Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1 Общие сведения о нейродегенеративных заболеваниях 17
1.2 Роль -амилоидного пептида в развитии нейродегенеративных заболеваний
1.2.1 Продукция -амилоидного пептида 25
1.2.2 -амилоидный пептид и генетика семейных форм болезни Альцгеймера 27
1.2.3 Агрегация и накопление -амилоидного пептида 28
1.2.4 Механизмы нейротоксичности -амилоидного пептида 30
1.3 Синаптическая теория патогенеза нейродегенеративных заболеваний 38
1.3.1 Синаптическая дисфункция при болезни Альцгеймера 40
1.3.2 Синаптическая дисфункция при боковом амиотрофическом склерозе
1.4 Нейротрофические факторы в патогенезе нейродегенеративных заболеваний 42
1.5 Роль нейроглии в развитии нейродегенеративных заболеваний 43
1.6 Неавтономно-клеточная дегенерация 46
1.7 Дисфункция периферических возбудимых структур в патогенезе
нейродегенеративных заболеваний 48
1.7.1 -амилоидный пептид и периферические нарушения: вклад в нейродегенеративный процесс 48
1.7.2 Нарушения нервно-мышечной синаптической передачи при нейродегенеративных заболеваниях 51
1.7.3 Нейродегенеративные заболевания и патология сердечно-сосудистой системы 53
1.8 Генно-клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний 58
1.8.1 Мононуклеарные клетки пуповинной крови 61
1.8.2 Экспрессионные векторы для генно-клеточной терапии 63
1.8.3 Нейротрофические факторы и нейродегенеративные заболевания 64
1.8.4 Генно-клеточные технологии для лечения болезни Альцгеймера 68
1.8.5 Генно-клеточные технологии для лечения бокового амиотрофического склероза 75
1.9 Генетические модели нейродегенеративных заболеваний на животных 78
1.9.1 Трансгенные модели болезни Альцгеймера 78
1.9.2 Трансгенные модели бокового амиотрофического склероза 89
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 94
2.1 Объект исследования 94
2.2 Электрофизиология 96
2.3 Флуоресцентная микроскопия 98
2.3.1 Прижизненное флуоресцентное окрашивание нервно-мышечных препаратов 98
2.3.2 Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных препаратов 101
2.4 Исследование ретроградного аксонного транспорта 106
2.5. Миография 107
2.5.1 Регистрация сократительных ответ скелетных мышц 107
2.5.2. Регистрация сократительных ответов сердечной мышцы 109
2.6 Создание генно-клеточных конструкций на основе мононуклеарных клеток пуповинной крови человека 110
2.7 Трансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови животным 111
2.8 Поведенческие тесты 111
2.9 Статистический анализ 114
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение собственных исследований 115
3.1. Поведенческие нарушения в генетических моделях нейродегенеративных заболеваний на животных 115
3.1.1 Поведенческое тестирование трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера 115
3.1.2 Поведенческое тестирование трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофического склероза 118
3.2 Синаптическая дисфункция в моделях нейродегенеративных заболеваний119
3.2.1 Параметры нервно-мышечной синаптической передачи мышей дикого типа 120
3.2.2 Нарушение нервно-мышечной синаптической передачи в -амилоидной модели нейродегенерации 126
3.2.3 Нарушение нервно-мышечной синаптической передачи в генетической модели болезни Альцгеймера 131
3.2.4 Нарушение нервно-мышечной синаптической передачи в генетической модели бокового амиотрофического склероза. Временной ход развития нарушений 137
3.3 Нарушения электрогенеза и сократимости скелетных мышц в моделях нейродегенеративных заболеваний 147
3.3.1 Электрогенез и сократительные характеристики диафрагмы мышей дикого типа 147
3.3.2 Влияние -амилоидного пептида на электрогенез и сократимость скелетных мышц 150
3.3.3 Нарушение электрогенеза и сократимости скелетной мышцы в генетической модели болезни Альцгеймера 156
3.3.4 Нарушение электрогенеза и сократимости скелетных мышц в генетической модели бокового амиотрофического склероза 161
3.4 Дисфункция механизмов регуляции сократимости миокарда в генетической
модели болезни Альцгеймера 167
3.4.1 Адренергические механизмы регуляции сократимости миокарда у APP/PS1 мышей 168
3.4.2 Холинергические механизмы регуляции сократимости миокарда у APP/PS1 мышей 173
3.5 Нарушение ретроградного аксонного транспорта под действием амилоидного пептида 179
3.6 Генно-клеточные способы коррекции нарушенных функций у трансгенных
мышей с моделью бокового амиотрофического склероза 183
3.6.1 Поведенческое тестирование мышей с моделью бокового
амиотрофического склероза на фоне генно-клеточной терапии 183
3.6.2 Иммунофлуоресцентный анализ спинного мозга мышей с моделью
бокового амиотрофического склероза на фоне генно-клеточной терапии 184
3.7 Генно-клеточные способы коррекции нарушенных функций у трансгенных
мышей с моделью болезни Альцгеймера 189
3.7.1 Поведенческое тестирование мышей с моделью болезни Альцгеймера на
фоне генно-клеточной терапии 190
3.7.2 Иммунофлуоресцентный анализ гиппокампа и коры головного мозга
мышей с моделью болезни Альцгеймера на фоне генно-клеточной терапии 195 3.7.3 Оценка процессов нейрогенеза и синаптогенеза в гиппокампе мышей с
моделью болезни Альцгеймера на фоне генно-клеточной терапии 198
Заключение 208
Выводы 212
Список сокращений 215
Список литературы 218
- -амилоидный пептид и генетика семейных форм болезни Альцгеймера
- Флуоресцентная микроскопия
- Поведенческое тестирование трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера
- Нарушение нервно-мышечной синаптической передачи в генетической модели болезни Альцгеймера
-амилоидный пептид и генетика семейных форм болезни Альцгеймера
Полученные научные данные расширяют наши представления о молекулярных механизмах функционирования возбудимых тканей в норме и при нейродегенерации. В диссертационном исследовании были открыты новые, ранее неучтенные аспекты патогенеза ряда нейродегенеративных заболеваний, связанные с дисфункцией возбудимых структур нервно-мышечной и сердечнососудистой систем, что имеет важное значение как для фундаментальной, так и клинической медицины. В целом, полученные научные данные раскрывают молекулярные механизмы реализации функций возбудимых тканей в норме и при патологии нервной системы.
В ходе исследования были разработаны перспективные генно-клеточные подходы для лечения нейродегенеративных заболеваний. В частности, были проведены доклинические исследования генно-клеточных конструкций на основе МКПК и аденовирусов, сверхэкспрессирующихVEGF или GDNF на моделях болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза. Проведенные инновационные разработки могут лечь в основу внедрения современных высокоэффективных лекарственных средств в медицинскую практику.
Полученные результаты могут найти применение в таких областях науки, как фундаментальная медицина, физиология, неврология, нейрохирургия, психиатрия, фармакология. Результаты научных исследований востребованы в медицине и здравоохранении, в частности, в области создания инновационных лекарств и методов ранней диагностики нейродегенеративных заболеваний.
Результаты диссертационного исследования были внедрены в научно-образовательный процесс в Казанском государственном медицинском университете, ФГБНУ «Научный центр неврологии» (г. Москва), Казанском (Приволжском) федеральном университете, Казанской государственной медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Нейродегенеративные заболевания в моделях на животных сопровождаются дисфункцией нервно-мышечной синаптической передачи, нарушением процессов электрогенеза и регуляции сократимости скелетной и сердечной мышц, выраженность которых зависит от стадии развития патологии.
2. Клеточная и клеточно-опосредованная генная терапия с помощью нативных или генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови, экспрессирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста или глиальный нейротрофический фактор, является эффективным методом для коррекции нарушенных функций в моделях нейродегенеративных заболеваний человека. Апробация работы Материалы диссертации были представлены на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), Международном конгрессе «Науки о жизни-2007» (Великобритания, 2007), Всероссийском научном конгрессе с международным участием «В.М.Бехтерев – основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007), XIII Европейском симпозиуме студентов и аспирантов биологов «Symbiose-2009. Биология: расширение границ» (Казань, 2009), Втором всероссийском инновационном конвенте (Санкт-Петербург, 2009), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь. Наука. Будущее: технологии и проекты» (Казань, 2011), Научно-практической конференции «Болезнь Альцгеймера: от молекулярных механизмов патогенеза к диагностике, клинической картине и лечению» (Казань, 2011), седьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, 2011), Съезде физиологов СНГ (Украина, 2011), летней научной школе «Биотехнологии будущего» (Московская область, 2012), Международном научном конгрессе “Understanding brain development and correcting neurological disorders” (Франция, 2012), 17-ой международной школе-конференции «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2013), 38-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Санкт-Петербург, 2013), Симпозиуме по нейронаукам им. Ф.Крика «Меняющийся мозг» (Китай, 2013), Научно-практической конференции «Болезни мотонейронов: этиология, патогенез, современные подходы к диагностике и лечению» (Казань, 2013), XXII Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), Российско-Германском симпозиуме «Молекулярные механизмы нейродегенерации» (Германия, 2014), IV Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2014).
Публикации
Автором опубликовано 57 печатных научных работ по теме диссертации, 25 из них – в ведущих научных рецензируемых журналах, утвержденных Высшей аттестационной комиссией. Личный вклад автора
Приведенные в работе научные результаты получены при личном участии диссертанта на всех этапах работы, включая дизайн, организацию и проведение экспериментов, анализ экспериментальных данных, обсуждение и теоретическое обобщение результатов исследования. Работа выполнена комплексно, на достаточном в количественном отношении статистическом материале исследований.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы, включающего 419 наименований, списка иллюстративного материала. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 46 рисунками. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Нейродегенеративные заболевания (НДЗ), такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и многие другие, поражают 10-15% пожилого населения России и всего мира (распространенность среди популяции в целом – 1-1,5%), что делает их одной из главных медико-социальных проблем современного общества. В настоящее время наблюдается неуклонный рост распространенности, связанный с увеличением продолжительности жизни населения, воздействием неблагоприятных факторов внешней среды и т.д. Так, по прогнозам ученых из John Hopkins University, в 2050 году во всем мире будет насчитываться 106 миллионов людей, страдающих от болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера представляет собой самое распространенное НДЗ, первичное дегенеративное заболевание головного мозга, характеризующееся прогрессирующей гибелью нервных клеток гиппокампа и коры больших полушарий. Впервые заболевание было описано в 1906 году немецким психиатром Алоисом Альцгеймером. Гистологическое исследование нервной ткани выявляет отложения бета-амилоидного белка в виде сенильных бляшек и агрегаты фосфорилированной формы тау–белка в составе нейрофибриллярных клубков [294]. Семейные формы болезни Альцгеймера связаны с дефектами генов белка предшественника амилоида, пресенелинов 1 и 2. Основным фактором риска болезни Альцгеймера является возраст, при этом после 65 лет распространенность болезни удваивается через каждые 5 лет. От болезни Альцгеймера чаще страдают женщины. Основным клиническим признаком заболевания является деменция 18 синдром снижения памяти и других когнитивных способностей, приводящий к нарушению каждодневной активности человека. Начинаясь с когнитивных нарушений (в первую очередь – с нарушений памяти), болезнь Альцгеймера постепенно охватывает все сферы жизнедеятельности человека и становится причиной инвалидности. Смерть наступает в среднем через 8 лет после постановки диагноза. Ключевыми факторами патогенеза болезни Альцгеймера является избыточная продукция и внеклеточное накопление в ткани мозга нейротоксичного -амилоидного пептида и образование внутриклеточных аггрегатов тау-белка и -синуклеина [8, 266, 294] (Рисунок 1). Болезнь Паркинсона Болезнь Паркинсона - идиопатическое и медленно прогрессирующее дегенеративное заболевание ЦНС, занимающее второе место по частоте встречаемости среди нейродегенеративных заболеваний. Характеризуется замедленностью движений, ригидностью мышц, тремором в покое и нарушением позных рефлексов. В основе заболевания — поражение дофаминергических нейронов чёрного вещества и других содержащих дофамин нейронов ствола головного мозга. Причины гибели нейронов при спорадической форме неизвестны. Менделевское наследование заболевания встречается в 5% случаев заболевания. Семейная болезнь Паркинсона типа 1 возникает вследствие мутаций гена -синуклеина, кодирующего пресинаптический белок. Выявлены также мутации генов parkin, DJ-1, NR4A2. У гомозиготных мышей, экспрессирующих дефектный -синуклеин человека, развиваются двигательные расстройства, приводящие к параличу скелетных мышц и, как следствие, к смертельному исходу [123].
Флуоресцентная микроскопия
В качестве модельных объектов для исследования болезни Альцгеймера используют различные линии трансгенных мышей, экрспрессирующих один или несколько мутантных генов человека, отвечающих за развитие этого заболевания, а также на других экспериментальных моделях, такие как плодовая мушка Drosophila melanogaster, нематода Ceanorhabditis elegans и морская минога Petromyzon marinus. Эти виды используют для исследования молекулярных механизмов болезни Альгеймера, однако только линии трансгенных мышей позволяют моделировать патологии, возникающие при этом заболевании у человека.
Первой успешной моделью стала линия мышей PD-APP, воспроизводящая основные патологические признаки болезни Альцгеймера, такие как образование амилоидных бляшек, астроцитоз и нейритная дистрофия [116]. Мыши этой линии экспрессировали мутантную форму БПА (мутация V717F).
Вторая трансгенная модель Tg2576, экспрессирующая мутантную форму БПА со «шведской» мутацией, получена Hsiao с соавторами [158]. У мышей Tg2576 наблюдались отложения АП пептида, а с 9 месячного возраста развивались нарушения в обучении и поведенческих реакциях. Исследовательская группа фармацевтической корпорации Novartis Pharma создали линию трансгенных мышей APP23 [351], сверхэкспрессирующую БПА со «шведской» мутацией под контролем мышиного промотора Thy-1.2. С 6 месячного возраста у мышей появлялись амилоидные бляшки, которые были иммунореактивны для избыточно-фосфорилированного тау-белка [348]. Стереологический анализ показал снижение числа CA1 пирамидных нейронов у трансгенных мышей на 14% по сравнению с контрольной группой, в то время как число нейронов неокортекса не изменилось [54].
Из инбредной линии FVB/N получены трансгенные линии мышей, сверхэкспрессирующие гены мутантного или дикого типа БПА изоформы 695 человека или мыши (TgFVB/N) [159]. У мышей TgFVB/N развивались различные нарушения ЦНС, главным образом в мозжечке, такие как неофобия и нарушение пространственной ориентации, снижение утилизации глюкозы и астроглиоз (реактивная пролиферация астроцитов). Продолжительность жизни мышей этой линии значительно меньше, чем у контрольных животных, но у данных животных не наблюдается внеклеточных отложений АП. Это свидетельствует о том, что не все патологические процессы, способствующие избыточной экспрессией гена арр, непосредственно связаны с образованием АП. Однако подобные клинические проявления спонтанно возникали у 20% мышей дикого типа в среднем и старческом возрасте, поэтому можно предположить, что сверхэкспрессия гена арр может ускорять естественно происходящие возрастные нарушения в ЦНС у трансгенных мышей линии TgFVB/N.
У трансгенных мышей, генетически модифицированных кДНК APP695/RK (мутантный ген app мыши, сконструированный для изучения нарушений функции -секретазы), наблюдаются тяжелые поведенческие аномалии и преждевременная смерть. Основной причиной преждевременной гибели этих мышей стали обширная нейродегенерация и апоптоз, главным образом в гиппокампе и коре головного мозга [261].
Shoji с соавторами [334] обнаружили возрастное накопление АП у трансгенных мышей A-NOR, экспрессирующих ген, кодирующий 18 а.о. сигнального пептида и 99 а.о. С-концевого фрагмента БПА. Авторы сделали вывод, что избыточный синтез АП приводит к накоплению фибрилл АП, что сопровождается клеточной дегенерацией и активацией макрофагов in vivo.
В случае семейной формы болезни Альцгеймера мутации в генах psen1 и psen2 усиливают токсический эффект АП, увеличивая его продукцию. Для определения влияния пресенилинов на процессинг БПА были созданы трансгенные модели мышей с нокаутом эндогенных генов пресенилинов или экспрессирующие их мутантные формы, либо самостоятельно, либо в сочетании с экспрессией мутантных форм БПА.
Нокаутные мыши по гену psen1 были нежизнеспособны и имели тяжелые дефекты развития, включая существенные нарушения в нейрогенезе [331]. В отличие от psen1-нокаутных мышей, psen2-нокаутные мыши были жизнеспособны, с возрастом у них развивался мягкий фиброз легких и кровоизлияния [149].
У трансгенных мышей, одновременно экспрессирующих мутантные формы PSEN1 (мутация A264E) и БПА, наблюдался более высокий уровень АП в мозге, чем у мышей, одновременно экспрессирующих мутантную форму БПА и дикий тип PSEN1 [31].
Скрещивание трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму PSEN1 (мутация M146L) [54] с трансгенной линией Tg2576 вызывало повышение уровня АП в мозге у потомков [152]. Начиная с 6 месячного возраста у них начиналось отложение амилоидных бляшек.
Wen с соавторами показали, что у трансгенных мышей, экспрессирующих мутантный PSEN1 (мутация P117L), снижены выживаемость стволовых нервных клеток и дифференцировка в новые зрелые нейроны [390, 391]. Также у этой трансгенной линии был повышен уровень продукции АП(1-42), но уровень АПА(1-40) не изменялся. В трансгенных линиях с «шведской» мутацией БПА и мутацией P264L PSEN1 в возрасте 8–18 месяцев понижалось количество стволовых нервных клеток и нейробластов, а также наблюдались отложения АП [415]. Трансгенные мыши линии Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J экспрессирут химерный белок БПА (мышиный/человеческий, Mo/HuAPP695swe) и мутантный человеческий PSEN1 (делеция экзона 9) [118, 172, 282, 357, 378]. Обе мутации ассоциированы с ранней формой болезни Альцгеймера. При двойных мутациях БПА и PS1-dE9, экспрессируемых под промотором прионного белка (PrP), у мышей начиная с 4–6 месячного возраста наблюдается начало отложения -амилоида и в дальнейшем оно увеличивается.
Другая модель болезни Альцгеймера — трансгенные мыши с интегрированным человеческим геном нейротрофического фактора S-100 [393]. Этот фактор высвобождается из астроглиальных клеток, а его ген локализуется на участке 21-й хромосомы, который считается облигатным при синдроме Дауна. Уровень S-100 в головном мозге увеличивается при синдроме Дауна и болезни Альцгеймера. У трансгенных мышей в возрасте 1 года обнаруживается значительная утрата дендритов по сравнению с контрольными животными, а также увеличение количества позитивно окрашиваемых клеток при иммуноцитохимии с использованием антител против связанного с микротрубочками белка 2. У молодых трансгенных мышей была выявлена неспособность к обучению. Авторы предположили, что повышение в головном мозге экспрессии гена нейротрофического фактора S-100 может приводить к ускоренному развитию, сменяющимся ускоренным старением.
Трансгенная линия мышей JNPL3, экспрессирующая мутантный тау-белок (мутация P301), в 10 месячном возрасте характеризуется двигательными и поведенческими расстройствами с развитием нейрофибриллярных клубков [218].
В 2003 году была создана трансгенная модель мышей, экспрессирующая мутантные формы БПА и тау-белка (мутация P301), а также содержащая мутацию в PSEN1 (M146V, экспрессия гена «Knock in») [283]. У этих мышей в мозге были обнаружены амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки.
Поведенческое тестирование трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера
А- картины свечения препаратов, отражающие «загрузку» FM 1-43 на фоне действия АП (25-35) (стимуляция 50 Гц, 1 мин.). Б – «Выгрузка» FM 1-43 из нервных терминалей в контроле (черные квадраты) и на фоне действия АП (25-35, 10-6 М) (белые кружки). В – оценка времени рециклирования синаптических везикул путем совмещения кумулятивной кривой секреции нейромедиатора (m) и кривой относительной потери красителя (F) предварительно загруженными окончаниями при стимуляции 50 Гц. - достоверные различия (P 0.05).
Для оценки экзоцитоза осуществляли загрузку красителя на нативном препарате, затем апплицировали АП(25-35) и через 60 минут от начала аппликации АП(25-35) проводили выгрузку путем высокочастотной стимуляции. На фоне действия АП(25-35) при стимуляции препарата с частотой 50 Гц, наблюдалось экспоненциальное снижение интенсивности свечение нервных терминалей, при этом на 1-4 минутах стимуляции наблюдалась достоверно менее выраженная выгрузка красителя (P 0.05), однако на более поздних сроках стимуляции различия исчезали (n=7) (Рисунок 18Б).
Оценка времени рециклирования синаптических везикул Сопоставление кумулятивной кривой выброса нейромедиатора и динамики потери красителя FM 1-43 показало, что среднее время рециклирования синаптических везикул на фоне действия АП (25-35) составляет более 100 секунд, что выше в сравнении с контролем (Рисунок 18В). Обсуждение результатов
Таким образом, АП(25-35) снижает амплитуду МПКП и ПКП, при этом не оказывает влияния на временные параметры постсинаптических сигналов и квантовый состав ПКП при низкочастотной (0.1 Гц) стимуляции. Возможным обьяснением данного эффекта может быть влияние АП(25-35) на электрогенез и мембранный потенциал скелетных мышечных волокон. АП(25-35) увеличивает выраженность кратковременной депрессии амплитуды ПКП в процессе высокочастотной стимуляции с частотами 10 и 50 Гц, что может свидетельствовать о нарушении процессов рециклирования синаптических везикул в НО.
В экспериментах с флуоресцентным маркером FM 1-43 выявлена успешная (даже усиленная в сравнении с контролем) «загрузка» красителя в НО и некоторое замедление «выгрузки» красителя из НО. Оба феномена могут обьясняться обнаруженным нами возрастанием времени рециклирования синаптических везикул под действием АП, поскольку в этом случае снижается вероятность экзоцитоза содержимого загруженных красителем везикул. Выявленные нарушения могут объясняться снижением активности некоторых пресинаптических белков, участвующих в рециклировании синаптических везикул, например, синапсина 1, через который реализуется подавляющее влияние АП на рециклирование везикул в гиппокампальных синапсах [388].
Таким образом, -амилоидный пептид приводит к снижению эффективности и надежности нервно-мышечной синаптической передачи за счет снижения амплитуды ПКП при низкочастотной (0.1 Гц), усиления кратковременной депрессии амплитуды ПКП при высокочастотной (10, 50 Гц) стимуляции и возрастания времени рециклирования синаптических везикул в НО. Влияние АП на функцию нервно-мышечного синапса может вносить вклад в патогенез болезни Альцгеймера и других НДЗ, сопровождающихся избыточной Электрофизиология Эксперименты проводились на трансгенных APP/PS1 мышах с моделью болезни Альцгеймера 7-8 месячного возраста.
У APP/PS1 трансгенных мышей частота МПКП составила 1,14±0,16 с-1, амплитуда 0,85±0,13 мВ, время нарастания и полуспада МПКП - 0,54±0,07 мс и 1,42±0,12 мс, соответственно (n=10), что достоверно не отличается от таковых параметров у мышей дикого типа того же возраста. Время нарастания и время полуспада ПКП составили 0,47±0,05 мс и 2,014±0,12 мс, соответственно, что не отличается от показателей мышей дикого типа (n=10, P 0.05). При этом квантовый состав ПКП APP/PS1 мышей составил 98,4±17,4, что достоверно меньше в сравнении с мышами дикого типа (n=8, P 0.05)
При высокочастотной стимуляции с частотами 5, 10 и 20 Гц динамика амплитуды ПКП у APP/PS1 мышей достоверно не отличалась от таковой в сравнении с мышами дикого типа (n=8, P 0.05). В то же время, при стимуляции с частотой 50 Гц депрессия амплитуды ПКП была выражена в достоверно большей степени – уже к 60-ой секунде стимуляции амплитуда ПКП достигала 8,7±2,0 % от исходной величины (n=7, p 0.05) (Рисунок 19 А-Г).
Для адекватного сравнения интенсивности процессов эндоцитоза в препаратах мышей дикого типа и APP/PS1 мышей нам необходимо было подобрать такие протоколы высокочастотной стимуляции секреции нейромедиатора, которые вызывают одинаковый выброс нейромедиатора, а следовательно, одинаковое стимулирование эндоцитоза. Построение кумулятивных кривых выброса нейромедиатора в процессе высокочастотной стимуляции на основании электрофизиологических экспериментов показало, что в препаратах APP/PS1 мышей в течение одной минуты стимуляции с частотой 50 Гц освобождается значительно меньшее количество нейромедиатора в сравнении с препаратами дикого типа, подвергнувшимися такой же стимуляции. Нами было установлено, что аналогичное количество квантов нейромедиатора выбрасывается при стимуляции препаратов мышей дикого типа с частотой 10 Гц в течение 45 секунд (Рисунок 19Д).
Нарушение нервно-мышечной синаптической передачи в генетической модели болезни Альцгеймера
В выполненном диссертационном исследовании впервые было проведено комплексное исследование механизмов, лежащих в основе патогенеза нейродегенеративных заболеваний с применением трех моделей на животных: -амилоидной модели нейродегенерации, генетической моделей болезни Альцгеймера на APP/PS1 трансгенных мышах и генетической модели бокового амиотрофического склероза на mSOD1 трансгенных мышах. Установлено, что в моделях болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза помимо патологии головного (или спинного) мозга наблюдается выраженная дисфункция со стороны периферической нервной системы, скелетной и сердечной мышцы, а именно – аксонов мотонейронов, нервно-мышечных синапсов, скелетных мышечных волокон и кардиомиоцитов.
Выявлено, что дисфункция нервно-мышечной синаптической передачи во всех изученных моделях нейродегенерации носит сходный характер и определяется, прежде всего, пресинаптическими нарушениями: снижением квантового состава ПКП и замедлением процессов рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях. Была также выявлена общность в механизмах нарушений электрогенеза скелетных мышечных волокон в разных моделях нейродегенерации, характеризующихся снижением величины мембранного потенциала покоя и активности Na+/K+ насоса плазмолеммы. Данные наблюдения свидетельствуют об общности механизмов нейродегенерации при разных патологиях и могут быть проявлениями таких универсальных патогенетических механизмов нейродегенерации, как окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, энергетический дефицит, нарушение аксонного транспорта, изменения структуры плазматической мембраны клетки и др. [8, 194, 294]. Вероятно, нарушение процессов секреции нейромедиатора и рециклирования синаптических везикул при нейродегенеративных заболеваниях может быть связано с нарушением функций пресинаптических белков, таких как синапсин 1, синаптофизин и др. [8, 294, 388].
Вместе с тем, были выявлены и различия в вовлеченности периферических возбудимых тканей в патологический процесс при нейродегенерации. В частности, сократимость скелетной мышцы in vitro была нарушена только в модели бокового амиотрофического склероза, но не в модели болезни Альцгеймера. Это обьясняется, прежде всего, патогенетическим механизмом самого заболевания, в котором дисфункция системы «мотонейрон-скелетная мышца» является ключевой [194]. Последовательность развития нарушений свидетельствует о том, что дисфункция нервно-мышечной синаптической передачи в модели бокового амиотрофического склероза возникает раньше и вероятно, провоцирует/способствует развитию сократительной дисфункции скелетной мышцы; данное наблюдение является еще одним доказательством «нисходящей теории» патогенеза бокового амиотрофического склероза» [194].
Очевидно, ключевым звеном патогенеза болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза и других НДЗ являются центральные механизмы, которые включают в себя дисфункцию центральных синапсов и локальных нейронных сетей, дегенерацию определенных областей мозга и популяций нейронов [9, 194, 294]. Выявленные нами дисфункции периферических возбудимых структур и тканей являются, прежде всего, отражением центральных механизмов. Вместе с тем, дисфункция нервно-мышечной синаптической передачи, скелетной и сердечной мышц будет усиливать, способствовать прогрессировать развитию нейродегенеративного заболевания организма, ухудшая состояние системы в целом. Поэтому необходимо учитывать наличие периферических дисфункций при нейродегенеративных заболеваний как важный, неучтенный ранее аспект патогенеза данных недугов. Зачастую периферические дисфункции становятся непосредственными причинами инвалидизации и смерти: атрофия и паралич скелетных мышц, инфаркт миокарда и т.д. В частности, нами впервые было установлено выраженное нарушение автономной регуляции сократимости миокарда в генетической модели болезни Альцгеймера. На фоне общего ухудшения психо-эмоционального состояния пациента при деменции проблемы с периферическими органами (сердечно-сосудистой, скелетно-мышечной систем) остаются незамеченными и недиагностированными.
Важным аспектом проведенного исследования явилась разработка и оценка эффективности генно-клеточных подходов для коррекции нарушенных функций организма при нейродегенеративных заболеваниях. Нами были применены генно-клеточные конструкции на основе мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансдуцированных аденовирусными векторами, экспрессирующими EGFP, VEGF или GDNF. Мы выяснили, что генно-клеточная терапия мононуклеарами пуповинной крови, экспрессирующими VEGF или GDNF значительно улучшает двигательную, исследовательскую активность, а также выживаемость трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофичского склероза. В отношении трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера научший терапевтический эффект был достигнут в результате применения мононуклеарных клеток пуповинной крови, экспрессирующих EGFP или GDNF. Данные конструкции улучшали параметры пространственной памяти, а также стимулировали процессы нейрогенеза и синаптогенеза в гиппокампе – наиболее страдающего участка мозга при болезни Альцгеймера. Терапевтические эффекты вышеуказанных генно-клеточных конструкций, очевидно, обьясняются улучшением функций межнейронных синапсов, локальных нейронных сетей у больных животных под действием трансплантированных клеток и секретируемых ими нейротрофических факторов. Воздействуя на центральные патогенетические механизмы нейродегенеративных заболеваний, можно ожидать терапевтический эффект, корректирующий нарушенные функции не только на уровне ЦНС, но и на уровне периферической нервной системы, нервно-мышечного синапса, скелетной и сердечной мышцы. В частности, у mSOD1 трансгенных мышей после трансплантации МКПК наблюдалось улучшение параметров двигательной активности, силы хватки и выживаемости.