Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности молекулярного состава межклеточного матрикса костной ткани и роль его отдельных компонентов в регуляции репаративной регенерации 15
1.1. Особенности минерального и органического состава костной ткани у разных видов животных и человека 15
1.2. Роль биополимерных факторов в коррекции состава внеклеточного матрикса костной ткани 23
1.3. Возможности использования ксенокомпонентов костного матрикса в качестве остеопластических материалов 32
2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Материалы и структура исследования 37
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Методы исследования внеклеточного матрикса костной ткани 41
2.2.2. Методы исследования сыворотки крови 44
2.2.3. Рентгеновские методы исследования 45
2.2.4. Рентгенфазовый анализ 45
2.2.5. Гистологические методы исследования 46
2.2.6. Статистические методы исследования 47
2.3. Препаративные схемы исследования биополимерных фракций костного матрикса и приемы их получения 47
ГЛАВА 3. Состав внеклеточного костного матрикса некоторых видов животных и человека в норме и при различных адапривно-приспособительных реакциях 50
3.1. Состава внеклеточного матрикса костной ткани у различных видов животных и человека в норме 50
3. 2. Возрастные изменения состава внеклеточного матрикса костной ткани некоторых видов животных и человека 59
3.3. Хроматографическое исследование идентичности фракций биополимерных веществ костного матрикса человека и различных видов животных 74
3.4. Изменения состава костного матрикса у лабораторных животных и человека в условиях адаптации 79
3.4.1. Изменения состава костного матрикса у некоторых видов животных и человека при антиортостатической гипокинезии (остеопорозе) 79
3.4.2. Изменения состава костного матрикса у лабораторных животных при регенерации костной ткани 89
ГЛАВА 4. Роль ксеноматериалов внеклеточного матрикса костной ткани при адаптации кости 98
4.1. Влияние биополимерных ксенокомпонентов матрикса костной ткани на течение экспериментального остеопороза
4.2. Биополимерные ксеноматериалы внеклеточного матрикса при нарушении опорной функции кости 118
4.2.1. Оценка влияния способа введения биополимерных ксенокомпонентов на нарушение опорной функции кости 118
4.2.2. Влияние биополимерных ксеноматериалов на заживление перелома голени у крыс при локальном введении 143
4.3. Биополимерные и минеральные ксенокомпоненты матрикса костной ткани в качестве ксеноматериалов регенерации костной ткани 151
4.4. Дифрактометрическое исследование идентичности минерального состава костной ткани, костного минерала и зоны регенерации 178
4.5. Минерализованный костный матрикс как ксеноматериал для замещения дефекта кости 188
Заключение 210
Выводы 220
Практические рекомендации 222
Список сокращений 223
Список литературы 224
- Роль биополимерных факторов в коррекции состава внеклеточного матрикса костной ткани
- Методы исследования сыворотки крови
- Возрастные изменения состава внеклеточного матрикса костной ткани некоторых видов животных и человека
- Оценка влияния способа введения биополимерных ксенокомпонентов на нарушение опорной функции кости
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности.
Травмы и другие повреждения опорно-двигательной системы (ОДС), часто
приводят к стойкой нетрудоспособности и фатальному исходу. По частоте
встречаемости они уступают место только сердечно-сосудистой патологии и
онкологическим заболеваниям (Бюллетень ВОЗ №310, 2014). Особенно
актуальна проблема заболеваний ОДС у лиц молодого трудоспособного
возраста (Миронов С.П. и соавт., 2009). Кроме того, по данным Российской
статистики заболеваниями ОДС, такими, как заболевания позвоночника,
крупных суставов, страдают до 80% населения страны (Исмагилов М.Ф. и соавт., 2010).
В связи с ростом числа патологии опорно-двигательной системы возрастает и количество реконструктивных операций, требующих замещения костной ткани (Кирилова И.А., 2011). Как правило, при реконструктивных оперативных вмешательствах используются имплантационные материалы, восполняющие дефект кости. (Миш К.Е., 2010; Тихонов В.Н., 2011; Огородова Л.М., 2013; Шумилова А.А., 2014; Schlickewei W. et al., 2007). По данным Л.М. Огородовой (2013) инвестиции в разработку костных имплантов за последние годы значительно увеличились и имеют тенденцию к росту. Поэтому разработка и внедрение в клиническую практику новых недорогих имплантационных материалов имеет и экономическое значение.
Независимо от природы происхождения костных имплантов они должны
отвечать определенным требованиям, в частности, биологической
совместимостью с тканями реципиента, отсутствием аутоиммунной реакции, обладать биоиндуктивными и биокондуктивными свойствами. Предлагаемые практикующему хирургу имплантационные материалы искусственного или природного происхождения не всегда эффективны (Берченко Г.Н., 2006; Тер-Асатуров Г.П., 2012). Альтернативным решением проблем возмещения потребности в имплантационных материалах могли бы стать ксенокомпоненты внеклеточного матрикса животных. Однако использование ксеноматериалов весьма ограничено. Это связано с тем, что на сегодняшний день комплексные исследования межвидовых отличий молекулярного состава костной ткани единичны и направлены, как правило, на решение сугубо прикладных задач. Тем не менее, фундаментальные представления об изменениях, протекающих в костной ткани у различных видов животных с возрастом, при различной патологии, регенерации, позволят расширить и спектр практического применения ксеноматериалов.
Актуальность исследований метаболизма костной ткани определяется ещё и тем, что его нарушения в силу невысокого обменного потенциала имеют латентный характер, и последствия в виде переломов костей, а это приводит к длительному лечению и реабилитации, которые зачастую не приводят к желаемому функциональному результату (Корж Н. А., 2006; Риггз, Б.Л., 2000).
Одним из важных направлений в остеологии является изучение роли микроэлементов, входящих в состав внеклеточного костного матрикса
(Новиков М.И., Накоскин А.Н., 2006, 2008). Более того, многие исследователи
видят причины целого ряда заболеваний скелета не собственно в костной
патологии, а в дисбалансе микроэлементов в организме в целом (Авцин А.П.,
1996). Факт накопления отдельных микроэлементов во внеклеточном костном
матриксе с возрастом также имеет немаловажное значение, так как замена
этими микроэлементами ионов кальция в кристаллической решётке
оксиапатита ведёт к утрате механической прочности кости, её ломкости и
хрупкости (Жолнин А.В., 2006). Поэтому изучение обмена микроэлементов в
костной системе в геронтологическом аспекте имеет большое значение для
понимания сущности происходящих метаболических процессов. Между тем
литература по данному вопросу посвящена главным образом количественным
характеристикам микроэлементов в костной ткани человека и
экспериментальных животных на стадии эмбрионального и раннего постэмбрионального периода и в очень малой степени освещает вопросы обмена микроэлементов в условиях физиологической и особенно репаративной регенерации кости.
Исследования, направленные на изучение видовой совместимости костной ткани, роли ксенокомпонентов кости в физиологических процессах её ремоделирования и восстановления позволят решить ряд теоретических задач и практического применения ксенокомпонентов кости.
Все вышеизложенное побудило нас провести комплексное исследование внеклеточного матрикса костной ткани разных видов животных и человека и рассмотреть перспективы применения компонентов матрикса костной ткани при заболеваниях ОДС.
Цель исследования: Сформировать системное представление о
молекулярном составе внеклеточного матрикса костной ткани разных видов животных и человека и изучить возможности использования его отдельных компонентов для поддержания функций кости.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие
основные задачи:
-
Провести сравнительный анализ молекулярного состава минеральных и органических компонентов внеклеточного матрикса костной ткани отдельных видов животных и человека.
-
Оценить изменения минерального и органического состава внеклеточного матрикса костной ткани отдельных видов животных и человека при антиортостатической гипокинезии и нарушении опорной функции кости.
-
Разработать комплексную схему получения биологически активных компонентов матрикса костной ткани, влияющих на её функции.
-
Охарактеризовать состав регуляторных биополимерных компонентов внеклеточного матрикса кости, и оценить их биологическое действие.
-
Исследовать влияние биополимерных компонентов внеклеточного матрикса костной ткани на депонирующую и опорную функцию кости.
-
Изучить особенности различных способов введения биополимерных компонентов внеклеточного матрикса костной ткани на регенерацию кости.
-
Изучить биологическую реакцию кости при воздействии воспроизведенного комплекса на основе фосфата кальция и биополимеров, полученного из внеклеточного матрикса костной ткани.
-
Изучить биологическую реакцию кости при имплантации внеклеточного матрикса костной ткани ксено- и аллогенной природы.
Научная новизна исследования.
Диссертационное исследование решает ряд задач в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013 - 2020 годы по пунктам:
«Научные основы создания новых материалов с заданными свойствами и функциями, в том числе высокочистых и наноматериалов»
Впервые показана возможность использования биополимерных
ксенокомпонентов внеклеточного матрикса быков для коррекции состава кости при остеопоротических изменениях и переломе. Показано, что эффективность использования биополимерных ксенокомпонентов, обладающих, различным совокупным зарядом, зависит от способа их введения.
Установлено, что наилучшие результаты восстановления функций кости
наблюдаются при использовании комплексных имплантационных материалов,
выделенных из костной ткани и содержащих кальцийфосфатное соединение и
биополимерные ксенокомпоненты матрикса, обладающих общим
положительным зарядом.
Впервые проведенная комплексная межвидовая сравнительная оценка
минеральных и органических компонентов матрикса костной ткани является
обоснованием возможности использования ксеноматрикса кости для
восстановления её физиологических функций после переломов и при остеопорозе;
«Биология развития и эволюция живых систем»:
Впервые показано отсутствие значимых отличий в молекулярном составе органического и минерального внеклеточного матрикса костной ткани различных видов животных и человека. Установлено, что количество кальция, фосфатов, коллагена, уроновых, сиаловых кислот в нем не отличается у свиней, быков, крыс, мышей и человека.
Впервые установлено, что динамика изменений минерального,
микроэлементного и органического состава внеклеточного матрикса костной ткани в различные возрастные периоды у животных и человека является однонаправленной.
Показано, что изменения молекулярного состава минерального и органического внеклеточного матрикса костной ткани при различных адаптивно приспособительных реакциях кости, у человека и отдельных видов животных, носят однонаправленный характер, приводящий к восстановлению опорной функции кости. Установлено, что при антиортостатической разгрузке в костной ткани у экспериментальных животных (остеопороз) и человека в период выраженных старческих изменений происходит накопление уроновых кислот, сульфатов, коллагена и кадмия на фоне снижения фосфатов, кальция,
гексозаминов и меди. При регенерации костной ткани у разных видов животных и человека на ранних этапах происходит накопление органических компонентов, в то время как на этапе органотипической перестройки происходит накопление минеральных компонентов;
«Изучение роли в гомеостазе у человека и животных интеграции механизмов деятельности систем пищеварения, дыхания, кровообращения и выделения, участие в регуляции функций этих систем медиаторов, гормонов, инкретинов, аутакоидов, клиническое применение результатов этих работ»:
Впервые установлена идентичность регуляторных биополимерных
компонентов внеклеточного матрикса кости различных видов животных и
человека, участвующих в механизмах интегративной организации
функционирования ОДС. Впервые охарактеризован состав фракции
биополимерных компонентов внеклеточного матрикса костной ткани, имеющих различный совокупный заряд. Установлено, что все фракции содержат в своем составе клеточные факторы, участвующие в регуляции функционирования тканей ОДС при регенерации кости.
Идентичность состава внеклеточного матрикса кости отдельных видов животных и человека является обоснованием возможности использования ксенокомпонентов матрикса костной ткани для регенерации кости.
Новизна результатов исследования подтверждается 10-ю патентами на изобретения и полезные модели Российской Федерации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в
рамках диссертационного исследования научные данные составляют основу
комплексной переработки костной ткани сельскохозяйственных животных с
целью получения отдельных компонентов, предназначенных для
восстановления функций кости (Патент № 2288729. Лунева С.Н., Ковинька М.А., Матвеева Е.Л., Талашова И.А., Накоскин А.Н.; Патент 2325902 Лунева С.Н., Матвеева Е.Л., Накоскин А.Н.; Патент № 2420295 Лунева С.Н., Накоскин А.Н., Матвеева Е.Л., Гасанова А.Г., Спиркина Е.С.). Разработанная схема позволяет получать несколько биологически активных веществ за один этап и может быть ориентирована на получение целевого компонента. Разработанный в лабораторных условиях регламент получения ксенокомпонентов костной ткани может быть применен для промышленного производства на специализированных предприятиях по производству медицинских изделий.
Полученные результаты дают теоретическое обоснование для разработки и внедрения биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса костной ткани в целях коррекции состава матрикса костной ткани для восстановления функций кости при остеопорозе и оптимизации репаративного остеогенеза при нарушении её целостности.
Эффективность имплантации комплексного материала на основе кальций фосфатного соединения и биополимерных ксенофракций внеклеточного матрикса костной ткани в целях восстановления функций кости дает
экспериментально-теоретическую основу для разработки и внедрения комплексных ксеноматериалов, полученных из костной ткани.
Масштабность возможного использования ксенокомпонентов
внеклеточного матрикса кости вытекает из возрастающей потребности учреждений ортопедотравматологического профиля, ветеринарной хирургии в костно-пластическом материале.
Результаты, полученные в процессе выполнения диссертации,
применяются в работе ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России, а именно при получении костно-пластического материала аллокости живых доноров (Патент RU 2495567. Лунева С.Н., Накоскин А.Н., Ковинька М.А.), используемого при ревизионном эндопротезировании крупных суставов, а также при работе с лабораторными животными в рамках исследовательских проектов Центра. Результаты, полученные автором, внедрены в образовательный процесс аспирантов и ординаторов, обучающихся на базе ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России. Кроме того, результаты исследования используются в образовательном процессе студентов Курганского государственного университета, обучающихся по специальности «Химия», «Биология», «Физическая культура и спорт».
Методология и методы исследования. Экспериментальные исследования
проведены на 54-х беспородных собаках подвида (Canis lupus familiaris), 94-х
лабораторных крысах вида (Rattus) линии Вистар и 196-ти лабораторных
мышах вида (Mus musculus) линии СВА, 7-ми свиньях (Sus scrofa domesticus), 6-
ти быках семейства (Bos Taurus Taurus), кадаверном материале человека. Во
внеклеточном матриксе кости определены основные молекулярные
компоненты, такие как кальций, фосфат, коллаген, фрагменты
гликозаминогликанов, а также микроэлементы. В сыворотке крови исследованы
маркеры метаболизма костной ткани. Биохимические исследования
подтверждаются морфометрическими, рентгенологическими методами
исследования. Получение и исследование биополимерных фракций
внеклеточного матрикса проведено методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментным методом исследования. Результаты исследования обработаны общепринятыми методами описательной и непараметрической статистики.
Положения, выносимые на защиту:
1. Молекулярный состав органического и минерального матрикса костной
ткани животных разных видов и человека является тождественным.
-
Изменения, происходящие с возрастом во внеклеточном матриксе костной ткани разных животных и человека, а также при остеопорозе и регенерации костной ткани, носят однонаправленный характер, заключающийся в увеличении депонирования уроновых кислот, сульфатов, коллагена и некоторых микроэлементов, при снижении депонирования кальция, фосфатов и гексозаминов.
-
Компоненты внеклеточного матрикса костной ткани способствуют коррекции её состава при остеопорозе, активизируют процессы регенерации
костной ткани при переломе и ускоряют замещение дефектов костной ткани при имплантации.
4. Кость является источником для получения биологически активных ксенокомпонентов, влияющих на её физиологические функции.
Достоверность результатов выполненной работы подтверждается исследованиями с использованием адекватного количества экспериментальных животных и применением современных методов исследования, высокоточных приборов, а также соответствием требованиям современной нормативно-правовой документации. Кроме того, достоверность работы подтверждается опубликованием её основных результатов в отечественных печатных изданиях, рецензируемых специалистами в данной области.
Результаты проведенной работы, положения, выносимые на защиту и их доказательство представляют собой крупное достижение в области физиологии костной ткани; кроме того, в диссертационном исследовании решена значимая научно-практическая задача, имеющая важное медико-социальное значение.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и
обсуждены на 10 юбилейном конгрессе 5th Meeting of the A.S.A.M.I.
International (St. Petersburg, 2008); 86-м конгрессе СОФКОТ, Париж 2011; на 10
юбилейном конгрессе «Человек и его здоровье» (СПб., 2005); научно-
практической конференции с международным участием «Остеопороз и
остеоартроз - проблема XXI века: морфофункциональные аспекты диагностики,
лечения и профилактики» (Курган, 2009); Всероссийской научно-практической
конференции «Клеточные и нанотехнологии в биологии и медицине» (Курган,
2007); Научно-практической конференции «Физиологические механизмы
адаптации человека» (Тюмень, 2010); Научно-практической конференции с
международным участием «Илизаровские чтения» (Курган 2010, 2011); 69-й
республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и
молодых ученых республики Башкортостан с международным участием
«Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2004); Российской
конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица,
приуроченной к 65-летию Челябинской государственной медицинской
академии: «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии»
(Челябинск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции
«Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в
травматологии-ортопедии и нейрохирургии» (Саратов, 2013), заседании ортопедов и травматологов Курганской области (Курган, 2008, 2010).
Место выполнения диссертации и личный вклад соискателя. Основная часть работы выполнена на материально-технической базе ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России. Экспериментальные исследования проведены на базе вивария РНЦ «ВТО». Хроматографические и биохимические исследования проведены на базе лаборатории биохимии РНЦ «ВТО». Автором сформулированы основные положения, выносимые на защиту, заключение и выводы по работе. Проведены исследования внеклеточного костного матрикса у здоровых животных при остеопорозе и переломе.
Самостоятельно реализована работа по выделению биополимерных
ксенокомпонентов внеклеточного матрикса быков и их хроматографическое исследование. Проведены биохимические исследования костной ткани и сыворотки крови. Исследование содержания микроэлементов в костной ткани выполнены автором на базе кафедры физической и прикладной химии Курганского государственного университета. Морфологические исследования проведены в лаборатории морфологии РНЦ «ВТО». Автором подготовлены статьи для публикации в научных журналах, опубликованы изобретения по теме диссертации. Соискателем проводится практическая работа по регистрации и внедрению изделий медицинского назначения на основе алло- и ксенокости, получаемых в РНЦ «ВТО».
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 53 работы, из них в журналах, рекомендованных для публикации результатов докторских диссертаций ВАК Минобрнауки России, 17 публикаций. Научная новизна отражена в 10 свидетельствах на изобретения и полезные модели, опубликованные в официальном бюллетене ФИПС «Изобретения. Полезные модели».
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы, изложена на 265 страницах машинописного текста. Список литературы включает 361 источник, в том числе 114 иностранных. Диссертация иллюстрирована 66 рисунками и 61 таблицами. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава РФ № госрегистрации 01200807681, при поддержке грантом Правительства Курганской области № 28 от 15.02.2013.
Роль биополимерных факторов в коррекции состава внеклеточного матрикса костной ткани
Скелет человека и животных выполняет опорную функцию. Исходя из этого, костная ткань является самой твердой в сравнении с остальными тканями организма. Механическая прочность кости достигается за счет внеклеточного матрикса, который занимает более 90 % объема кости. Внеклеточный костный матрикс кости представлен органической и неорганической составляющей. Органическую - представляет в основном коллаген первого типа, неорганическую кальций фосфатные соединения различного состава [19]. Структура кости у различных видов млекопитающих имеет свои особенности, как по составу, так и по ультрамикроархитектонике. Однако основные принципы строения кости у различных видов млекопитающих остаются неизменными. Тем не менее, вопрос о значимости отличия строения, состава костного внеклеточного матрикса разных видов млекопитающих остается открытым [249]. Существуют объективные причины проведения исследований направленных на изучение состава внеклеточного матрикса кости. Это возможность применения в качестве имплантационных материалов тканей животных, без потери прочностных характеристик и минуя морально-этические, нормативно-правовые и санитарно-эпидемиологические проблемы ксенотрансплантации. Актуальность разработки таких имплантов на сегодняшний день высока. Увеличивается необходимость замещения обширных дефектов кости в травматологии и ортопедии. Вторая причина – знания о видовых отличиях состава костной ткани позволит определить адекватную экспериментальную модель и вид экспериментального животного при проведении исследований в костной имплантологии, а так же определить критерии экстраполяции экспериментальных данных на человека [245; 243; 255; 268; 290]. Третья причина – знания о видовых отличиях состава кости человека и животных актуально в криминалистике и археологии при конкретной идентификации принадлежности костных останков человеку или животному. Таким образом, изучение состава и структуры внеклеточного матрикса различных видов млекопитающих (особенно тех, которые используются в лабораторной практике) имеет как теоретическое, так и практическое значение [48; 76].
Исследованию состава и структуры костной ткани посвящено большое количество работ, основные результаты которых обобщены в отечественных публикациях Л.И. Слуцкого [208] и зарубежных [253].
Костный коллаген представлен в основном первым его типом. Этот тип коллагена достаточно изучен и находит, на сегодняшний день широкое применение в клинической практике в качестве ранозаживляющих губок, как носитель лекарственных средств и т.п. Это обусловлено тем, что коллаген обладает низкой иммуногенностью, не отторгается тканями организма и полностью деградирует, участвуя в метаболических процессах организма. Нативный коллаген представляет собой белок с развитой четвертичной структурой, в состав которой входят и гликозаминогликаны, роль, которых однако, изучена недостаточно. Предполагается их участие в качестве ядер кристаллизации при кальцификации органической матрицы при формировании новой кости [190; 297].
Костный минерал представляет собой смесь различных кальций фосфатных соединений, таких как брушит, гидроксиапатит трикальций фосфат и т.п. Однако, несмотря на достаточно большой накопленный материал неясным остается вопрос о взаимодействии костного минерала и коллагена на химическом уровне [51; 192]. Например, известно, что кость обладает более высокой прочностью в сравнении с различными кальцийфосфатными клеями и цементами, применяемыми в медицинской технике [112]. Данное обстоятельство свидетельствует в пользу того, что между волокнами коллагена и минеральной фазой существует какое-то взаимодействие, обусловливающее высокую механическую прочность кости [75; 283; 298].
Таким образом, накопленные на сегодняшний день факты формируют представление о возможности применения минерализованного костного матрикса, в качестве импланта для замещения дефектов кости.
Кроме того, в настоящее время проводится активный поиск новых имплантационных материалов для травматологии, ортопедии и стоматологии. Неотъемлемой частью таких поисков является тестирование различных имплантационных материалов на животных [245]. Для того чтобы определить, является ли разработанный имплантат биосовместимым, механически стабильным и безопасным, он должен пройти тщательное тестирование как in situ и в естественных условиях. Результаты лабораторных исследований зачастую нельзя экстраполировать на ситуацию в естественных условиях. В связи с этим используются экспериментальные модели на животных для тестирования ортопедических и стоматологических имплантатов до их клинического применения. В связи с этим, возникает вопрос, о том какой вид животных наиболее пригоден для тестирования костных имплантов. Наиболее часто в экспериментальных моделях используются собаки, овцы, козы, свиньи и кролики. Факторы для рассмотрения при выборе модели животных и конструкции имплантата обсуждаются [245; 298; 299; 303; 305; 309].
A.I. Pearce et all в своих исследованиях сходства и различий костной ткани человека и лабораторных животных (собака, свинья, овца, кролик) показали, что по макроструктуре кости человека наиболее схожи с костями овец. Микроструктура костной ткани человека имела наибольшее сходство с костной тканью собаки и свиньи. По химическому составу костной ткани авторы не обнаружили значимых отличий у человека, свиней и собак. Кроме того, авторами исследования обнаружено сходство процессов ремоделирования костной ткани человека и свиньи. Таким образом, по заключению A.I. Pearce существует общность макро- и микроархитекроники костной ткани, её состава и процессов ремоделирования у отдельных видов лабораторных животных и человека [243; 296].
Микроэлементам в последнее время уделяется все больший интерес. Это связано с их значимой ролью в физиологических процессах не только в костной ткани, но и во всем организме. Так как костная ткань является депо кальция, фосфатов, и многих микроэлементов изучение их содержания в матриксе костной ткани является актуальным.
Методы исследования сыворотки крови
Работа выполнена на базе лаборатории биохимии ФГБУ «Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Экспериментальные исследования проведены на 5 видах плацентарных млекопитающих, а именно 54 беспородных собаках подвида Canis lupus familiaris, 94 лабораторных крысах вида Rattus линии Вистар, 196 лабораторных мышах вида Mus musculus линии СВА, 7 свиньях Sus scrofa domesticus, 6 быках семейства Bos Taurus Taurus, а также на 50 образцах кадаверной костной ткани человека.
Материалом для исследования экспериментальных животных послужили: костная ткань, сыворотка крови.
На проведение экспериментальных исследований получено разрешение этического комитета при ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава РФ. Экспериментальные исследования проводили, руководствуясь требованиями, изложенными в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [68] и в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755; требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник от 06.01.1973г с соблюдением этических норм и гуманного отношения к объектам изучения.
Исследование кадаверного материала производилось в соответствии с приказом Минздрава № 694 от 21 июля 1978 г. п. 2.24 «Инструкция о производстве судебно-медицинской экспертизы в СССР» [185]. В I серии экспериментов для изучения общих закономерностей состава внеклеточного матрикса здоровой кости и изменений, происходящих при различной патологии, исследовали:
в первой группе внеклеточный матрикс здоровой костной ткани половозрелых особей, не имеющих костной патологии, содержащихся на полноценном рационе: крыс (n=20), собак (n=8), мышей (n=10), свиней (n=7), быков (n=6) и человека (n=7).
Во второй группе изучали изменения состава внеклеточного матрикса в различные возрастные периоды на кадаверном материале человека (n=19) и собаки (n=15).
В третьей группе изучали изменения состава внеклеточного матрикса кости при остеопорозе: собака (n=12), мышь (n=20), человек (n=13).
В четвертой группе исследовали изменения состава внеклеточного матрикса кости при регенерации костной ткани на модели перелома голени: мышь (n=18), крыса (n=18), собака (n=11).
Во II серии экспериментов исследовали возможность использования различных ксеноматериалов внеклеточного матрикса.
В первой группе оценивали общее действие биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса быков, имеющих различный совокупный заряд, на мышах (n=132). Для этого животным внутрибрюшинно вводили 0,1 мл раствора биополимерных ксенокомпонентов из расчета 10 мг на 1 кг живого веса мыши.
Во второй группе животным вводили такое же количество раствора натрия хлорида с концентрацией 0,9% (группа контроля).
В III серии исследовали влияние биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса костной ткани быков, имеющих различный совокупный заряд, на течение остеопороза у мышей (n=54). Животным моделировали остеопороз разгрузкой тазовых конечностей вывешиванием за хвостовую складку. После семи суток разгрузки животным разово внутрибрюшинно вводили 0,1 мл раствора биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса кости быков из расчета 10 мг на 1 кг живого веса мышей. Животных выводили из опыта декапитацией на 7, 14 и 28 сутки после введения препарата.
В первой группе вводили фракцию биополимеров костной ткани с суммарным положиткльным зарядом (Фракция «К»).
Во второй группе вводили фракцию биополимеров костной ткани с суммарным отрицательным зарядом (Фракция «А»).
В третьей группе вводили раствор натрия хлорида в концентрации 0,9% (контрольная группа).
В IV серии исследовали влияние биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса быков с положительным совокупным зарядом на заживление перелома суставной впадины у собак при различном способе введения (n=16). Всем животным моделировали поперечный перелом суставной впадины с последующей фиксацией тазобедренного сустава аппаратом Илизарова [25]. Оперативные вмешательства выполнены совместно с д.б.н. В.В. Красновым. В первой группе (n=6) на седьмые, четырнадцатые и двадцать первые сутки после операции вводили раствор биополимерных ксенокомпонентов внутриартикулярно. Во второй группе (n=6) вводили 1 мл раствора биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса быков в количестве 10 мг перорально. В третьей группе (n=4) животным в качестве контроля введения компонентов не производилось. Животных выводили из эксперимента на 14 и 42 сутки после операции. Эвтаназию собак проводили внутривенным введением 5% раствора тиопентала натрия в летальных дозах.
В V серии исследовали биополимерных компонентов внеклеточного матрикса быков на сращение перелома голени у крыс (n=56). Животным моделировали перелом голени с сохранением целостности малоберцовой кости по [139; 178; 179]. Оперативные вмешательства выполнены совместно с к.в.н. О.В. Дюрягиной.
Возрастные изменения состава внеклеточного матрикса костной ткани некоторых видов животных и человека
В предыдущих главах мы показали, что в норме и с возрастом у различных видов животных и человека происходят схожие изменения состава внеклеточного матрикса кости. Однако мы считаем, что более полной характеристики необходимо исследовать высокомолекулярные соединения, входящие в состав матрикса кости. Прежде всего, это связано с тем, что костная ткань депонирует не только микро- и макроэлементы, но и многие регуляторные пептиды и белки [89]. Это необходимо для понимания возможности использования этих соединений для решения практических задач. Однако применение отдельных белков достаточно давно освоено и широко используется на практике.
Мы ставили перед собой задачу изучить идентичность выделяемых нами белков с помощью ВЭЖХ. Исследования такого рода необходимы для понимания общности физико-химических характеристик получаемых нами белков. Строение и состав биополимеров костной ткани отражается на их взаимодействии с носителем колонки ВЭЖХ, тем самым определяя их физико-химические характеристики. Для достижения поставленной задачи нами получен пул водорастворимых белков костной ткани быков, свиней, собак и человека. Исследование проводили на препаративной гельпроникающей колонке Shodex protein KW-2002.5. Результаты проведенных хроматографических исследований представлены на рисунке 5.
Полученные нами данные гельпроникающей ВЭЖХ выявили, что пул водорастворимых белков костной ткани всех видов исследуемых животных и человека представлен четырьмя основными фракциями с различными молекулярными массами. В соответствии с данными калибровочных графиков было установлено, что в области 28 минуты элюируются белки с молекулярной массой около 15 кДа. У всех исследуемых видов животных и человека данный пик является достаточно широким, что свидетельствует о том, что в его состав входят белки достаточно широкого диапазона от 6 до 20 кДа. Скорее всего, данный пик состоит из крупномолекулярных агрегатов коллагена, альбуминов, и других белков матрикса и тканевой жидкости.
Второй интенсивный пик, расположенный в области 39 минуты практически не имеет отклонений от Гаусовского распределения и ярко выражен у всех исследуемых животных и человека. Молекулярный вес этой фракции в соответствии с калибровочным графиком составляет 0,32 кДа. В целом этот пик представлен, скорее всего, низкомолекулярными пептидами. Остальные фракции имеют незначительную интенсивность и лежат в области малых молекулярных масс.
Безусловно, мы понимаем, что отнесение полученных нами фракций к тому или иному молекулярному весу носит ориентировочный характер. Это обстоятельство мы связываем с тем, что белки калибраторы, по которым построена калибровочная кривая, имеют преимущественно глобулярную форму, так как это белки сыворотки крови. Мы же выделяли белки из матрикса костной ткани, представленные в основном фибриллярными белками. Данное обстоятельство вносит свои коррективы в исследование. Мы полагаем, что полученные нами значения молекулярных масс несколько занижено в виду наличия большого числа фибриллярных белков, входящих в состав костного матрикса их продвижение по гелю колонки медленнее, чем у глобулярных белков, соответственно и увеличивается время удерживания в колонке. К сожалению, на сегодняшний день не существует калибраторов гельпроникающих колонок белками фибриллярной природы, и установить истинные молекулярные веса получаемых нами фракций не представляется возможным. Тем не менее, для нас это не является определяющей задачей. Таким образом, высокомолекулярный состав фракций, выделяемых нами по одинаковой технологии, белков матрикса костной такни у разных видов животных и человека является идентичным по молекулярному весу.
Молекулярный вес белков, является важной, но не определяющей характеристикой костных белков. Для определения заряда белков, и их кислотно-основных характеристик мы провели исследование аффинитета белков матрикса костной ткани некоторых видов животных и человека к ионообменникам. Результаты исследования представлены на рисунке 6. При проведении анионообменной хроматографии фракций белков костного матрикса у различных животных и человека нами установлено, что их состав несколько варьируется в зависимости от сродства к носителю колонки. В целом же хроматографические профили практически совпадают как по времени удержания в колонке, так и по интенсивности пиков. Незначительную вариабельность в данном случае мы объясняем тем, что в процессе выделения белков из матрикса использовалась хлороводородная кислота. Не смотря на все методы контроля её присутствия при диализе белков матрикса мы не исключаем сорбцию хлорид-ионов на белковых молекулах. Присутствие даже малых количеств хлоридов в изначальном исследуемом белке изменяет его сродство к анионобменнику. uV 0 0 25.0 50.0 75 .0 100.0 min Рисунок 7. Хроматографические профили низкомолекулярных белков костной ткани быка, человека, собаки и свиньи полученный с использованием катионообменной хроматографии на колонке Shodex IEC SP-2825, скорость потока 3 мл/мин, светофильтр 276 нм. Полученные хроматографические профили свидетельствуют о том, что сродство к катионообменнику у белков матрикса костной ткани одинаковое, отличающееся лишь интенсивностью. Собранность пика свидетельствует о том, что, в состав данной фракции входят небольшое количество белков с одинаковым зарядом.
Таким образом, поученные нами хроматографические профили белков матрикса костной ткани гельпроникающей и ионообменной хроматографии разных видов животных и человека принципиальных отличий не имеют. Данное обстоятельство свидетельствует о том что, белки матрикса костной ткани разных видов животных и человека, полученные по одинаковой технологии имеют общие физико-химические характеристики, такие как молекулярный вес и сродство к ионообменным смолам. Можно предположить, что в состав получаемых фракций входят одни и те же составляющие компоненты, идентичные у разных видов животных. Изучить состав этих фракций не являлось задачей нашего исследования. Однако мы полагаем, что в состав выделяемых нами фракций белков входя дериваты коллагена и некоторые регуляторные пептиды. Общность хроматографических профилей, т.е. общность их физико-химических характеристик, дает основание полагать, что биологические свойства белков костного матрикса также будут схожи.
Оценка влияния способа введения биополимерных ксенокомпонентов на нарушение опорной функции кости
Анализ содержания основных макроэлементов костной ткани у крыс контрольной группы показал различный по абсолютной величине дефицит кальция, неорганического фосфата и магния в прооперированной конечности по сравнению с контрлатеральной. В опытной группе наоборот наблюдалось накопление данных макроэлементов в прооперированной конечности, что, скорее всего, связано с действием биополимерных ксенокомпонентов костной ткани быков и активации процессов оссификации костной ткани.
Изменения концентрации Mg костной ткани у крыс контрольной и опытной группы однонаправлены: тенденции роста сменялись снижением. Однако, содержание Мg у крыс опытной группы было достоверно выше на всех этапах эксперимента по сравнению с контрольной группой: на этапе Ф-14 сут. выше в 1,3 раза (Р 0,01), на этапе Ф-21 сут. в 2,4 раза (Р 0.01), на этапе Ф- 28 сут. в 3,2 раза (Р 0,01) (Таблица 48). контралатеральная конечность; ОО – опытная группа оперированная конечность. ОК – опытная группа контралатеральная конечность. - достоверные различия контрольной и опытной группы по критериюW-Вилкоксона при уровне значимости р 0,05. Значения приведены в виде медианы (25-й и 75-й персентили).
Об интенсивности углеводного обмена мы судили по изменению в сыворотке крови концентрации продуктов обмена углеводов: молочной (МК) и пировиноградной кислот (ПВК). В ходе эксперимента происходило накопление данных метаболитов и достигало максимума на 28 сутки периода фиксации, как в опытной, так и в контрольной группе. Это свидетельствует об увеличении интенсивности углеводного обмена в тканях при травме. Нами отмечено повышение концентрации креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, особенно на 149 сыворотке крови крыс в ходе эксперимента. - достоверные различия контрольной и опытной группы по критериюW-Вилкоксона при уровне значимости р 0,05.
Таким образом, биополимерные ксенокомпоненты костной ткани быков оказывают влияние на сращение перелома голени у крыс. При этом в сыворотке крови экспериментальной группы наблюдалось значимо высокий индекс фосфатаз. Проведенное исследование водного экстракта зоны перелома и контрлатеральной конечности позволяет сделать заключение о том, что введение ксеноматериалов биополимерных компонентов костной ткани быков носит системный характер, изменяя активность ферментов и содержание кальция фосфата.
Проведенное нами исследование оценки влияния биополимерных ксенокомпонентов внеклеточного матрикса быков показало, что и при внутриартикулярном и при пероральном введении наблюдается ответная реакция организма реципиента на введение. Так при внутриартикулярном введении биополимерной ксенофракции «К», выделенной из костной ткани быков, собакам в сыворотке крови наблюдалось понижение концентрации кальция и понижение концентрации фосфатов. В то время как в группе с пероральным введением концентрация кальция в сыворотке крови не отличалась от контрольной группы, на фоне повышенного содержания фосфатов. Это подтверждает и исследование СИЭ – значения, которого в группе с внутриартикулярным введением был ниже, чем в контрольной группе и группе животных с пероральным введением бмополимерной ксенофракции «К». Установлено также, что в сыворотке крови животных с внутриартикулярным введением биополимерной ксенфракции «К» фосфатазный индекс был выше, чем в контрольной группе и группе с пероральным введением. Данные обстоятельства указывают на то, что внутриатикулярное введение биополимерной ксенофракции «К», выделенной из костной ткани быков, усиливает процессы костеобразования и ослабляет резорбтивную активность костной ткани при внутриартикулярном переломе вертлужной впадины. Данные биохимических исследований подтверждены и морфометрическими данными. Плотность клеток остеобластической линии в зоне перелома была достоверно выше в группе животных с внутриартикулярным введением фракции «К» по сравнению с контрольной группой и группой животных с пероральным введением. Кроме этого, при локальном введении в зону перелома биополимерной ксенофракции «К» из костной ткани быков крысам, установлено, что в зоне перелома увеличивается активность щелочной фосфатазы и кальция. На основании полученных данных можно заключить, что эффективность влияния биополимерной ксенофракции «К» на регенеративные процессы, протекающие в зоне перелома, зависит от способа введения. При этом локальное введении является наиболее эффективным.
Разработка и внедрение в практику оказания ортопедо-травматологической помощи имплантационных материалов является актуальной современной задачей. Применение природных имплантационных материалов на основе кальцийфосфатных соединений является особенно востребованным при замещении дефектов костей и при реэндопротезировании суставов. В то же время нативные свойства кальцийфосфатных соединений в смеси с рострегулирующими факторами дают значимый эффект при замещении дефектов костей.
Необходимость замещения костных дефектов и полостей возникает при лечении целого ряда заболеваний, связанных с патологией костной ткани. В настоящее время для пластики костных полостей используются биоматериалы естественного происхождения – аутотрансплантаты, аллоимплантаты, ксеноимплантаты и искусственные биоматериалы – полимеры, стеклокерамика (биоситаллы), поликристаллические материалы (керамика) на основе гидроксиапатита и -трикальций фосфата, а также композиты на их основе.
Необходимость поиска альтернативы ауто- и аллотрансплантации, в силу имеющихся у этих методов недостатков, побуждает исследователей к созданию материалов с комплексом особых свойств, присущих естественной костной ткани. Имплантация этих материалов с целью возмещения костных дефектов не должна приводить к нарушению функций костной системы в целом.
Для создания имплантационных материалов нового поколения, используемых для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом, используется междисциплинарный подход в разработке технологий их получения. Основные принципы данного подхода заключаются в создании и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующих материалов, которые используются в сочетании либо с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами.