Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ Проблема молекулярпо-генетических механизмов обучения и памяти одна из важнейших в современной нейробиологни. Многообразие интегративных процессов, участвующих в обучении, значительно усложняют исследования, проводимые в этой области. Экспериментальных работ, показывающих вовлечение конкретных генов в процесс обучения, сравнительно немного. Широкий круг исследований как на моллюсках и дрозофиле, так и на позвоночных развернулся вокруг, так называемых, «немедленных ранних генов», играющих значительную роль в запуске дифференцировки и пролиферации. В ряде работ показано усиление экспрессии «ранних генов» при обучении (Анохин, 1997; Kaang et al., 1993; Alberini et al., 1994; Kaczmarek, Chandhuri, 1997), а также необходимость их экспрессии для формирования долговременных следов памяти (Demmcr et al., 1993; Bourtchuladze et al., 1994; Yin et al., 1994).
Экспрессия "ранних генов" находится под контролем предсуществующих белковых транскрипционных факторов, активируемых экстраклеточными сигналами через системы различных протеинкиназ (Frank, Grenbcrg, 1994). Белковые же продукты "ранних генов" сами образуют транскрипционные факторы, способные регулировать экспрессию эффекторных генов, непосредственно определяющих механизмы пластичности (Curran, 1988; Armstrong, Montmini, 1993). Процессы регуляции экспрессии функционально важных генов пластичности достаточно сложны и многокаскадны, часто включают в себя взаимодействие нескольких внутриклеточных сигнальных путей. Вторичные мессенджеры, опосредующие действия экстраклеточных сигналов через системы соответствующих протеинкиназ, могут оказывать значительное влияние на экспрессию транскрипционных факторов и их ДНК-связывающие и активирующие свойства (Karin, Smeal, 1992; Armstrong, Montminy, 1993; Mellstrom et al., 1993; Kormhauser, Greenberg, 1997). Таким образом, транскрипционные факторы способны интегрировать информацию, приходящую от мембраны к ядру и, соответственно, запускать экспрессию функционально важных генов, поэтому их часто относят к третичным мессенджерам.
Известно, что экспраклеточные стимулы, активируя соответствующие системы вторичных посредников, могут регулировать экспрессию генов - мишеней в ядре (Armstrong, Montminy, J993; Bacskai et al., 1993; Karin, Hunter, 1995; Kaczmarek, Chandhuri, 1997; Самойлов, 1999). Усиление сигнала может быть достигнуто акіивациеи альтернативных сигнальных систем через фосфорилирование транскрипционных факторов, взаимодействующих с иными регуляторними сайтами.
В настоящее время разворачивается широкий фронт работ в данной области. Однако многокомпанентность регуляториой системы экспрессии генов значительно усложняет проведение исследований. Многие аспекты работы "ранних генов" еще не выяснены. Это касается как функциональных последствий их активации (регуляции активности "поздних генов"), так и механизмов рсіуляции их собственной экспрессии. Неясно, в частности, на каком этапе происходит конвергенция условных и безусловных стимулов. Она может осуществляться как в примембранной области, на уровне систем вторичных посредников, так и в ядре, на уровне регуляции экспрессии генов, благодаря множественности сайтов регуляции и интегрирующим возможностям транскрипционных факторов, активирующие свойства которых могут контролироваться несколькими протеинки-назами. Основные сведения в этой области получены в экспериментах на клеточных культурах ив немногочисленных исследованиях, выполненных in vivo. Таким образом, изучение механизмов рефляции экспрессии генов, активирующихся при обучении, направлено на решение актуальных задач современной нейробиологии.
Одним из наиболее удобных объектов для изучения молекулярных механизмов обучения и памяти являются моллюски. Способность этих животных к формированию условных рефлексов, наличие гигантских функционально значимых нейронов, возможность их идентификации, жизнестойкость ЦНС в условиях in vitro позволяет изучать на этом объекте нейрональные сети, определяющие формирование условных рефлексов, а также имитировать простые формы обучения. Благодаря изучению нейронных механизмов пластичности у Aplysia, Hermisscnda, Helix получены основные сведения, касающиеся молекулярно- клеточных и генетических механизмов обучения и памяти (Соколов, 1981; Балабан, Захаров, 1992; Никитин, Судаков, 1997; Montarolo, et al., 1986; Greenberg et al., 1987;
Nelson, Лікоп., 1988; Abrams et al., 1991; Bacskai et al, 1993; Alberini clal., 1994).
В качестве объекта исследования нами выбран моллюск -виноградная улитка (Helix). Благодаря работам Коштоянца Х.С., Соколова Е.Н., Сахарова Д.А., Косткжа П.Г н созданным им научным школам, виноградная улитка стала излюбленным объектом отечественных "клеточных" физиологов. У этих животных описано несколько видов условных оборонительных рефлексов. Идентифицированы сенсорные, командные, модуляторные и моторные нейроны, включенные в формирование данных рефлексов. Описаны пластические перестройки нейрональных сетей при обучении (Соколов, 1981; Максимова, Балабан, 1983; Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др., 1992). Однако молекулярные процессы, происходящие в ЦНС Helix при обучении, остаются еще мало изученными. Особенно это касается механизмов транедукции экстраклеточных сигналов от мембраны к ядру и молекулярных субстратов, определяющих конвергенцию условных и безусловных стимулов.
В связи с этим представлялось необходимым проведение поэтапного комплексного исследования, включающего изучение участия различных белков нервных клеток в формировании долговременных форм пластичности, а также внутриклеточных механизмов сигнальной транедукшш, обеспечивающих регуляцию экспрессии генов, вовлекаемых в процессы обучения.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярно-генетических механизмов формирования ассоциативных и неассоциативных форм обучения виноградной улитки. Основные задачи исследования:
-
Провести анализ характера вовлечения белков ЦНС и командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки в формирование условных оборонительных рефлексов.
-
Сравнить вклад ключевых внутриклеточных регуляторных систем в формирование долговременных форм пластичности виноградной улитки на клеточном уровне.
-
Изучить вклад цАМФ- регулируемых транскрипционных факторов CRE, С/ЕВР и АР-1 -семейств в формирование ассоциативных и неассоциативных форм обучения у Helix.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые методами макро- и микроэлектрофореза, проведены комплексные исследования белковых спектров клеток ЦНС и отдельных идентифицированных нейронов виноградной улитки и показано участие кислых мозгоспецифиче-ских белков в формировании условных.оборонительных рефлексов у этих животных. Наиболее длительные изменения содержания кислых нейроспецифических белков зарегистрированы в командных нейронах оборонительного поведения ЛПаЗ, вовлеченых в выработку данного рефлекса. Установлено, что формирование условного оборонительного рефлекса пищевого избегания сопровождается активацией G-белков и цАМФ- зависимых протеинкиназ (ПКА).
Впервые проведено определение ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов семейств CRE, С/ЕВР и API, играющих значительную роль в онтогенезе, пролиферации и формировании долговременных следов памяти. Показано наличие этих факторов в ЦНС Helix и их значительная активация при обучении и моделировании обучения в условиях интактной ЦНС. Установлено, что цАМФ-нндуцируемая активация транскрипционных факторов С/ЕВР и АР-1 в ЦНС Helix потенциируется кальциевой регуляторнои системой, что может лежать в основе механизмов конвергенции условных и безусловных стимулов при обучении Helix. Показано, что в этом процессе принимают участие митогенактивируемые и Са/кальмодулин- зависимые протеишеина-зы.
Установлен ранее неизвестный факт наличия в клетках ЦНС Helix транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов через SRE-элемент (serum response element), играющих важную роль в интеграции митогенактивируемых и Са/фосфолипид (ПКС)-завнсимых регуляторпых каскадов.
В онтогенетических исследованиях по изучению ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов в ЦНС виноградной улитки впервые обнаружена корреляция задержки развития механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов Helix с незрелостью постсинаптических механизмов передачи экстраклеточного сигнала серотонина, а также с нарушением формирования транскрипционных факторов семейства АР-1, играющих значительную роль в регуляции экспрессии «поздних генов» нейроналыюй пластичности.
Выдвинута гипотеза о том, что нарушение формирования транскрипционных факторов АР-1, регулирующих экспрессию генов, кодирующих белки пластичности, может быть причиной неспособности ювенильных животных к формированию долговременных форм условных оборонительных рефлексов.
НАУЧНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Теоретическое значение полученных результатов состоит в углублении и расширении представлений о молекулярно-клеточных основах пластических перестроек в нервной системе, происходящих при формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения, и о роли генома в регуляции данных процессов.
Знания об онтогенетических аспектах формирования механизмов обучения и значении транскрипционных факторов С/ЕВР, АР-1, и SRE семейств в механизмах пластичности могут быть использованы для разработки способов генной терапии врожденных нарушений деятельности ЦІ 1С и повышения адаптивных возможностей мозга.
Развиваемые в работе теоретические представления о роли транскрипционных факторов в механизмах конвергенции стимулов различной модальности, вовлекаемых в обучение, могут найти практическую реализацию в учебных процессах медицинских и биологических высших учебных заведений.
Сконструированная автором геномная библиотека виноградной улитки может быть использована для секвенирования как транскрибируемых, так и регуляторных участков генов, что особенно важно для расширения работ, связанных с изучением роли транскрипционных факторов в механизмах обучения и памяти.
Предложенный комплексный методический подход может быть применен в различных областях научных исследований, связанных с изучением регуляции экспрессии генов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы работы неоднократно докладывались на всесоюзных и международных симпозиумах, конференциях, съездах физиологического общества:
XIII съезд Всесоюзн. физиол. общ. им. И.П. Павлова (Алма-Ата, 1980), I Всесоюзн. биофизический съезд (Москва, 1982), IX Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы (Ереван, 1983), Всесоюзный симпозиум "Нейрохимические механизмы регуляции памяти" (Пущино, 1984), Всесоюзные конференция по нейро-
машинописного текста, содержит Л"і рисунков и Ц таблиц. Список литературы включает jW источников.
Эксперименты выполнены на виноградных улитках Helix pomatia и Helix lucorum. Ювенильные улитки выращены в лабораторных условиях. В опытах исследовано свыше 1200 животных. Использованы поведенческие, биохимические, микрохимические, молекулярно-генетические и генно-инженерные методы исследований.
Поведенческие методы.
В качестве моделей обучения использовали выработку условных оборонительных рефлексов у виноградной улитки (Максимова, Балабан, 1983). 1.) Условный рефлекс пищевой аверзии (условный стимул - морковь, безусловный стимул-электрошоковое воздействие электрическим током 10 мА, 0,5 с), интервал между сочетаниями 10-15 минут. Критерием выработки рефлекса являлся отказ от пищи или оборонительбная реакция на ее предъявление. Для формирования стойкого рефлекса обычно требуется около 10 сочетанных стимулов. 2.) Условный оборонительный рефлекс закрытия дыхательного отверстия (условный стимул - постукивание по раковине, безусловный стимул - дувок воздуха в дыхательное отверстие), интервал между сочетаниями 3-5 минут (улитки получали 15 пар стимулов в день). Рефлекс вырабатывается после получения улитками 150-180 сочетанных стимулов. Постукивание и вдувание воздуха дозировалось и подавалось автоматически.
Биохимические методы.
Для изучения белковых спектров ЦНС Helix применяли метод диск-электрофореза в 7,5-9,5% полиакриламидном геле (система Орнстейна-Дэвиса) и метод изоэлектрофокусирования в ультратонких слоях нолиакриламидных гелей. Для анализа белковых фракций отдельных идентифицированных нейронов использовали эту же электрофоретическую систему, адаптированную к микрохимическим исследованиям. Электрофорез вели в 7,5% ПАА -геле в капиллярах диаметром 300 мкм ( объем 4,5
мкл). Сканирование проводили на 2-х волновом микроспектрофотометре (НИОХ СО РАН).
Активность протеинкиназ определяли по переносу (32)Р с [ гамма <32)Р] АТФ на гистон НІ по методу Корбина и Реймана (Corbin, Reimann, 1971). Ингибитор ПКА выделяли по методу Гнлмапа (Gilman, 1970). Содержание белка в пробах определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976)
Молекулярно-генетические методы.
Для анализа экспрессии «ранних генов» применяли метод блот-
гибридизациоиного анализа, для которого суммарную РНК из ЦНС
или отдельных нейронов выделяли фенол-хлороформным или
гуанадин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом. РНК
подвергали электрофорезу в 1,2% формальдегид-агарозном геле. Перенос РНК на нейлоновые фильтры (Hybond-N, Amersham) и блот-гибридизацию проводили по (Lentola et al, 1991). В качестве гибридизационного зонда использовали Pstl-PstI фрагмент v-fos (ЮООЬр), меченный [альфа- (32)Р] dNTP. Специфическая радиоактивность пробы 5х108 сргп/мкг.
Для изучения активности транскрипционных факторов
применялся метод задержки в геле - «gel shift assay». Метод основан
на том, что при взаимодействии белковых транскрипционных
факторов с радиоактивно меченными ДНК-зондами, содержащими
последовательности нуклеотидов, связывающих данный фактор,
подвижность комплекса в электрофорезе уменьшается по
сравнению с подвижностью зонда, а интенсивность полосы
пропорциональна количеству активных транскрипционных
факторов. В качестве зондов использовали олигонуклеотиды,
соответствующие обеим цепям известных сайтов связывания API
гена коллагеназы (Collagenase - TRE:
AGCTTGATGAGTCAGCCGGATC), CRE-гена соматостагина (
SOM-CRE: CAgTGTCTCT GACGTCAGCCAAGGAGAGAG,
ACTGC, AGTCG, CTTCC, TTGAC), С/ЕВР-связывагащую
последовательность Aplysia -(BS2 C/EBP):
gatccggcACTATTGGGCAATCtcaagcta, С/ЕВРр-связывающая
последовательность c-fos промотора (ERE):
gatcCATATTAAGGACATGCCG, SRE последовательность c-fos MbiuiHxagt ACAGGATG'fCC ATATTAGGACATCTGCGT семейств
транскрипционных факторов, которые были синтезированы Кобзевым В.Ф. на автоматическом синтезаторе САМ-102 И ( Биоссет, Новосибирск). После отжига пуклсотиды мстили с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы І в присутствии {32-Р} АТР.
Реакционная смесь содержала 10 мкл буфера для экстракции, 3 пГ меченного олигонуклеотнда; 20 мкг белка экстракта, преинкубировашюго с 2 мкг ДНК тимуса теленка в течение 10 мин. при 0С. После инкубации при 20 С в течение 10 мин. смесь подвергали электрофорезу в 5% ПАЛ геле. После чего гель фиксировали, сушили и закладывали в кассету с рентгеновской пленкой сроком на 7 дней для получения автографа.
Генно-инжененерные методы.
Для создания геномной библиотеки виноградной улитки в векторе EMBL-ЗЛ ДНК выделяли методом, рекомендованным в работах (Prushard, Cuttler, 1976; Blin, Stafford, 1976). Молекулярное клонирование осуществляли согласно Маниатису (Маниатис и др., 1984).
Данные экспериментов обрабатывались статистически. Вероятности сравнивали с помощью t критерия Стюдента, точного метода Фишера, углового фи-преобразования или критерия хи-квадрат (Урбах, 1975).