Молекулярные механизмы демаскировки вазоконстрикторного действия 5-HT2B рецепторов Миронова Галина Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литертатуры 12

1.1 Строение сосудов 12

1.2 Регуляция кальциевого обмена в гладкомышечных клетках сосудов 15

1.2.1 Регуляция кальциевого обмена с помощью кальциевых каналов и насосов цитоплазматической мембраны 15

1.2.2 Регуляция кальциевого обмена с помощью кальциевых каналов и насосов сарко/эндоплазматического ретикулума 18

1.3 Механизм сокращения сосудов 19

1.4 Артериальная гипертензия 22

1.4.1 Модель ДОКА-солевой гипертензии крыс 22

1.4.2 Патогенез ДОКА-солевой гипертензии 23

1.4.3 NADPH-оксидазы и АФК в патогенезе гипертензии 26

1.4.4 Образование и обмен АФК при гипертензии 28

1.4.5 NADPH-оксидазы 30

1.4.6 Регуляция NADPH-оксидазной активности 31

1.4.7 NADPH-оксидазы, оксидативный стресс и гипертензия 31

1.5 Роль серотонина в регуляции сосудистой сократимости 35

1.5.1 Общие сведения 35

1.5.2 Биосинтез серотонина 36

1.5.3 Влияние серотонина на тонус сосудов 38

Глава 2. Материалы и методы 44

2.1 Реактивы 44

2.2 Животные 44

2.3 Вестерн-Блоттинг 44

2.4 Иммунофлуоресцентное окрашивание 5-HT2B рецепторов в ГМК 45

2.5 ПЦР в реальном времени 46

2.6 Измерение сокращения аорты и брыжеечной артерии в изометрическом режиме 47

2.7 Культура гладкомышечных клеток выделенных из аорты крысы 48

2.8 Культура эндотелиальных клеток выделенных из пупочной вены человека 49

2.9 Измерение изменения концентрации цитоплазматического кальция в гладкомышечных клетках аорты крысы с помощью флуоресцентного зонда Fura-2AM 50

2.10 Измерение изменения концентрации цитоплазматического кальция в эндотелиальных клетках, выделенных из пупочной вены человека, с помощью флуоресцентного зонда Calcium Green-1AM 51

2.11 Измерение изменения концентрации активных форм кислорода в гладкомышечных клетках аорты крысы с помощью флуоресцентного зонда H2DCF-DA 51

2.12 Статистика 52

Глава 3. Результаты 53

3.1 Оценка экспрессии 5-HT2B рецепторов в аорте, брыжеечной артерии и гладкомышечных клетках, выделенных из аорты крысы 53

3.2 Влияние агониста рецепторов 5-НТ2В BW723C86 на кальциевый обмен в гладкомышечных клетках, выделенных из аорты крысы 55

3.3 Влияние агониста рецепторов 5-НТ2В BW723C86 на образование активных форм кислорода в гладкомышечных клетках, выделенных из аорты крысы 63

3.4 Роль NADPH-оксидаз и активных форм кислорода в регуляции кальциевого обмена 5-НТ2В рецепторами в эндотелиальных клетках пупочной вены человека 68

3.5 Эксперименты на изолированных сосудах крысы 73

Глава 4. Обсуждение 77

4.1 Экспрессия 5-НТ2В рецепторов в ГМК 77

4.2 Влияние АФК на регуляцию обмена кальция в ГМК при активации 5-HT2B рецепторов; роль тирозинового фосфорилирования 78

4.3 Индукция образования АФК вызывает усиление кальциевого сигнала 5-НТ2В рецепторов в ЭК пупочной вены человека 83

4.4 Демаскировка вазоконстрикторного действия агониста 5-НТ2В рецепторов BW723C86 под влиянием АФК 84

Заключение 87

Выводы 88

Список сокращений 89

Список литературы 90

• Механизм сокращения сосудов
• Влияние агониста рецепторов 5-НТ2В BW723C86 на кальциевый обмен в гладкомышечных клетках, выделенных из аорты крысы
• Эксперименты на изолированных сосудах крысы
• Влияние АФК на регуляцию обмена кальция в ГМК при активации 5-HT2B рецепторов; роль тирозинового фосфорилирования

Введение к работе

Актуальность. Серотонин играет важную роль в регуляции множества процессов в организме. Серотониновые рецепторы отвечают за центральный и периферический контроль цикла сна и бодрствования, терморегуляции, ноцицепции, аппетита, перистальтики желудочно-кишечного тракта , регулируют половое поведение, работу сердечно-сосудистой системы и др . [Darmon et al., 2015]. Изменение уровня экспрессии или нарушение функциональной активности серотониновых рецепторов может привести к развитию патологических состояний. Существуют 7 типов серотониновых рецепторов, один из которых является лиганд-управляемым ионным каналом, а остальные представляют собой рецепторы, сопряженные с G-белком. В сердечно-сосудистой системе представлены серотониновые рецепторы 1, 2, 3, 4 и 7 типов, показано их влияние на тонус сосудов, развитие и функцию сердечной мышцы [Watts et al., 2012]. В ажную роль в со кращении сосудов играют рецепторы серотонина второго типа, которые в свою очередь подразделяются на 2A, 2B и 2C рецепторы (5-HT_2A, 5-HT_2B, 5-HT_2C). 5-HT_2A рецепторы – это основные вазоконстрикторы, широко представленные в различных с осудах [Kaumann and Levy, 2006]. Роль 5-HT_2C рецепторов мало изучена, есть сведения об их участии в сокращении аорты [Кожевникова и соавт., 2014]. 5-HT_2B рецепторы экспрессируются в клетках сердца, эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов , показана их роль в регуляции уровня серотонина в крови [Watts et al., 2012]. Изменения в экспрессии и функции 5-HT_2B рецепторов сопровождает развитие легочной гипертензии [Launay et al., 2002], диабета II типа [Nelson et al., 2012], ДОКА-солевой (ДОКА – дезоксикортикостерона ацетат) и L-NAME-индуцированной гипертензии у крыс [Banes and Watts, 2003; Russell et al., 2002; Watts and Fink, 1999]. По данным литературы, 5-HT_2B рецепторы выполняют роль вазодилататоров в норме, однако, при ДОКА-солевой гипертензии, L-NAME-индуцированной гипертензии, диабете II типа, они начинают работать как вазоконстрикторы. Это может быть связано как с увеличением их уровня экспрессии в гладкомышечных клетках сосудов (ГМК) при данных патологиях, так и с увеличением эффективности передачи сигнала от рецептора на системы мобилизации кальция в клетке. Причины изменений активности 5-HT_2B рецепторов не установлены. Известно, что при диабете и гипертензии клетки сосудистой стенки испытывают оксидативный стресс [Iyer et al., 2010; Descorbeth et al. 2010]. Также есть данные о том, что тирозиновые Src-киназы принимают участие в сократительном ответе на серотонин в аорте крысы и являются чувствительными к увеличению содержания внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) [Chiarugi and Cirri, 2003; Lu et al., 2008]. Последнее связано с тем, что АФК ингибируют тирозиновые фосфатазы (PTP) [Nakashima et al., 2002]. Мы предположили, что нарушение баланса тирозинового фосфорилирования/дефосфорилирования за счет увеличения внутриклеточной концентрации АФК может приводить к демаскировке

вазоконстрикторного эффекта 5-HT_2B рецепторов, то есть активации сигнального пути, не реализующегося в норме, приводящего к сокращению сосуда. Одним из источников внутриклеточных АФК являются NADPH-оксидазы, повышенная активность которых способствует развитию оксидативного стресса при гипертензии. Это говорит о возможности их участия в реализации сокращения сосуда при активации 5-HT_2B рецепторов при патологических состояниях [Iyer et al., 2010].

Цель и задачи исследования. Целью исследования было изучить сигнальные пути 5-HT_2B рецепторов в клетках сосудов и выявить условия демаскировки их вазоконстрикторного действия. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить уровень экспрессии вазоконстрикторных серотониновых рецепторов (5-HT_2A, 5-HT_2В, 5-HT_2C, 5-HT_1B) в брыжеечной артерии и аорте крысы, в гладкомышечных клетках (ГМК), выделенных из аорты крысы; оценить относительное содержание 5-HT_2B рецепторов;

2. Определить функциональную роль 5-HT_2В рецепторов в регуляции обмена ионов кальция и в образовании активных форм кислорода (АФК) в ГМК; оценить вклад NADPH-оксидаз в образование АФК и регуляцию кальциевого обмена в ГМК аорты крысы при активации 5-HT_2В рецепторов;

3) Изучить влияние индукторов образования А ФК на обмен
внутриклеточного кальция в культивируемых ГМК аорты крысы и
эндотелиальных клетках (ЭК) пупочной вены человека при активации 5-HT_2B
рецепторов;

4) Выявить возможную связь опосредованного 5-HT_2В рецепторами
обмена кальция в условиях окислительного стресса с балансом тирозинового
фосфорилирования/дефосфорилирования в ГМК аорты крысы;

5) Исследовать роль NADPH-оксидаз в регуляции кальциевого обмена
при активации 5-HT_2B рецепторов в ЭК пупочной вены человека;

6) Определить, влияет ли образование АФК и сдвиг баланса тирозинового
фосфорилирования на демаскировку вазоконстрикторного эффекта 5-HT_2B
рецепторов в брыжеечной артерии и аорте крысы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе показано, что уровень экспрессии 5-HT_2В рецепторов в гладкомышечных клетках аорты крысы сопоставим с уровнем экспрессии рецепторов 5-HT_2А – основных вазоконстрикторных рецепторов серотонина, однако в отличие от 5-HT_2А, вазоконстрикторные рецепторы 5-HT_2В в аорте и брыжеечной артерии крысы в норме функционально неактивны. Установлено, что в ГМК рецепторы 5-HT_2В сопряжены с двумя сигнальными системами – кальциевой и системой NADPH-зависимого образования активных форм кислорода. Стимуляция образования АФК увеличивает, а подавление уменьшает подъём цитоплазматической концентрации ионов кальция в ГМК, вызванный активацией 5-HT_2В рецепторов. Как следует из полученных результатов, модулирующее действие АФК на кальциевые сигналы от 5-HT_2В рецепторов в ГМК обусловлено ингибированием тирозиновой фосфатазы, что ведет к сдвигу

баланса тирозинового фосфорилирования в сторону накопления продуктов Src-киназной реакции. Показано, что в культивируемых эндотелиальных клетках пупочной вены человека в регуляцию кальциевого обмена, вызванного активацией 5-HT_2B рецепторов, также вовлечены NADPH-оксидаза (или NADPH-оксидазы). Установлено, что индукторы образования активных форм кислорода, подавляющие активность тирозиновых протеинфосфатаз, вызывают демаскировку вазоконстрикторного действия 5-HT_2В рецепторов в изолированной аорте и брыжеечной артерии крысы. Полученные данные позволяют лучше понять особенности функционирования 5-HT_2B рецепторов и дают представление о возможном механизме нарушений серотонинергической регуляции сосудистого тонуса при различных патологиях.

Предложенный в работе метод демаскировки вазоконстрикторного эффекта 5-HT_2B рецепторов позволяет исследовать влияние фармакологических препаратов на опосредованную этими рецепторами серотонинергическую регуляцию сосудистого тонуса. В перспективе это облегчит разработку новых подходов к фармакологической коррекции нарушений функции 5-HT_2В рецепторов при некоторых формах артериальной гипертензии и при диабете 2-го типа.

Данное исследование имеет как теоретическое, так и прикладное значение, поскольку выяснение механизмов передачи сигналов от 5-HT_2B рецепторов в клетках кровеносных сосудов позволяет получить новые сведения о серотонинергической регуляции сосудистого тонуса в норме и дает возможность лучше понять этиологию и патогенез заболеваний, связанных с нарушением работы этих рецепторов. Это открывает новые возможности для медицинских и фармакологических разработок в данной области.

Положения, выносимые на защиту.

1) В ГМК аорты крысы экспрессируются серотониновые 5-HT_2В
рецепторы, сопряженные с кальциевой сигнальной системой и системой
NADPH-зависимого образования активных форм кислорода (АФК); в
интактных сосудах 5-HT_2В рецепторы, локализованные в ГМК, функционально
неактивны.

2. Накопление АФК усиливает кальциевый сигнал при активации 5-HT_2В рецепторов в ГМК аорты крысы; образование АФК происходит при участии NADPH-оксидаз (оксидазы); аналогичный механизм потенцирования кальциевого сигнала от 5-HT_2B рецепторов существует в ЭК пупочной вены человека;

3. Усиление кальциевого сигнала от 5-HT_2В рецепторов в ГМК аорты крысы происходит в результате ингибирования тирозиновых(ой) протеинфосфатаз(зы) эндогенными АФК и сдвига баланса в Src-зависимом фосфорилировании;

4. Индукция образования эндогенных АФК в брыжеечной артерии и аорте крысы способствует демаскировке вазоконстрикторного эффекта 5-HT_2B рецепторов;

5) Блокатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) вортманнин устраняет сокращение брыжеечной артерии, происходящее при активации 5-HT_2B рецепторов, что свидетельствует о возможном вкладе PI3K в процесс демаскировки их вазоконстрикторного действия.

Апробация результатов. Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных конференциях, съездах и школах: конференция молодых ученых ИБР РАН (Москва, 8-9 декабря 2014 г., 8-10 декабря 2015 г.), международная конференция Ломоносов (Москва, 7-11 апреля 2014 г ., 13-17 апреля 2015 г ., 11-15 апреля 2016 г .), международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 25-28 мая 2015 г.), международная конференция «Проблемы развития высоких технологий и фундаментальных исследований» (Санкт-Петербург, 24-26 ноября 2015 г .), VI всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения (Москва, 2-5 февраля 2016 г .), FASEB Science Research Conference “Smooth Muscle” (Portugal, Lisbon, 17-22 июля 2016 г.), V съезд физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 4-8 октября 2016 г.), XVII конференция-школа с международным участием «Актуальные проблемы биологии развития» (Технопарк Генериум, 10-14 октября 2016 г.), XXIII съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (Воронеж, 18-22 сентября 2017 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК 3, из них статей в иностранных рецензируемых журналах 1, тезисов докладов и материалов конференций 11.

Работа поддержана следующими грантами:

РФФИ 14-04-00951 Роль двупоровых кальциевых каналов в активации сокращений сердца и в регуляции тонуса кровеносных сосудов, 2014-2016;

РФФИ 17-04-01267 Активация пероксидом водорода секреции фактора Виллебранда, 2017 – 2019;

РНФ 14-15-01004 Роль пероксида водорода в регуляции обмена ионов кальция в эндотелиальных клетках и в регуляции сократимости кровеносных сосудов, 2014-2016

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах, содержит 37 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Библиография включает 287 источников.

Механизм сокращения сосудов

Сокращение ГМК, как и других типов мускулатуры, зависит от изменения внутриклеточной концентрации ионов Ca2+. В ГМК сокращение под действием ионов кальция связано с их воздействием на толстые филаменты, в то время как в поперечнополосатой мускулатуре происходит воздействие на тонкие филаменты. Под действием стимула, в гладкомышечной клетке происходит увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+, который связывается с кальмодулином. Этот комплекс активирует фермент MLC киназа (Myosin Light Chain kinase – киназа легких цепей миозина), который фосфорилирует легкие цепи миозина, в результате чего происходит сокращение. Кальций может поступать в цитоплазму, как из внутриклеточных депо, так и из внеклеточного пространства (через лиганд-зависимые или потенциал-зависимые кальциевые каналы). Различные агонисты, связываясь с рецепторами, сопряженными с G-белком (ангиотензин II, некоторые серотониновые рецепторы и др.), активируют PLC. Этот фермент гидролизует диэфирную связь в молекуле мембранного липида фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата, в результате чего образуются два вторичных мессенджера: инозитол-1,4,5-трисфосфат (IP3) и диацилглицерин (DAG). IP3 связывается с рецептором на поверхности СР и происходит высвобождение кальция из внутриклеточного депо в цитоплазму. DAG, наравне с Ca2+, активирует фермент PKC (протеинкиназа С), который способствует сокращению сосудов , за счет фосфорилирования кальциевых каналов L-типа, а также воздействия на другие белки -регуляторы. Также [Ca2+]i может увеличиваться за счет открытия потенциал-зависимых кальциевых каналов мембраны, которые реагируют на растяжение гладкомышечной клетки.

Помимо изменения [Ca2+]i, состояние толстых цепей миозина регулируется фосфатазой лёгких цепей миозина (MLC фосфатаза), которая удаляет высокоэнергетическую фосфатную группу на легкой цепи миозина, обеспечивая расслабление гладких мышц. Этот фермент состоит из трех субъединиц: 37-кДа каталитическая субъединица, 20-кДА вариабельная субъединица и 110-130-кДА миозин-связывающая единица. Миозин-связывающая субъединица в фосфорилированном состоянии ингибирует ферментативную активность MLC фосфатазы, позволяя легким цепям миозина оставаться фосфорилированными, таким образом способствуя сокращению. Малый G-белок RhoA, а также активируемая им Rho-киназа, играют важную роль в регуляции активности MLC фосфатазы. Rho-киназа, серин/треонин-киназа, фосфорилирует миозин-связывающую субъединицу MLC фосфатазы, ингибируя ее и потенцируя сокращение. Также существуют и другие регуляторы MLC киназы и MLC фосфатазы [CAhiPtalSey RetE aFl.,R 2E00S1H; SEolRaroC, 2O00U0;R SSomE lyRo EetP aOl., R19T99; Somlyo and Somlyo, 1998; Webb, 2003].

Множество патологий сердечно-сосудистой системы связано с нарушением тонуса сосудов. Одним из широко распространенных заболеваний является артериальная гипертензия, которая представляет собой стойкое длительное повышение артериального давления.

Гипертензия - это мультифункциональное, полигенное заболевание, которое связано со сложными взаимодействиями между генетически детерминированными механизмами гомеостаза и факторами окружающей среды. Исследование этого заболевания требует наличия экспериментальных моделей животных. Идеальной моделью для исследования гипертензии могло бы стать животное, обладающее сходным с человеком строением сердечно-сосудистой системы с точки зрения анатомии, гемодинамики и физиологии, а также оно должно было бы иметь характеристики развития и протекания заболевания, сходные с таковыми у человека. Очевидно ни одна модель не может отвечать всем этим требованиям, а также дизайн эксперимента и другие ограничения часто диктуют выбор конкретных животных д ля прикладных исследований. Тем не менее использование модельных животных значительно помогает и зучать различные аспекты патогенеза заболевания и способствуют лучшему пониманию путей лечения. Все модели гипертензии можно условно разделить на генетические, к которым относят, например, специально выведенную линию крыс со спонтанной наследственной гипертензией (SHRs), и негенетические, к которым, например, относится ДОКА-солевая гипертензия. Далее мы более подробно рассмотрим модель ДОКА-солевой гипертензии и патологические изменения, которые наблюдаются у модельных животных [Lerman et al., 2005].

Влияние агониста рецепторов 5-НТ2В BW723C86 на кальциевый обмен в гладкомышечных клетках, выделенных из аорты крысы

Согласно нашей гипотезе, ингибирование тирозиновых фосфатаз (PTP) должно усиливать передачу сигнала от рецепторов 5-НТ2В за счет увеличения содержания в клетке продуктов тирозинового фосфорилирования. В качестве ингибитора PTP было выбрано вещество Na3VO4, поскольку оно увеличивает фосфорилирование белков по тирозиновым остаткам посредством ингибирования тирозинфосфатаз [Di Salvo et al., 1993; Srivastava and St-Louis, 1997], то есть происходит потенцирование эффектов киназ семейства Src [Yayama et al., 2014]. Действительно, оказалось, что преинкубация ГМК с ингибитором тирозиновых фосфатаз Na3VO4 в течение 3 минут значительно увеличивала внутриклеточную концентрацию кальция ([Ca2+]i) в ответ на агонист 5-НТ2В рецепторов BW723C86 по сравнению с контролем (Рисунок 14).

При постановке экспериментов было отмечено, что Na3VO4 не только усиливал реакцию ГМК на BW723C86, но и сам мог вызывать увеличение [Ca2+]i. В литературе такое действие ортованадата натрия описано на препарате ГМК, выделенных из семявыносящего протока крысы (vas deferens), причем этот эффект блокировал неселективный ингибитор тирозиновых протеинкиназ генистеин [Zhao et al., 2012].

Мы провели ряд опытов с различными концентрациями Na3V04 и выяснили, что кальциевый ответ на Na3V04 практически не изменялся в диапазоне концентраций от 100 до 500 мкМ, а также в этом диапазоне концентраций потенцирование кальциевого ответа 10 мкМ BW723C86 не зависит от концентрации Na3V04 (Рисунок 15) Для наших экспериментов была выбрана концентрация Na3V04 200 мкМ, поскольку на фоне нее клетки работали наиболее стабильно.

Для того, чтобы убедиться в специфичности эффектов BW723C86, был поставлен эксперимент, в котором клетки преинкубировали с антагонистом 5-НТ2в рецепторов RS127445 (10 минут), в то время как контрольные клетки инкубировали с буфером (PSS). Затем были последовательно добавлены Na3V04 (3 минуты) и BW723C86 (3 минуты). При этом в контрольных клетках наблюдалось увеличение [Са ]; в ответ на BW723C86 на фоне Na3V04, а в клетках с RS127445 наблюдалось подавление этого эффекта. Таким образом, мы показали, что эффекты BW723C86 специфичны и, действительно, обусловлены активацией 5-НТ2врецепторов (Рисунок 16).

Для подтверждения участия тирозиновых Src-киназ в кальциевом ответе на BW723C86 в присутствии Na3VC 4, был поставлен следующий опыт. В течение 10 минут экспериментальные ГМК инкубировали с ингибитором Src-киназ РР2, при этом контрольные клетки были проинкубированы с его неактивным аналогом РРЗ или с буфером PSS. Затем ко всем клеткам последовательно добавляли Na3V04(3 минуты) и агонист 5-НТ2в рецепторов BW723C86 (3 минуты). РР2 значительно подавлял подъем [Са ]; в ответ на Na3VC 4+BW723C86, в то время как его неактивный аналог РРЗ и PSS не влияли на прирост [Са ];. Опыты с ингибитором тирозиновых киназ генистеином (10 минут преинкубации, концентрация 100 мкМ) также показали ингибирование кальциевого ответа BW723C86 на фоне Na3V04 (Рисунок 17) Данные эксперименты свидетельствует о том, что Src-киназы действительно участвуют в регуляции кальциевой сигнализации 5-НТ2в рецепторов.

Чтобы оценить вклад 5-НТ2в рецепторов в кальциевый ответ ГМК на серотонин, была проведена серия экспериментов, в которых было показано, что серотонин в концентрации 0,1 мкМ вызывает значительно более мощный подъём [Са ]; в гладкомышечных клетках по сравнению с BW723C86. Ортованадат натрия увеличивает вызываемый серотонином подъём [Са ]; приблизительно на 20% (Рисунок 18). Мы показали, что кальциевый ответ на серотонин значительно подавляется RS127445 (более чем на 50%) (Рисунок 18). Это указывает на то, что рецепторы 5-НТ2в наряду с рецепторами 5-НТ2д опосредуют действие серотонина на ГМК.

Также мы изучили влияние Na3V04 на эффекты ангиотензина II и вазопрессина. Оба этих пептида активируют фосфолипазу С в гладкомышечных клетках и вызывают высвобождение Са из ретикулума через 1Р3-чувствительные каналы, что сходно с механизмом работы серотониновых рецепторов 2-го типа. По литературным данным, эффекты рецепторов ангиотензина II в ГМК частично связаны с работой с тирозиновых киназ Src [Touyz et al., 2001a; Marrero et al., 1996; Li et al., 2010; Qin and Zhou, 2015a]. Как показано на рисунке 19, ванадат вызывает небольшое увеличение кальциевого ответа на АТП. Однако он не влияет на подъем [Са ];, вызванный вазопрессином (AVP - arginine vasopressin) (Рисунок 20).

Ингибитор Src киназ РР2 (ЮмкМ) снижает кальциевые ответы ангиотензина II и вазопрессина, однако его неактивный структурный аналог РРЗ (ЮмкМ) вызывает аналогичный эффект, поэтому мы не имеем возможности судить о специфичности РР2 в данных опытах.

Был проведен ряд экспериментов, в которых исследовалось влияние BW723C86 на изменение [Са ]; в ГМК при преинкубации клеток с другим ингибитором РТР BVT948. Его механизм действия сходен с таковым у Na3VC 4, при попадании в клетку BVT948 вызывает образование активных форм кислорода, за счет чего происходит ингибирование РТР. По результатам экспериментов, преинкубация ГМК с различными концентрациями BVT948 (0,1/1/10/100 мкМ) не оказывала влияния на кальциевый ответ 10 мкМ BW723C86 (инкубация с BVT948 и BW723C86 составляла по 5 минут).

Также нами были проведены опыты, в которых мы исследовали влияние ингибитора фосфоинозитид-3-киназ (PI3Ks) вортманнина на кальциевый ответ Na3V04+BW723C86. Было показано, что преинкубация с вортманнином в течение 5 минут не приводила достоверному ингибированию кальциевого ответа Na3V04+BW723C86 (Рисунок 22).

Эксперименты на изолированных сосудах крысы

Учитывая данные о потенцировании кальциевого ответа BW723C86 в ГМК с помощью Na3V04, мы решили проверить, будет ли преинкубация с Na3V04 способствовать демаскировке вазоконстрикторного эффекта BW723C86 на изолированных сосудах крысы. Для этих целей в качестве экспериментальных систем были выбраны изолированные аорта и брыжеечная артерия крысы.

Кольца аорты крысы преинкубировали с Na3VC 4 в концентрации 1 мМ в течении 3 минут, при этом наблюдалась вазоконстрикция. Затем к экспериментальным кольцам добавляли агонист 5-НТ2в рецепторов BW723C86 до конечной концентрации 3 мкМ, а к контрольным просто раствор Кребса-Хенселейта без BW723C86, и наблюдали состояние колец аорты в течение 25 минут. При этом контрольные кольца сосуда значительно расслаблялись, в то время как в экспериментальных кольцах вазоконстрикция стабилизировалась и сокращение сохранялось в течение всего эксперимента (Рисунок 33).

Кривые на графике демонстрируют силу сокращение колец аорты (черной стрелкой отмечена добавка Na3V04, белой стрелкой отмечена добавка BW723C86). Среднее значение силы сокращения в момент добавки BW723C86 или буферного раствора в контроле составляло 0.88 ± 0.094 грамм и взято за 100%. На гистограмме представлено сравнение силы сокращения колец аорты через 25 минут после добавки BW723C86. Концентрации Na3V04 и BW723C86 составляли 1мМ и 3 мкМ соответственно. п = 6, р 0,01

Аналогичный опыт был поставлен на изолированной брыжеечной артерии. Кольца сосуда преинкубировали с 500 мкМ Na3V04miH 0,1 мкМ BVT948, затем к экспериментальными кольцам сосуда добавляли BW723C86 в концентрации 1мкМ, а к контрольным - рабочий буфер. При этом в ответ на Na3V04/BVT948 брыжеечная артерия не сокращалась, а при добавке BW723C86 к экспериментальным кольцам, наблюдалось их вазоконстрикция, в то время как контрольные кольца оставались расслабленным. При этом показано, что сам по себе BW723C86 не вызывает вазоконстрикцию в брыжеечной артерии (Рисунок 34) [Mironova et al., 2017].

На рисунке представлены репрезентативные кривые сокращения колец брыжеечной артерии. Стрелками отмечено время добавки буферного раствора, BVT948, Na3VC 4, BW723C86. Средние значения сокращения колец аорты в ответ на BW723C86 в присутствии Na3VC 4 или BVT948 составляли 0.65 ± 0.078 и 0.46 ± 0.044 грамм соответственно.

Также нами были проведены опыты по ингибированию ответа Na3VO4+BW723C86 и BVT948+BW723C86 с помощью ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3Ks) вортманнина. Было показано, что преинкубация с вортманнином в течение 5 минут приводила к полному ингибированию ответа Na3VO4+BW723C86 (Рисунок 35).

Концентрации вортманнина, Na3V04H BW723C86 составляли 1, 500 и 1 мкМ соответственно. Данные представлены в виде репрезентативных кривых.

Влияние АФК на регуляцию обмена кальция в ГМК при активации 5-HT2B рецепторов; роль тирозинового фосфорилирования

В нашей работе впервые показано, что активация 5-НТ2В рецепторов вызывает увеличение [Ca2+]i в культивируемых ГМК аорты крысы. Ранее такое физиологическое действие этих рецепторов было продемонстрировано только на культивируемых гладкомышечных клетках мочевого пузыря [Kelly and Sharif, 2006]. Нашей задачей было выяснить, какова связь между опосредованной 5-НТ2В рецепторами активацией кальциевого обмена и вазоконстрикцией.

Известно, что увеличение внутриклеточной концентрации кальция [Ca2+]i является ключевым фактором сокращения сосудов. Согласно данным по экспрессии серотониновых рецепторов в ГМК аорты крысы, 5-HT2B представлены в достаточном количестве, однако по результатам экспериментов, их активация агонистом BW723C86 вызывает относительно небольшое увеличения [Ca2+]i в ГМК аорты крысы. Эффекты ангиотензина II и вазопрессина на кальциевый обмен в ГМК многократно сильнее. Серотонин, активирующий все виды рецепторов включая 5-НТ2А, также вызывает достаточно мощный подъём [Ca2+]i.

Слабое увеличение кальциевого сигнала в ответ на активацию ГМК агонистом 5 НТ2В рецепторов, по-видимому, является причиной отсутствия вазоконстрикторного действия этих рецепторов в норме. Поэтому было необходимо выявить факторы, которые смогут усиливать их функциональную активность и тем самым демаскировать вазоконстрикторное действие.

Мы предположили, что патологические изменения в ГМК клеток сосудов могут влиять на эффективность сигнального пути 5-HT2B рецепторов и потенцировать увеличение [Ca2+]i при их активации, и, следовательно, способствовать демаскировке их сократительного эффекта. Одним из основных повреждающих факторов сосудов при гипертензии, в том числе в модели ДОКА-солевой гипертензии, является оксидативный стресс [Iyer et al., 2010]. АФК, внутриклеточная концентрация ко торых при этом повышена, ингибируют тирозиновые фосфатазы [Chiarugi and Cirri, 2003; Natarajan et al., 1998]. Тирозиновое фосфорилирование белков в клетке разнонаправленно регулируется тирозиновыми киназами и фосфатазами и таким образом при ингибировании фосфатаз, происходит накопление продуктов тирозинового фосфорилирования. Поскольку некоторые тирозиновые киназы, включая Src, сами по себе активируются фосфорилированием, ингибирование PTP может также напрямую увеличивать их активность [Hubbard and Till, 2000]. При этом известно, что тирозиновые Src-киназы играют значительную роль в реализации сокращения ГМК под действием серотонина [Lu et al., 2008] и ангиотензина II [Ishida et al., 1995; Qin and Zhou, 2015b], а также влияют на работу NADPH-оксидаз, что показано в экспериментах с ангиотензином II, где ингибитор Src-киназ PP2 подавлял вызванную добавкой ангитензина генерацию АФК в ГМК сосудов человека [Nguyen Dinh Cat et al., 2013]. Согласно нашей гипотезе, ингибирование PTP увеличивает эффективность кальциевого сигналинга 5-HT2B рецепторов, сдвигая баланс тирозинового фосфорилирования, за счет потенцированию работы тирозиновых Src-киназ. Нами была выбрана схема эксперимента, при которой мы подавляли активность тирозиновых фосфатаз с помощью Na3VO4, который ингибирует PTP за счет увеличения внутриклеточной концентрации АФК (в качестве контроля использовали вещество BVT948, которое обладает с ходным механизмом действия). Выбор ингибитора был обоснован тем, что по литературным данным ортованадат натрия и его производные образующиеся в клетке увеличивают содержание фосфотирозинов и активность тирозиновых киназ Ick и Fyn в человеческих T-клетках [Evans et al., 1994; Secrist et al., 1993], тирозиновых Src-киназ в клетках крысиного миометрия [Boulven et al., 2002] и гладкой мускулатуре сосудов крысы [Yayama et al., 2014].

По результатам экспериментов с Na3VO4 наблюдалось достоверное увеличение [Ca2+]i в клетках, которые были преинкубированы с ортованадатом натрия, в ответ на агонист серотониновых 2B рецепторов BW723C86 по сравнению с контролем. Достоверность полученных результатов была подтверждена опытам с селективным ингибитором серотониновых 2В рецепторов RS127445, который полностью подавлял данный эффект.

Также, было выявлено, что ортованадат потенцирует кальциевые ответы серотонина в ГМК, a RS127445 частично ингибирует изменение [Са ]; в ответ на серотонин. Это свидетельствует о вкладе 5-НТ2в рецепторов в кальциевый ответ на серотонин.

Следующим этапом работы было подтвердить нашу гипотезу об участии тирозиновых Src-киназ в сигнальном пути серотониновых рецепторов с помощью ингибиторного анализа. В опытах с ингибитором тирозиновых киназ генистеином и тирозиновых Src-киназ РР2 было показано значительное снижение кальциевого ответа Na3V04+BW723C86 по сравнению с контролем, когда был добавлен РРЗ.

Также нами был проведен ряд дополнительных опытов с ортованадатом натрия и ангиотензином П/вазопрессином. Известно, что в сигнальном пути рецепторов ангиотензина II и вазопрессина в сосудах участвуют Src-киназы [Ghosh et al, 2001; Ishida et al, 1995; Kozhevnikova et al, 2014; Touyz et al., 2001b; Touyz et al., 2002b]. С помощью преинкубации с ортованадатом натрия удалось в некоторой степени потенцировать кальциевый ответ ангиотензина II, однако не вазопрессина. Вероятно оба эти агониста вызывают достаточно мощный подъем [Са ];, в связи с чем потенцирование тирозинового фосфорилирование не дает значимого эффекта. Таким образом, нам удалось показать потенцирование подъема [Ca2+]i в ответ на ангиотензин II в присутствии Na3VO4, что говорит о состоятельности нашей экспериментальной схемы.

Стоит также отметить, что ортованадат натрия сам по себе вызывал незначительное увеличение внутриклеточной концентрации кальция, что согласуется с литературными данными [Sunano et al., 1987; Sunano, 1988]. Это связано с подавлением активности кальциевых насосов при высоких концентрациях ортованадата. Чтобы проверить, имеет ли место такой эффект в наших экспериментах, были поставлены опыты с возрастающими концентрациями Na3VO4. Как оказалось, при повышении концентрации ортованада от 100 до 500 мМ не наблюдалось увеличения прироста [Ca2+]i, что свидетельствует об отсутствии эффекта ингибирования кальциевых АТФаз.

Согласно нашей гипотезе, ортованадат натрия влияет на кальциевый обмен в ГМК, имитируя оксидативный стресс, то есть провоцируя увеличение внутриклеточной концентрации АФК. Мы показали, что Na3VO4-потенцированое увеличение [Ca2+]i в ответ на агонист 5-HT2B BW723C86 значительно ингибируется антиоксидантом N-ацетил цистеином. Это согласуется с данными о том, что в результате оксидативного стресса происходит окисление SH-групп тирозиновых фосфатаз, которые находятся в каталитическом центре; Na3VO4, проникая вну трь клетки, превращается в пероксиванадат и ингибирует тирозиновые фосфатазы по такому же механизму [Huyer et al., 1997b]. Увеличение внутриклеточной концентрации АФК также подтверждается нашими данными наших экспериментов на ГМК, окрашенных флуоресцентным зондом H2DCF-DA, который детектирует внутриклеточные АФК. Было показано, что преинкубация ГМК с Na3VO4 ведет к образованию АФК в клетке, что согласуется с литературными данными [Cuesta et al., 2011]. Активация 5-HT2B рецепторов с помощью BW723C86 на фоне ортованадата натрия в ГМК вызывает дополнительный прирост флуоресценции зонда, что говорит о дополнительном образовании внутриклеточных АФК. Нас интересовал вопрос, каков механизм образования АФК. По литературным данным, источником активных форм кислорода в сигнальном пути 5-HT2B рецепторов в нервной ткани могут служить NADPH-оксидазы [MacFarlane et al., 2014]. В связи с этим был поставлен эксперимент с ингибитором NADPH-оксидаз VAS2870. Преинкубация с ним значительно снижала как увеличение [Ca2+]i, так и скорость образования АФК в ГМК при постановке опытов с Na3VO4+BW723C86. В гладкомышечных клетках сосудов экспрессируются такие изоформы NADPH-оксидаз, как NOX1 и NOX4 [Selemidis et al., 2008]. NOX1 катализируют образование внутриклеточного супероксид аниона, который в последствии превращается в H2O2, NOX4 может катализировать образование H2O2 напрямую [Dikalov et al., 2008]. Опыты с темполом, который взаимодействует с супероксид анионом, устраняя его из сигнального пути [Offer et al., 1998], показали, что увеличение [Ca2+]i при активации 5-HT2B рецепторов не зависит от супероксид аниона. Таким образом данный вид АФК сам непосредственно не потенцирует BW723C86 индуцированное увеличение [Ca2+]i, но может быть промежуточным звеном, в качестве источника образования H2O2. Образование H2O2 в ГМК в ответ на серотонин было показано ранее с использованием специфического флуоресцентного зонда HyPer [Chang et al., 2013]. Наши данные дают возможность предполагать, что 5-HT2B рецепторы вовлечены в реализации этого эффекта серотонина.

Был проведен ряд экспериментов с веществом BVT948, которое также является ингибитором тирозиновых фосфатаз и действует по сходному с Na3VO4 механизму, то есть способствует увеличению внутриклеточной концентрации АФК. По результатам экспериментов, BVT948 не ока зывал эффекта на кальциевые ответы агониста 2B рецепторов. Однако, он потенцировал образование АФК в ответ на BW723C86 в ГМК, причем этот эффект блокировался ингибитором NADPH-оксидаз VAS2870, что совпадает с данными, полученными при использовании Na3VO4.

Приведенные выше результаты говорят о том, что ингибиторы PTP Na3VO4 и BVT948 индуциру ют как образование активных форм кислорода, так и увеличение [Ca2+]i при активации серотониновых 2B рецепторов, причем оба эти процесса связаны, так как ингибирование образования АФК блокирует увеличение [Ca2+]i в ответ на BW723C86. Было выявлено, что образование АФК в данном случае происходит при участи и NADPH-оксидаз. Таким образом, тирозиновые Src-киназы и NADPH-оксидазы являются важными компонентами сигнального пути серотониновых 2B рецепторов и, вероятно, именно изменение их функционирования при патологических условиях способствует демаскировке вазоконстрикции в ответ на BW723C86.