Механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии Солпов Алексей Владимирович

Введение к работе

* ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые цитокинами. Известно, что непосредственная адгезия играет существенную роль во взаимодействии между тромбоцитами и нейтрофилами. Установлено, что адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зоїгу повреждения, а следовательно воспаления и развития там иммунных и ре-паративных реакций.

Тромбоциты способны вступать в контакт с гранулоцитами в процессе остановки кровотечения и развития воспалительной реакции (Hawrylowich СМ. et al., 1991). Установлена взаимосвязь между гемостатическими и воспалительными реакциями при повреждении тканей, в которой ключевым звеном выступает взаимодействие полиморфноядерных лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиаль-ных клеток. Эту кооперацию с участием ряда интегринов, регулируют хемокины, цитокины, факторы роста, производные радикалов кислорода, вызывающие усиленную коагуляцию и репарацию тканей в месте их повреждения (Folkman J. et al, 2001; Hawrylowich CM. et al., 1991; Kuijupes T.W. et al., 1991). Данный феномен может иметь определенное патофизиологическое значение, так как активация тромбоцитов на поврежденной поверхности сосудистой стенки может служить важным фактором в миграции лейкоцитов в толщу сосуда и дальнейшему формированию тромба. Так известно, что при активации нейтрофилы человека высвобождают микрочастицы, называемые эктосомами, непосредственно с поверхности клеточной мембраны. Микрочастицы тромбоцитов, эндотелиальных клеток и моноцитов поддерживают коагуляцию или модулируют сосудистый гомеостаз через активированные моноциты и эндотелиальные клетки (Gasser Q, Schiffea-li ДА, 2004).

Адгезия лейкоцитов и тромбоцитов к эндотелиальным клеткам вовлекается в патогенез ишемического повреждения сосудов (Ishikawa М. et al., 2004). Это связано с экспрессией тканевого фактора, перемещение которого к моноцитам может осуществляется через СП62Р-опосредованную адгезию тромбоцитов или микрочастиц (Losche W. et al, 2004). Тромбоциты повышают фагоцитоз лейкоцитов через факторы, высвобождаемые тромбоцитами, например ADP (Miyabe K.et al., 2004). Вместе с этим, активированные Т-лимфоциты усиливают экспрессию Р-селектина кровяными пластинками (Danese S. et al., 2004).

* Работа выполнена при поддержке фанта Президента РФ (приказ Минобразования РФ №1632 от 30.04.2002 г.)

Выражаем сердечную признательность профессору Борису Шенкману (Израиль) за помощь в выполнении работы.

3 РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ' БИС". ПОТЕКА C.ftttepOyP*'

Однако наряду с реакциями неспецифяческой защиты организма развивается иммунный ответ, главными участниками которого являются лимфоциты (Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004). К сожалению, механизмы взаимодействия этих клеток с кровяными пластинками недостаточно изучены.

В последнее время установлено, что CD40L экспрессируется не только стимулированными Т-лимфоцитами, но также активированными тромбоцитами, причем растворимая фракция лиганда имеет исключительно тромбоцитарное происхождение (Nagasawa М, et al.. 2005), Более того, высказывается мнение, что кровяные пластинки являются провоспалительными клетками и принимают участие в иммунных реакциях, модулируя функции лимфоцитов, моноцитов, анти-генпрезентирующих клеток (Fricke I. et al., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004).

Однако до сих пор еще не ясен характер межклеточного контакта и механизмы передачи сигналов тромбоцитами. В связи с вышесказанным, изучение лим-фоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия является актуальной задачей, решение которой раскрывает новые возможности для понимания механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

Цель и задачи исследования

Основной целью нашего исследования явилось изучение механизмов лим-фоцитарно-тромбоцитарной адгезии в опытах in vitro.

В связи со сказанным нами решались следующие задачи.

1. Выяснить, какие субпонуляции лимфоцигов способны к спонтанной адгезии с интактными тромбоцитами. Изучить роль молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в лимфоцитарно-пластиночном контакте.

2. Исследовать влияние цитокинов - IL-ip, IL-2, IL-4, IL-10, IL-16, TNFa, IFNy на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

3. Исследовать влияние индукторов агрегации тромбоцитов (ADP, коллагена, адреналина, тромбина, PAF) на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

4. Получить С04+-субпопуляцию лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации и проследить влияние тромбоцитов на адгезию клеток к субэндоте-лиальному матриксу.

5 Выяснить роль тромбоцитов в адгезии клеточной линии CD4+ (HVST-клона) к экстрацеллюлярному матриксу в условиях статики и разных сдвигах тока жидкости.

6. Сравнить экспрессию интегринов а,р, (VLA-1), a₂Pj (VLA-2), а₄р, (VLA-4), а₅Р₍ (VLA-5) свежевыделенных и культивированных СБ4+-лимфоцитов доноров с HVST трансформированной линией CD4+ лимфоцитов. Изучить роль интегринов аД (VLA-1), аД (VLA-2), а₄Р, (VLA-4), аД (VLA-5), CD40L и PSGL в опосредованной тромбоцитами адгезии СВ4+-лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу.

Научная новизна. Впервые установлено, что Т-хелперы (CD4+) способны к спонтанной, а натуральные киллеры (CD 16+) - к lL-2-индуцированной адгезии с интактными тромбоцитами. Адгезивную активность лимфоцитов стимулирует также IL-ip. Ингибиторами ЛТА являются (L-4, IL-IO и IFNy . Агонисты агрегации кровяных пластинок коллаген и ADP повышают лимфоцитарно-тром-боцитарную адгезию. Лигандом лимфоцигарио-пластиночного контакта выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1).

Впервые обнаружено, что тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. В этих условиях лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоци-тарно-громбоцитарные кластеры, находится в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной.

Впервые описаны механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия, включающие в себя образование ингегриновых и неинтегриновых мостов, таких как a_1H/P₃- и р,-связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L.

Впервые показано регулирующее действие интерлейкинов в формировании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегагов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса: IL-2 и IL-16 повышают адгезивные свойства клеток в присутствии кровяных пластинок.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о субпон>ляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегагов, роли цитоки-нов в регуляции функции ЛТА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномоду-лирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.

Внедрение в практику. Теоретические сведения о функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, механизмах ее регуляции и биологическом значении внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия. Тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии используется в диагностической лаборатории ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия.

Материалы по исследованию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в норме и патологии вошли в отчет за 2003 год по федеральной программе "Совершенствование технологии трансплантации стволовых гемопоэтических кле-

ток, химио-, иммуно- и сопроводительной терапии заболеваний системы крови; разработка новых форм организации средств и методов трансфузионно-инфузи-онной терапии" (договор № 005/037/002 от 25.09. 2001 г.).

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на: Фестивале "Студенческая медицинская наука'98" (Москва, 1998), 15, 16, 17, 18 Международных конгрессах по тромбозу (Antalya, Porto, Bologna, Lubljana, 1998,2000,2002, 2004), XVII, XVIII, XIX Конгрессах Международного общества по тромбозу и гемостазу - ISTH (Washington, 1999; Paris, 2001, Birmingham, 2003), на Международном симпозиуме "Platelets 2000" (Ma'ale Hachamisha, Israel), XVIII съезде Физиологического общества им.И.П. Павлова (Казань, 2001), Конференции международного цитокинового общества - ICS (Гаваи, 2001), на заседании проблемной комиссии по физиологии тромбоцитов (Университет Тель-Авива, Израиль, 2004), Второй Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2005).

Положения, выносимые на защиту:

5. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Наиболее выраженной способностью к образованию коагрегатов с интактными лимфоцитами обладают Т-хелперы (CD4+) и NK-клетки (CD16+). Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1САМ-1).

6. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Повышают эту функцию lL-lp\ 1L-2, коллаген, адреналин и ADP Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются 1L-4, 1L-10 и IFNy.

7. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному мат-риксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного магрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной. Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегрино-вых и неинтегриновых мостов, таких как а_||Ь/р.,- и Р^связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L.

8. Интерлейкины 2 и 16 повышают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, мате-