т.д. [Сhen et al., 2009, Crisan et al., 2012; Bourin et al., 2013].
Благодаря тому, что МСК могут быть легко выделены из организма и использованы в клеточной терапии и регенеративной медицине как для аутологичного, так и аллогенного
введения, интерес к биологии этих клеток все время растет. Уже накоплен значительный
экспериментальный и клинический материал, демонстрирующий эффективность применения
МСК не только из костного мозга, но и других тканевых источников, таких как стромально-
васкулярная фракция жировой ткани (жтМСК). Поскольку жтМСК могут быть легко и в
достаточном количестве извлечены из ткани и процессированы ex vivo, они являются
наиболее привлекательными среди альтернативных источников стромальных клеток [Tobita
et al., 2011; Baer, 2014; Minteer et al., 2015]. В настоящее время жтМСК активно изучаются, в
том числе, и с точки зрения их ответа на изменение концентрации О2 в микрокружении. В
условиях пониженного содержания О2 жтМСК, также как и МСК из других тканевых
источников активнее пролиферируют и медленнее дифференцируются, чем в
нормоксических условиях, и демонстрируют увеличение экспрессии основных генов «стволовости»: Oct3/4, Sox2, Nanog [Wang et al., 2005; Fotia et al., 2014]. Однако целый ряд вопросов относительно характеристики особенностей реализации потенциала жтМСК в условиях «физиологической» гипоксии, в частности, их взаимодействия с гемопоэтическими клетками разной степени коммитированности, практически не исследованы.
Цель исследования: изучение свойств васкулярной фракции стромальных клеток, содержащей МСК, и особенностей реализации потенциала МСК при культивировании в условиях содержания кислорода, характерного для их физиологической ниши.
В рамках сформулированной цели были решены следующие задачи:
1) характеристика морфо-функциональных свойств периэндотелиальных клеток в различных
участках сосудистого русла человека;
-
исследование морфологических и функциональных особенностей МСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека (жтМСК) в условиях физиологических концентраций О2 («физиологическая» гипоксия);
-
анализ изменений транскриптомного профиля жтМСК при снижении содержания О2 в среде культивирования;
-
изучение особенностей взаимодействия жтМСК и аллогенных иммунных клеток при различном уровне О2;
5) характеристика гепомоэз-поддерживающей активности жтМСК при тканевом содержании кислорода;
6) оценка эффективности использования аллогенных жтМСК для стимуляции ранних этапов формирования костной мозоли при экспериментальном переломе у крыс.
Научная новизна исследования. В результате выполненного исследования впервые
показано, что периэндотелиальная область сосудистого русла является тканевым депо
малодифференцированных стромальных предшественников, иммуноцитохимически
идентифицированных как перицитоподобные клетки, которые образуют непрерывную сеть в субэндотелиальном пространстве от магистральных артерий до капиллярного русла. In vitro эти клетки по своим характеристикам соответствуют критериям МСК: быстро адгезируют к субстрату, экспрессируют стромальные маркеры (CD90, CD73, CD 105) и маркеры перицитов (О-сиалоганглиозид и HMW-MAA), негативны по гемопоэтическим и эндотелиальным маркерам (CD45, CD14, CD31), способны к мультилинейной дифференцировке.
Впервые in vitro исследовано влияние постоянной «физиологической» гипоксии (5% О2) как специфического фактора тканевого микроокружения на свойства МСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани (жтМСК). Установлено, что постоянное культивирование в условиях «физиологической» гипоксии не оказывает повреждающего действия на жтМСК, клетки сохраняют мезенхимальный иммунофенотип и высокую жизнеспособность. При этом выявлены разнонаправленные изменения транскрипционной активности ряда генов, в том числе и ассоциированных с HIF, обеспечивающие возможность
реализации функциональ
ремоделированием микроокружения.
Впервые проведен_комплексный а условиях «физиологической» гипоксии. Показано увеличение пролиферат
дифференцировочного_потенциа
генов,_ответственных^ на меньшую степень
коммитированности жтМСК. Установлено, что продукция растворимых медиаторов жтМСК может изменяться в зависимости от внутренних факторов, определяемых фазой роста клеток, длительностью культивирования, а также модулируется факторами микроокружения, такими как концентрация О2 и присутствие других типов клеток. Установлено, что изменения цитокинового профиля связаны, в основном, с пулом интерлейкинов/хемокинов и ангиогенных медиаторов. В модели in ovo впервые показано, что кондиционированная среда от предмонослойных жтМСК при 5% О2 обладает значительно большим стимулирующим действием на рост сосудов, чем среда от клеток при 20% О2.
Впервые охарактеризованы строма-ассоциированные и суспензионные популяции клеток гемопоэтического дифферона разной степени коммитированности - митоген-стимулированных аллогенных мононуклеарных клеток (МНК), а также мононуклеаров пуповинной крови (пкМНК), формирующиеся при взаимодействии с жтМСК при 20% и 5% О2. Установлено, что строма-ассоциированные МНК обладают гораздо более высокой жизнеспособностью, по сравнению с суспензионными. В присутствии жтМСК эффективно происходит подавление активации как МСК-ассоциированных, так и флотирующих ФГА-стимулированных Т-лимфоцитов по HLA-DR антигену, причем «физиологическая»
гипоксия потенциирует этот эффект. Впервые обнаружены среди жтМСК-ассоциированных СВ14+моноцитов производные от них СD206+ и СD68+ макрофаги. Кроме того, отмечено увеличение доли Т-ЕК клеток как среди суспензионных, так адгезированных МНК, что указывает на возможную активацию клеток врожденного иммунитета.
Впервые установлено, что в результате адгезии к жтМСК части гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (пкГСПК) из нефракционированных пкМНК можно получить фракцию функционально активных ГСПК, ассоциированных с жтМСК, которые при дальнейшей экспансии без добавления экзогенных цитокинов способны генерировать суспензионную фракцию, существенно обогащенную CD34+ недифференцированными гемопоэтическими предшественниками, а также формировать под жтМСК скопления клеток, образующих области булыжной мостовой (КООБ) с примитивным фенотипом CD133+/CD34+. При этом установлено, что при взаимодействии в жтМСК происходит увеличение экспрессии молекул клеточной адгезии (САМs) и подавление активности генов, связанных с ремоделированием внеклеточного матрикса и прикрепления к нему жтМСК, что обеспечивает миграцию пкГСПК в подклеточное пространство.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате выполненного исследования подтверждена гипотеза о том, что периэндотелиальная область сосудов может быть одним из тканевых депо малодифференцированных стромальных предшественников, включая МСК, и продемонстрировано существование непрерывной сети этих клеток от магистральных артерий до микрососудистого русла. В модели in vitro показано, что «физиологическая» гипоксия не оказывает повреждающего действия на жтМСК, а, напротив, поддерживает их некоммитированный статус, обеспечивающий возможность реализ функциональной активности, ремоделированием микроокруж
активности__жтМСК (синтез и секреция растворимых медиаторов) зависит от состояния
самих клеток (фаза роста, количество пройденных пассажей), а также определяется
внешними факторами (концентрацией О2 в микроокружении, взаимодействие другими
клетками). Показано, что жтМСК как п осуществляют
иммуномодуляцию^сво периферической_крови и об коммитированных гемопоэтических п рассматривать_их_как полноценную клеточной терапии и^реген фундаментальное значение с то
стромальных^предшественников процессы репарации.
Предложен новый способ получения МСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани в условиях действия пониженного (до 5%) О2, расширяющий арсенал средств получения мезенхимальных стромальных клеток при повышении их выхода с сохранением фенотипа, высокой жизнеспособности, экспрессии мезенхимальных маркеров (патент № 2351649, патент № 2418066). На основании предложенного способа были получены жтМСК крысы и показано, что однократное введение суспензии жтМСК, постоянно культивированных как при 20%, так и 5% Ог, в 2-3 раза увеличивает долю хрящевой ткани в костной мозоли, что улучшает формирование фиброзно-хрящевого регенерата после экспериментального перелома малоберцовой кости крыс (патент № 2461621). По результатам анализа взаимодействия жтМСК и пкМНК установлено, что адгезия пкГСПК из тотальной популяции пкМНК к жтМСК может быть использована как методический подход для ex vivo получения обогащенной популяции гемопоэтических предшественников разной степени коммитированности в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (МСК) (патент № 2525143) и предложен способ получения примитивных ГСПК (Заявка на патент 2016104419, 2016 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Перицитоподобные клетки, обладающие свойствами МСК, локализованы в
субэндотелиальном пространстве различных участков сосудистого русла от магистральных
артерий и вен до микрососудистой сети.
-
При постоянной «физиологической» гипоксии, по сравнению с 20% О2, изменяется экспрессия более 500 генов жтМСК, обеспечивая формирование «прорегенеративного» профиля транскрипции и изменение функциональной активности жтМСК. При этом существенно возрастает транскрипция генов, продукты которых обладают плейотропной активностью: АРОЕ, CCL2(MC?-\), СХСЫ2, IL8. Увеличение пролиферативного потенциала и замедление ответа на дифференцировочные стимулы при повышении активности генов «пластичности» DMKN (дермокин) , LAMA1 (ламинин а-цепь), GPR56 G (белк-связанный рецептор вариант 3) свидетельствует о малом уровне коммитированности жтМСК.
-
Паракринная активность жтМСК на транскрипционом и трансляционном уровне может изменяться в зависимости от внутренних факторов, определяемых фазой роста, длительностью культивирования, а также зависит от факторов микроокружения, таких как концентрация Ог и присутствие других типов клеток.
4. МСК из жировой ткани проявляют иммуносупрессивную активность в отношении как
флотирующих, так и адгезирующих митоген-стимулированных клеток адаптивного
иммунитета: по сравнению с митоген-стимулированными лимфоцитами в монокультуре, не
увеличивается доля СD4+ и CD8+ Т-клеток, а также снижается активация Т-клеток по HLA-
DR антигену, причем «физиологическая» гипоксия потенцирует этот эффект.
5. Сокультивирование пкМНК и жтМСК человека позволяет выделить фракцию
функционально активных пкГСПК, которые при дальнейшей экспансии без добавления
экзогенных цитокинов способны генерировать популяцию, существенно обогащенную
примитивными CD34+ предшественниками. Снижение концентрации О2 дает возможность
увеличить долю CD34+клеток в популяции пкГСПК и обеспечить преимущественное
развитие определенных гемопоэтических ростков.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных
данных подтверждена воспроизводимостью результатов при повторении экспериментов, а
также адекватными методами статистической обработки. Результаты были обсуждены на
межлабораторном семинаре 9 июня 2016 г. и рекомендованы к защите. Материалы
диссертации были представлены и обсуждены на отечественных и зарубежных научных
мероприятиях, в том числе: Конференция «Регенеративная биология и медицина» (2011),
Cъезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (2010, 2012), Всероссийская научная
школа-конференция - «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (2009, 2011, 2013), 4th
Congress on Regenerative biology and Medicine (2010), Recent Researches in Modern Medicine
(2011), Strategies in Tissue Engineering (2012, 2015), World Conference on Regenerative
Medicine (WRM) (2011, 2013), International Conference on Cell Science and Stem cell Research
(2011), Международная конференция «Постгеномные методы анализа в биологии,
лабораторной и клинической медицине» (2012, 2014), Национальный Конгресс по
регенеративной медицине (2013, 2015), IV Съезд физиологов СНГ (2014), International Science Index Symposium (2014), International Symposium (TERMIS-2014), Fraunhofer Life Science Symposium (2014), 5th World Congress on Cell & Stem Cell Research (2015). Личное участие автора. Непосредственное участие автора заключалось в планировании и организации исследований, разработке методических подходов и проведении экспериментов, анализе полученных результатов, формулировке научных положений и выводов, написании статей.
Структура и объем диссертации. Работа изложена в монографическом стиле на 222 страницах, содержит 57 рисунков, 23 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, пяти глав с результами и обсуждением соответствующего раздела работы, заключения, выводов, списка литературы, включающего 412 цитируемых источников.
Выявление перицитоподобных клеток in situ
В ходе исследования возник вопрос, а одних и тех же или на разных субэндотелиальных клетках экспрессируются антигены перицитов.
Для ответа мы использовали гомогенную клеточную популяцию культивируемых перицитов из капилляров сосудистой оболочки мозга человека. В культуре эти клетки обладают высоким пролиферативным индексом (90±2% клеток содержат ядерный антиген пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen (PCNA)), 87% клеток экспрессируют антиген NG2 и 60% - 3G5. При одновременном выявлении этих антигенов доля положительно окрашенных клеток также составляет около 88%, что позволяет утверждать следующее: все клетки, имеющие антиген 3G5, экспрессируют NG2 антиген, но есть субпопуляция перицитов, имеющих только NG2. Кроме того, увеличение количества фетальной телячьей сыворотки (ФТС) в культивируемой среде с 10% до 20%, приводило к достоверному уменьшению с 60±1% до 47±0,8% доли клеток, экспрессирующих 3G5-антиген. Это наблюдение объясняется тем, что 3G5 обычно несут покоящиеся перициты [Nayak et al. 1988], а экспрессия NG2 более свойственна активированным перицитоподобным клеткам [Ozerdem et al., 2002], поэтому стимуляция пролиферации факторами роста ФТС обуславливает сдвиг в профиле экспрессии перицитарных антигенов.
Используя методику пленочных препаратов в сочетании с иммуноцитохимическим выявлением О-дисиалоганглиозида (3G5), мы показали, что субэндотелиальную сеть перицитоподобных клеток можно обнаружить практически во всех участках кровеносной системы. Еще в 30-х годах XX века этот метод был предложен С.И.Щелкуновым для изучения строения кровеносных сосудов. Такой подход позволил ему продемонстрировать наличие слоя клеток, расположенного под эндотелием в брюшной аорте, бедренной артерии и бедренной вене кошки, а также в крупных кровеносных сосудах других позвоночных: минога, акула, скат [Щелкунов, 1977]. Автор предположил, что этот субэндотелиальный слой клеток непрерывно распространяется в сторону аорты и сердца (где он и ранее был известен под названием Лангхансова слоя), а также в сторону капилляров, где он переходит в адвентициальные (периэндотелиальные, периваскулярные) клетки - перициты. Полученные в настоящем исследовании результаты позволили подтвердить гипотетические предположения Щелкунова о существовании в сосудистом русле непрерывного слоя субэндотелиальных перицитоподобных клеток.
Наличие в субэндотелиальной интиме крупных артерий клеток, по своим признакам существенно отличающихся от типичных миоцитов гладких мышц медии, было отмечено еще в прошлом веке [Langhans, 1866]. Их называли фибробластами интимы [Langhans, 1866], клетками мезенхимального резерва организма (Maximow, 1927), перицитами или сосудистым камбием [Щелкунов, 1935] и т.д. Ранее Bostrom et al. [1993] используя те же анти-3G5 антитела, продемонстрировали перицитоподобные клетки в очагах кальциноза в осложненных атеросклеротических бляшках, а также в неизменной интиме аорты человека и в аорте быка. Роль макроваскулярных перицитоподобных клеток в физиологии и патологии интимы магистральных артерий была недавно подробно проанализирована в обзоре Orekhov et al. (2014). Мы выявили перицитоподобные клетки в субэндотелии сосудов различного диаметра, а также в области vasa vasorum в наружной половине медии артерий, в медиальном слое вен и в адвентиции сосудов. Присутствие 3G5-положительных клеток во всем медиальном слое вен связано, по-видимому, с высокой степенью васкуляризации стенки этих сосудов. Таким образом, использование антител против антигенов, характерных для перицитов позволило нам выявить две популяции клеток: 1) перициты терминального капиллярного русла и vasa vasorum и 2) перицитоподобные клетки, не связанные непосредственно с микроциркуляторным руслом - клетки субэндотелиальной интимы сосудов крупного и среднего калибра. Наличие общих антигенов у клеток этих двух популяций позволяет предположить и наличие у них сходных функций, связанных с их периэндотелиальным положением. Структура и возможные функции перицитов в капиллярном русле описаны достаточно подробно [Sims, 1991; Diaz-Flores et al., 1991; Schor et al., 1995; Armulik et al., 2011; Trost et al., 2016]. Считается, что перициты терминальной капиллярной сети морфологически переходят в гладкомышечные клетки мелких артерий [Diaz-Flores et al., 1991]. Морфология перицитов сходна как с гладкомышечными клетками (сократительный аппарат, ограничивающая базальная мембрана, пиноцитозные пузырьки), так и с фибробластами (большое количество синтетических органелл) [Sims, 1991; Schor et al., 1995]. Относительно функций перицитов сведения крайне разноречивы. Предполагается, что перициты активно вовлечены в различные процессы, сопровождаемые нарушением микроциркуляции: диабет, воспаление, заживление ран, гипертония, неоплазия [Armulik et al., 2011; Ivanova et al., 2015; Trost et al., 2016]. Обнаружение в перицитах сократительных филаментов гладкомышечных клеток позволило предположить наличие у них сократительной функции [Sims, 1991]. Однако, в настоящее время считается, что давление в терминальном капиллярном русле регулируется за счет гладкомышечных клеток в претерминальных артериолах и венулах [Diaz-Flores et al., 1991]. Предполагaется, что перициты могут координировать функции эндотелия, включая пролиферацию эндотелиальных клеток и обмен молекул и ионов [Diaz-Flores et al., 1991; Schor et al., 1995]. В настоящее время одной из важнейших функций перицитов считается функция клеток-предшественников для других клеток мезенхимального происхождения: гладкомышечных клеток, остеобластов, хондроцитов, адипоцитов [Diaz-Flores et al., 1991; Armulik et al., 2011]. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что перициты представляют собой популяцию очень лабильных клеток, способных в зависимости от условий к самым разнообразным реакциям. Это согласуется с ранними представлениями о субэндотелиальных клетках, как плюрипотентных камбиальных клетках (Щелкунов, 1935), клетках мезенхимального резерва (Максимов, 1927).
Влияние плотности посадки на пролиферативную активность и жизнеспособность
В результате проведенного исследования нам удалось установить, что жтМСК, предварительно культивированные при 5% О2, после субкультивирования с низкой плотностью обладали более высокой пролиферативной активностью, чем клетки, предкультивированные в нормоксии. Кроме того, среди нормоксических жтМСК при низкой плотности посадки была высока доля апоптотических клеток, что свидетельствует о том, что клетки находились в стрессогенных условиях. Надо отметить, что при исходно высокой плотности посадки среди жтМСК при 5% О2 была выше доля некротических клеток, что связано, по-видимому с тем, что к моменту анализа клетки образовывали очень плотный монослой.
Таким образом, жтМСК, культивируемые при 5% О2, оказались более устойчивы к недостатку аутокринных факторов, обусловленного малой плотностью посадки клеток, предварительно десенситизированных культивированием в высокой плотности.
Способность жтМСК к ненаправленной миграции оценивали в модели «раны». Для этого на монослой жтМСК наносили царапину и микроскопически контролировали закрытие дефекта (Рисунок 2-8 а-г). При микроскопическом анализе можно было видеть, что при обеих концентрациях О2 после повреждения монослоя в жтМСК формировались выраженные стресс-фибриллы F-актина, окрашенные существенно ярче, чем в контроле (Рисунок 2-8 б), а также увеличивалась интенсивность окраски виментина – белка промежуточных филаментов при окраске соответствующими антителами (Рисунок 2-8 в). Наблюдение в течение 48 часов после повреждения монослоя МСК показало, что скорость миграции жтМСК не зависит от концентрации О2 (Рисунок 2-8 г).
Способность МСК направляться по наиболее очевидным, учитывая их происхождение, путям дифференцировки – остео-, хондро- и адипогенному как in vitro, так и in vivo убедительно продемонстрирована в многочисленных работах [см. обзоры Калинина и др., 2011; Буравкова и др., 2012; Zuk et al., 2001; Caplan, 2007]. In vitro в нормоксии при действии остеогенных стимулов в МСК увеличивается активность а
Ненаправленная миграция жтМСК при различном содержании О2 в модели «раны»: репрезентативные микрофото фиксированных полей зрения сразу и через 24 часа после нанесения повреждения монослою жтМСК, фазовый контраст, ув.100х; б - временная динамика закрытия «раны» в – микрофиламенты F-актин; г – промежуточные филаменты (виментин); в,г -Совместно с проф. С.В.Буравковым, ФФМ, МГУ) щелочной фосфатазы, происходит образование клеточных агрегатов – нодул и минерализация внеклеточного матрикса. Наличие хондрогенных дифференцировочных стимулов при определенных условиях культивирования (трехмерная система, отсутствие сыворотки) приводит к образованию многослойного, богатого внеклеточным матриксом образования, морфологически и гистологически сходного с хрящевой тканью, что в том числе доказывается присутствием специфических для хряща компонентов матрикса, таких как коллаген II и IX типов и протеогликанов. В присутствии адипогенных индукторов МСК способны дифференцироваться в адипобласты и далее формировать адипоциты. При анализе эффектов пониженного содержания О2 на дифференцировочный потенциал МСК из различных тканевых источников в большинстве исследований показано снижение остео-, адипо- и увеличение хондро-дифференцировки как на уровне транскрипции, так и на трансляции соответствующих продуктов. Так, после остеиндукции выявлено снижение активности щелочной фосфатазы в МСК [D Ippolito et al., 2006; Fehrer et al., 2007], минерализации матрикса [D Ippolito et al., 2006; Malladi et al., 2006; Fehrer et al., 2007; Гринаковская и др., 2009; Жамбалова и др., 2009; Iida et al., 2010; Valorani et al., 2010; Volkmer et al., 2010; Choi et al., 2014], а также экспрессии «остео» генов, таких как ALP (щелочная фосфатаза) [Volkmer et al., 2010; Iida et al., 2010; Yang et al., 2011], SPP1 (остеопонтин) и BGLAP (остеокальцин) [Volkmer et al., 2010; Yang et al., 2011] , IBSP (костный сиалобелок) [Fehrer et al.. 2007; Dos Santos et al., 2010], COL1A1 (коллаген I типа) [Yang et al., 2011], транскрипционного фактора RUNX2 [D Ippolito et al., 2006; Yang et al., 2012]. Установлено, что уменьшение экспрессии фактора RUNX2 является HIF-зависимым [Tamama et al., 2010; Yang et al., 2011]. Высказано предположение, что подавление экспрессии транскрипционного фактора RUNX2 и генов-основных маркеров остеогенной дифференцировки ALP, BGLAP происходит в результате паракринной активации сигнального каскада с участием киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK) [Wang et al., 2005, 2012]. Надо отметить, что даже короткая экспозиция МСК в условиях, близких к аноксии ( 0,02% О2, 12 часов) может замедлять остеоиндукцию в стандартных условиях культивирования (20% О2) как на уровне транскрипции генов RUNX2, костных коллагенов COLI, COLIII, COLVI, остеопонтина и остеоглицина, а также формирования минерализованного матрикса. При обычной гипоксии (2% О2, 24 часа) такие эффекты обнаружены не были [Salim et al., 2004].
При адипоиндукции в гипоксии накопление липидных капель в МСК уменьшается [Fehrer et al., 2007; Buravkova et al., 2013]. Кроме того, показано снижение транскрипционной активности генов, имеющих отношение к адипогенезу: LPL (липопротеинлипаза), FABP4 (белок, связывающий жирные кислоты -4) [Fehrer et al.. 2007; Dos Santos et al., 2010; Valorani et al., 2010], PPAR-y [Valorani et al., 2010], FASN (синтаза жирных кислот), СFD (фактор комплимента D, адипсин) [Hung et al., 2012]. Lin и сотрудники (2006) показали, что гипоксия способствует сохранению недифференцированного состояния МСК жировой ткани и способствует поддержанию экспрессии в этих клетках фактора пре-адипоцитов-1 (Pref-І), который подавляет адиподифференцировку [Lin et al., 2006]. Относительно механизмов, обеспечивающих такой эффект в гипоксии, единого мнения нет. Часть имеющихся данных дает основание полагать, что замедление адиподифференцировки опосредовано HIF1 [Fink et al., 2004; Floyd et al., 2007; Irwin et al., 2007]. Кроме того, предложен другой механизм, в котором подавление адипоиндукции может быть опосредовано одним из сигнальных путей стресс-ответа клетки, связанных с эндоплазматическим ретикулумом [Tamama et al., 2010].
В отличие от дифференцировки в остео- и адипо- направлениях, считается, в условиях гипоксии МСК более активно отвечают на хондрогенные стимулы [Khan et al., 2010; Merceron et al., 2010]. Об этом свидетельствует увеличение продукции компонентов матрикса, характерных для ткани хряща: несульфатированных гликозаминогликанов и хондроитин-4-сульфата [Wang et al., 2005], аггрекана, коллагена II, IX, XI типов [Khan et al., 2010], а также увеличении транскрипции «хондро» генов: SOX6, SOX5, SOX9 [Wang et al., 2005; Khan et al., 2010; Merceron et al., 2010], COL2A1, AGC1 [Merceron et al., 2010].
Необходимо отметить, что существуют и другие данные об эффектах гипоксии на дифференцировку МСК. Описано увеличение остео-матрикса и количества липидных капель, а также оверэкспрессия RUNX2, ALP, PPAR-y и LPL [Grayson et al., 2007; Basciano et al., 2011]. Dos Santos et al. [2010] не обнаружили различий в дифференцировочном потенциале в нормоксии и гипоксии. Hung с соавторами (2012) показали более активную дифференцировку кмМСК при 20% О2, чем в 1% О2, о чем свидетельствовало наличие морфологически зрелых хондроцитов. Кроме того, в условиях гипоксии было продемонстрировано значительное снижение транскрипции COL2A1 (коллаген II), СОМР (олигомерный белок хрящевой ткани) и ,4С4#(аггрекан) [Hung et al., 2012].
Таким образом, массив данных относительно дифференцировочного потенциала МСК в гипоксии in vitro достаточно гетерогенен, что связано со значительными вариациями как в тканевых источниках МСК, так и дизайне экспериментов. В нашей лаборатории была проведена серия экспериментов по изучению изменения дифференцировочных потенций жтМСК при постоянном культивировании в условиях «физиологической» гипоксии и обратимости этих изменений. После добавления остеогенных стимулов оценивали эффективность индукции через 10 дней, гистохимически выявляя активность щелочной фосфатазы – раннего маркера остеокоммитирования, а через 21 день – по степени минерализации внеклеточного матрикса после окраски ализариновым красным для характеристики поздних этапов остеодифференцировки. На поздних сроках оценивали также возможность обратимости индуцированного ответа при изменении концентрации О2, при которой происходит остеостимуляция (Рисунок 2-9). Предполагалось получить ответы на два вопроса: изменяется ли коммитирование жтМСК в ответ на дифференцировочные стимулы в гипоксии по сравнению с нормоксией. Если эти изменения происходят, то насколько они являются обратимыми.
Дифференциальная экспрессия генов, кодирующих продукты, регулирующие пролиферацию
В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании того, каким образом гипоксия действует не только на организм в целом, но и на отдельные клетки. Понижение содержания кислорода запускает ряд внутриклеточных механизмов, направленных на обеспечение функционирования в новых условиях, регулируемых несколькими транскрипционными факторами, такими как гипоксия-индуцируемые факторы (HIF), пролилгидроксилазы, фактор, ингибирующий HIF-1 (FIH-1), белок-активатор 1 (AP-1), ядерный фактор (NF)-B, p53, c-Myc [Kenneth & Rocha, 2008]. Хотя для клеточного ответа необходимо взаимодействие этих факторов, молекулы HIF (и в особенности, HIF-1) рассматриваются как ключевые в процессе адаптации клетки к гипоксии [Semenza, 2012]. Результатом может быть как гибель клетки, так и ее выживание, причем до сих пор факторы, регулирующие этот баланс, до конца не изучены. Число известных генов мишеней HIF постоянно растет. Эти гены кодируют белки, играющие важную роль в адаптации клетки к острой и хронической гипоксии [Wenger, 2002; Semenza, 2012], обеспечивающие функционирование клетки в анаэробных условиях, регулирующие синтез АТФ, отвечающие за увеличение содержания кислорода в ткани за счет стимуляции эритропоэза, ангиогенеза и регуляции тонуса сосудов, влияющие на жизнеспособность и пролиферацию клеток, белки цитоскелета и внеклеточного матрикса, транскрипционные факторы [Анохина и Буравкова, 2010; Haque et al., 2013] (Рисунок 3-1). Согласно современным представлениям, транскрипционный фактор HIF-1 представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц, HIF-1 и HIF-1 [Fong, 2008]. HIF-1 субъединица нечувствительна к концентрации О2, тогда как HIF-1 кислород-зависима. Соответственно, при стандартных условиях HIF-1 синтезируется и быстро деградирует, а в гипоксических условиях ее деградация замедляется [Fong, 2008; Weidemann & Johnson, 2008]. HIF-1 при атмосферном О2 (Рисунок 3-1) регулируется HIF-1 пролилгидроксилазами (HPHs) [Jaakkola et al., 2001], которые в присутствии кислорода, ионов железа и -кетоглутарата гидроксилируют HIF-1 [Metzen et al., 2003]. В свою очередь, это приводит к конформационным изменениям HIF-1, позволяя фактору фон Хиппель-Линдау (VHL) связаться с ним [Sharp & Bernaudin, 2004]. В дальнейшем VHL образует комплекс с E3 убиквитинлигазой (E3UL), которая убиквитинилирует HIF-1 для последующей деградации в протеосомах [Ivan et al., 2001; Sharp & Bernaudin, 2004]. Рисунок 3-1. Регуляция транскрипции через HIF-1 в стандартных (20% О2) и «гипоксических» условиях.
HIF - гипоксия-индуцируемый фактор; НРН - HIF-1 пролилгидроксилазы; VHL - фактор фон Хиппель-Линдау; E3UL - Е3 убиквитинлигаза; HRE - чувствительный к гипоксии элемент; GLUT - транспортер глюкозы; LDH - лактатдегидрогеназа; PDK - киназа пируватдегидрогеназы. Адаптировано из Haque et al., 2013
Напротив, в гипоксических условиях активность пролилгидроксилаз подавляется вследствие снижения концентрации О2, что приводит к накоплению HIF-1 и его транслокации в ядро, где образуется димер с HIF-1 [Weidemann & Johnson, 2008]. Затем HIF-1 гетеродимер связывается с чувствительным к гипоксии элементом (HRE) в генах-мишенях и регулирует транскрипцию более 70 генов, вовлеченных в метаболизм, ангиогенез, миграцию и др. [Brahimi-Horn & Pouyssgur, 2007].
К сигнальным путям, которые могут быть задействованы в регуляции HIF, относятся, прежде всего, каскады митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) [Wenger, 2002; Lisy & Peet, 2008; Semenza, 2012]. Показано, что каскад cтресс-активированных протеинкиназ/Jun аминоконцевых киназ (SAPK/JNK), который обычно активируется в условиях стресса, например, при воздействии на клетку ультрафиолетового облучения, токсинов, “стрессовых” цитокинов (ИЛ-1 или фактор некроз опухоли (ФНО)), может также стимулироваться гипоксией. Активация JNK/SAPK и p38 киназных путей в условиях гипоксии была продемонстрирована на многих типах клеток [Kunz & Ibrahim, 2003]. Другой способ модуляции активности HIF-1 предположительно может осуществляться через активацию каскада фосфоинозитид 3-киназы/серин-теонин киназы Akt (РІЗ/Akt) [Alvarezejado et al., 2001]. Так, ингибирование PI3-киназы приводило к подавлению многих HIF-1-зависимых клеточных ответов. Полагают, что Akt-1 индуцирует трансляцию HIF-1, но не влияет на его стабилизацию [Wenger, 2002], зато кислород-независимая стабилизация -субъединицы достигается при ее связывании с белком теплового шока Hsp90 [Liu & Semenza, 2007]. Кроме того, имеются данные об участии АФК в активации этих сигнальных путей при гипоксии [Tobiume et al., 2001; Dougherty et al., 2004]. В ряде экспериментов в гипоксических условиях была отмечена активация в клетках протеинкиназы С [Resink et al., 1996; Sahai et al., 1997] и протеинкиназы G [Jernigan et al., 2004].
Приведенные выше данные показывают, насколько многоуровневым является механизм ответа клеток на гипоксический стимул, причем результат зависит от многих факторов, таких как тип клеток, степень их дифференцированности, время воздействия и т.д. В отношении МСК такие данные относятся, в основном, к эффектам краткосрочных гипоксических экспозиций (до 72 часов). Для МСК, экспансия которых ведется при атмосферном (20%) О2, показано существенное увеличение транскрипционной активности HIF-la через 18 часов после экспозиции при 1% О2 [Proulx-Bonneau et al., 2011]. Кроме того, по данным иммуноблотинга экспрессия HIF-la показана уже через 6-12 часов [Lee et al., 2010], подтверждена через 24 [Ни et al., 2008; Chacko et al., 2010; Peterson et al., 2011] и через 72 часа [Lavrentieva et al., 2010]. В результате стабилизации НШ-1, как уже говорилось выше, в МСК запускаются различные сигнальные механизмы, обеспечивая ответ на гипоксический стимул. Надо отметить, что имеющиеся к настоящему времени результаты демонстрируют разнонаправленные эффекты. Так, после 24 часовой экспозиции при 1% О2 обнаружено увеличение экспрессии BCL2/BAX [Peterson et al., 2011] и снижение содержания сурвивина - негативного регулятора апоптоза, а в работе Chacko et al. (2010) в тех же экспериментальных условиях было показано увеличение продукции этого антиапоптотического белка. Показано некоторое возрастание доли фосфорилированной формы Akt-киназы, которая участвует в регуляции различных биологических процессов, таких как жизнеспособность, пролиферация, метаболизм гликогена [Chacko et al., 2010; Peterson et al., 2011]. Кроме того, обнаружено увеличение соотношения PI3K (фермент, регулируемый Akt)/PTEN (негативный регулятор Akt) [Xu et al., 2008; Peterson et al., 2011]. Краткосрочная гипоксия вызывала снижение соотношения киназ, регулируемых внеклеточными сигналами (ERK1/2) [Crisostomo et al., 2008; Peterson et al., 2011]. Данные относительно HIF-регулирующих киназ также неоднозначны. Гипоксия-индуцированное фосфорилирование р38 МАРК описано Lee et al. [2010], но Peterson et al. [2011] продемонстрировали снижение экспрессии этой киназы. Активация SAPK/JNK была выявлена в работах [Lee et al., 2010; Busletta et al., 2011], но [Zhang et al., 2009; Chang et al., 2009] обнаружили ингибирование этого фермента. Приведенные данные показывают, что ответ МСК на резкое снижение концентрации О2 представляет собой очень динамичный процесс, связанный с балансом про/антиапоптотических эффектов. Есть данные, что краткосрочное действие гипоксии в сочетании с депривацией факторов роста приводит к индукции апоптоза в МСК [Zhu et al., 2006; Peterson et al., 2011; Zhang et al., 2009; Chang et al., 2009].
Влияние факторов микроокружения на иммуномодуляторные эффекты МСК
Как известно, моноциты обладают высокой адгезивной способностью, поэтому увеличение их доли среди прикрепившихся ФГА-МНК можно было бы рассматривать как нормальную физиологическую реакцию этих клеток. Однако, достоверное превышение над значениями для монокультуры позволяет предполагать селективную адгезию к жтМСК за счет специфических клеточных контактов, а более эффективное прикрепление в «физиологической» гипоксии – включение каких-то дополнительных сигнальных механизмов, которые еще только предстоит исследовать. На основании полученных данных можно предположить, что при прямом контакте ФГА-МНК с жтМСК может происходить активация клеток врожденного иммунитета, что необходимо учитывать в протоколах аллогенного использования МСК в клеточной терапии и регенеративной медицине.
Как уже обсуждалось в начале настоящей Главы особая привлекательность МСК для регенеративной медицины связана с возможностью их аллогенного введения, обусловленного такими свойствами этих клеток, как низкая иммуногенность и способность к иммуносупрессии, которые к настоящему времени достаточно подробно изучены [Uccelli et al., 2006; Nauta & Fibbe, 2007; Jones & McTaggart 2008; Ankrum et al., 2014; Castro-Manrreza & Montesinos, 2015]. Известно, что иммунный ответ, опосредованный Т-клетками, ингибируется при гипоксии in vivo [Sitkovsky & Lukashev, 2005] и in vitro [Naldini et al., 1999; Caldwell et al., 2001; Romn et al., 2002; Mikko et al., 2009]. По нашим данным соотношение популяций лимфоцитов и субпопуляций Т-клеток in vitro существенным образом не изменяется в ответ на пониженное содержание О2, что, по-видимому, является следствием способности Т-лимфоцитов адаптироваться к изменениям напряжения О2. Однако, в присутствии жтМСК мы выявили увеличение доли Т-клеток – естественных киллеров (Т-ЕК), как при 20%, так и при 5% О2 и снижение доли CD8+ цитотоксических Т-клеток, что указывает на возможные изменения в системе врожденного иммунитета. Данных по изменению субпопуляционного состава Т-лимфоцитов при сокультивировании с МСК крайне мало. Показано снижение доли CD3+/CD8+ клеток после взаимодействия с МСК человека [Maсcario et al., 2005], что подтверждается нашими данными. Кроме того, МСК способны ингибировать пролиферативную активность CD3+/CD8+ клеток, стимулированных митогенами [Li Pira et al., 2006; Sato et al., 2007; Ramasamy et al., 2008], это может являться причиной снижения доли СD8+- клеток среди Т-лимфоцитов. Относительно Т-хелперов известно, что при сокультивировании с МСК пролиферация стимулированных CD3+/CD4+ клеток уменьшается [Sato et al., 2007; Ramasamy et al., 2008], с другой стороны, повышается пролиферативная активность CD4+/CD25+ регуляторных Т-клеток [Crop et al., 2010; Zhao et al., 2012; Quaedackers et al., 2009]. В результате наложения этих двух разнонаправленных эффектов влияние МСК на субпопуляцию CD4+ клеток может нивелироваться, поэтому в результате процент Т-хелперов не изменяется, что подтверждается нашими данными.
Литературные данные о влиянии МСК на активацию МНК в большинстве описывают эффекты, полученные при 20% О2, и достаточно разнородны, что связано, отчасти, с различиями в экспериментальных подходах [см. обзор Gornostaeva et al., 2015]. Так, при взаимодействии МСК с митоген-активированными лимфоцитами в смешанной культуре, показано уменьшение доли Т-клеток, имеющих маркерные антигены ранней и поздней активации (CD25, CD69, CD38 и HLA-DR) [Ko et al., 2002; Prevosto et al., 2007; Najar et al.,2009]. При использовании в качестве аллоантигена синтетического пептида влияния на экспрессию CD25 и CD69 обнаружено не было [Le Blanc et al., 2004; Krampera et al., 2005]. При стимуляции лимфоцитов антителами CD2/CD3/CD28 показано увеличение экспрессии СD69 после сокультивирования с МСК [Le Blanc et al., 2003]. По нашим данным в присутствии жтМСК МНК, стимулированные митогеном (ФГА), демонстрировали снижение экспрессии CD25 и HLA-DR как в нормоксии, так и в гипоксии. Надо отметить, что экспрессия маркеров ранней активации, таких как CD25, по мнению ряда авторов, не может служить достаточно надежным критерием для оценки иммуносупрессивного эффекта МСК, т.к. наличие этих молекул может зависеть не только от стимуляции лимфоцитов, но и определяться другими эндо- и экзогенными факторами [Le Blanc et al., 2003; Abdi et al., 2008]. Более стабильным представляется ответ лимфоцитов, связанный с экспрессией HLA-DR, присутствие которого на клетках обуславливает их вовлечение в реакцию «хозяин против трансплантата». Показано, что при взаимодействии с МСК снижается активация Т-клеток по этому маркеру [Taupin et al., 2006; Abdi et al., 2008], что подтверждают и наши данные с жтМСК. Кроме того, существенным факторами, влияющими на характер межклеточных взаимодействий, являются условия микроокружения, такие как концентрация О2. Нам впервые удалось показать, что в условиях «физиологической» гипоксии жтМСК не только сохраняют супрессивные свойства в отношении Т-клеток, активированных по HLA-DR антигену, но и могут оказывать более выраженный эффект.
Наши результаты позволяют предположить, что способность к презентации антигенов Т-лимфоцитами за счет экспрессии HLA-DR будет еще более подавленной в тканях при введении аллогенных МСК, экспансия которых проведена в гипоксии, что положительным образом отразится на процессах тканевой репарации и/или приживлении трансплантата.
Несмотря на значительные усилия, направленные на исследование «иммуносупрессивного» феномена МСК, значение прямых клеточных контактов стромальных и иммунных клеток в реализации иммуномодулирующих свойств МСК исследовано в гораздо меньшей степени Предполагается, что непосредственный межклеточный контакт МНК/МСК может потенцировать иммуномодуляторную активность стромальных предшественников, однако исследования, посвященные описанию такого взаимодействия, единичны [Li Pira et al., 2006; Suva et al., 2008; Quaedackers et al., 2009], хотя исследования с использованием трансвеллов, обеспечивающих отсутствие физического контакта между МНК и МСК, подтвердили необходимость прямого взаимодействия «клетка-клетка» для наиболее полного иммуносупрессивного эффекта (Puissant et al., 2005). Тем не менее, к примеру, пролиферативную активность МНК обычно определяют в суспензии лимфоцитов даже в тех случаях, когда изучается их контактное взаимодействие с МСК в монослое [Le Blanc et al., 2004; Suva et al., 2008].
В настоящей работе мы показали, что активированные ФГА мононуклеары периферической крови, в отличие от неактивированных иммунных клеток, способны более эффективно прикрепляться к жтМСК, распластываться на их поверхности и трансмигрировать под стромальные клетки. Мы обнаружили, что в нормоксии и гипоксии активированные МНК, адгезированные к жтМСК, обладали сходной и очень высокой, по сравнению с МНК в суспензии, жизнеспособностью и не отличались по экспрессии основных лейкоцитарных антигенов. При этом морфологический анализ выявил в гипоксии больше МНК, хорошо распластанных на клетках стромы. Это может вносить существенный вклад в регуляцию взаимодействия МНК и жтМСК. Такое взаимодействие опосредуется, по крайней мере, одним высокоспецифичным лиганд-рецепторным путем, связанным с экспрессией молекулы межклеточной адгезии-1 ICAM-1 [Андреева и др., 2011]. Важность этого наблюдения подтверждают результаты недавно опубликованного исследования, посвященного роли молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и VCAM-1 в регуляции иммуносупрессивных свойств МСК. Оказалось, что увеличение экспрессии этих молекул на МСК, сопровождающееся усиленной адгезией лимфоцитов, приводит к возрастанию иммуносупрессивной активности МСК. Более того, оказалось, что экспрессия ICAM-1 и VCAM-1 индуцируется в присутствии ИФН- и воспалительных цитокинов: ФНО-а или ИЛ-1, что также может вносить вклад в подавление пролиферативной активности МНК [Ren et al., 2010].
Наши данные хорошо согласуются с результатами Suva et al. (2008), которые также продемонстрировали, что активированные Т-клетки не только адгезируют к монослою МСК, но и проникают в подклеточное пространство. Т-лимфоциты могли находиться под МСК более 60 часов, а затем вновь перемещались в суспензию. Изучение иммунофенотипа Т-клеток, адгезированных к МСК показало, что популяция этих клеток по сравнению с неприкрепленными лимфоцитами содержит больше СБ8+клеток, обогащена СВ4"СБ8"-клетками и обеднена СБ4+лимфоцитами. Прикрепленные CD4+ клетки активно пролиферировали и демонстрировали увеличенную экспрессию маркеров активации CD25 и FoxP3. Однако, эти клетки также несли CD 127, что исключало наличие у них функций Т-регуляторных лимфоцитов. Адгезия лимфоцитов к МСК приводила к ингибированию способности СБ8+-клеток отвечать на провоспалительные стимулы и уменьшению вовлечения CD4+ клеток в иммунный ответ [Quaedackers et al., 2009].
При оценке эффекта непосредственного межклеточного взаимодействия стромы (МСК и фибробласты) и МНК (антиген-стимулированные CD4+ и СБ8+лимфоциты) оказалось, что при уменьшении плотности стромальных клеток дозозависимо увеличивалась пролиферация лимфоцитов, т.е. иммуносупрессивный эффект уменьшался [Li Pira et al., 2006]. Авторы полагают, что монослой стромальных клеток физически препятствует образованию комплексов активированных лимфоцитов с антиген-презентирующими клетками, тормозя таким образом пролиферацию Т-клеток. Эти данные представляют интерес с двух точек зрения. Во-первых, показано, что иммуномодуляторными свойствами могут обладать не только МСК [Meisel et al., 2004], но и другие стромальные клетки (в данном случае - фибробласты кожи человека) [Sarkosh et al., 2003] через ШО-опосредованную деградацию триптофана [Mellor & Munn, 2004]. Во-вторых, продемонстрирована прямая зависимость исхода взаимодействия стромальных и иммунных клеток от их непосредственного физического контакта.