Введение к работе
Актуальность проблемы: Развитие многоклеточного организма и его существование как единой системы обусловлено взаимосвязью между клетками, которая осуществляется с помощью сигнальных молекул различной природы. Воздействие медиаторов и гормонов эффекторная клетка воспринимает через рецепторы, которые трансформируют полученную информацию в адекватную ответную реакцию. Поэтому изучение функциональных свойств рецепторов: их количества и чувствительности к биологическим регуляторам, представляет несомненный интерес для физиологов, биохимиков, фармакологов и клиницистов (Турпаев, 1962; Манухин, 1968; Бузннков, 1987; Авдонин, Ткачук, 1994). Мембранные рецепторы являются типичными интегральными белками, свойства которых зависят от липидиого окружения и состояния структурных компонентов плазматических мембран (Fraser, 1995). Следовательно, мембраноактивные факторы могут быть хорошим инструментом для изучения закономерностей и механизмов локальной регуляции рецепторных систем (Kowatch, Roth, 1994; Williams etal., 1995).
Ранее в физиологических опытах было показано,' что высокая температура и фосфолнпазы оказывают модулирующее влияние на холннергическую и адренергическую реакции (Манухин и др., 1987; Кичикулова и др., 1988). Поскольку величина физиологического ответа зависит не только от функционального состояния рецепторов, но и последующих этапов реализации медиаторной реакции, особое значение приобретает изучение взаимодействия лнганда со специфическим рецептором на мембранном и клеточном уровнях.
Для исследования активности мембранных рецепторов применяют радиолигандный анализ, который позволяет определить истинное количество рецепторов и константу диссоциации лиганд-рецепторного комплекса в норме, а также оценить изменения этих показателей при экспериментальных воздействиях. Основываясь на концепции общего ответа организма на внешнее воздействие, сопровождающегося как нейро-гуморальными, так и клеточными изменениями, в качестве "модельных" систем в последние годы широко используют клетки периферической крови (Красникова и др., 1993). Это позволяет получить прижизненную информацию о состоянии рецепторного, аппарата в норме, при различных заболеваниях, экспериментальных воздействиях на организм, а также исследовать влияние различных факторов, изменяющих состав и физико-химические свойства мембран in vitro.
Несомненно, из'уче.іие закономерностей лиганд-рецеиторного взаимодействия на клеточном н субклеточном уровнях будет способствовать более глубокому пониманию биологических и медицинских проблем, таких как изменение рецепторной активности в процессе эмбриогенеза, при старении, нарушениях обмена веществ, различных заболеваниях, что необходимо для диагностики и эффективного подбора лекарственных препаратов.
Цель и задачи работы: Исследование общих закономерностей связывания специфических блокаторов с 0-адрено- , и М-холино-рецеиторами, а также модулирующего действия мембраноактивных факторов на активность рецепторов. Были поставлены следующие задачи:
1) Установить количественные закономерности связывания
специфических блокаторов с (9-адрено- и М-холинорецепторами
эритроцитов и синаптосомальных мембран коры мозга крыс.
-
Исследовать влияние фосфолипаз Аз и С на активность 0-адре-норецепторов эритроцитов и М-холинорецепторов синаптосомальных мембран коры мозга крыс.
-
Изучить действие высокой температуры на функциональные свойства /3-адренорецепторов эритроцитов крыс.
-
Исследовать влияние гипертермии на активность М-холшю-рецеиторов синаптосомальных мембран коры мозга крыс.
Научная новизна и практическая значимость работы: В работе предложен новый метод анализа результатов лиганд-рецепторного взаимодействия, основанный на предположении существования нескольких пулов рецепторов и присоединения одной или нескольких молекул лнгавда к рецептору. С помощью раднолигандного анализа взаимодействия специфических антагонистов с /3-адренорецепторами мембран, "теней" и нативных эритроцитов, а также с /3-адрено- и М-холинореценторами синаптосомальных мембран коры мозга крыс впервые показано, что исследованные рецепторы присоединяют но две молекулы лиганда и представлены двумя пулами - высоко- и низкоаффинным.
. Установлено, что действие фосфолипаз и высокой температуры приводит к изменению свойств обоих пулов рецепторов. Фосфолиназа С вызывает уменьшение количества /3-адренорецепторов эритроцитов, при этом сродство рецепторов высокоаффннного пула к лигапду не изменяется, а ннзкоаффинного - увеличивается. На синаптосомальных мембранах коры мозга крыс обнаружено дозозавнспмое снижение количества М-холпнорецепторов в результате гидролиза фосфолнпидов фосфолнпа.юп А-2. После действия высокой температуры на изолированные эритроциты крыс показано уменьшение количества /3-
адренорецепторов. Впервые обнаружено различное изменение свойств
высоко- и низкоаффннного пулов М-холинорецептрров коры мозга
после гипертермии крыс: количество рецепторов высокоаффинного пула
снижается без изменения константы диссоциации, а количество
рецепторов низкоаффинного пула повышается, при этом уменьшается их
чувствительность к лиганду. -
Практическое значение работы состоит в возможности применения полученных результатов в фармакологии и клинической медицине для количественной оценки функционального состояния холинергической и адренергнческои систем. Изолированные клетки крови могут быть использованы для скрининга фармакологических препаратов, направленно действующих на рецепторы определенного типа: Использование предложенного метода анализа результатов лнганд-рецепторного взаимодействия дает новую информацию об активности рецепторов и механизмах их локальной регуляции.
Апробация работы: Основные материалы диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории межклеточных взаимодействий и научных конференциях ИБР им.Н.К.Кольцова РАН (1994-1996г); на международном симпозиуме "Thermoregulation and Temperature Adaptation" Минск, 1995 г. По материалам- диссертации опубликовано 6 статей, одна находится в печати.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, иллюстрирована 36 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав изложения собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 325 источников.