Кальций-зависимые механизмы реакций коры головного мозга на гипоксию Семенов, Дмитрий Германович

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ. Нарушение кислородного снабжения мозга независимо от его формы и генеза яшіяется ведущим нейропатологи-ческим фактором и конечным звеном в причинно-следственной цепи большинства тяжелых заболеваний. Изучение механизмов гипокси-чесого повреждения мозга и возможностей его предотвращения было и остается актуальной задачей нейробиологии и медицины.

Несмотря на длительную историю изучения пшоксических состояний мозга, лишь в последнее десятилетие появилась реальная возможность вскрытия глубинных молекулярных механизмов повреждения нейронов при гипоксии благодаря бурному развитию исследований на молекулярно-клеточном уровне с использованием современных электрофизиологических, нейрохимических, биофизических и генетических методик. Поэтому исследования воздействия гипоксии на клетки мозга, проведенные с учетом последних достижений молекулярной биологии, приобретают особую актуальность.

Новые методические возможности изучения функций и метаболизма нейронов на молекулярном уровне потребовали применения относительно простых биологических моделей in vitro. В результате нередко возникаюттрудности, а иногда и противоречия при сопоставлении концепций, развиваемых на базе исследований таких моделей, с классическими представлениями, основанными і іа многолетних исследованиях мозга в условиях in vivo. В этом плане актуальность настоящей работы заключается еще и в том, что она позволяет сопоставить, а в некоторых разделах и синхронизировать, исследования пшоксических реакций на организменном и молекулярно-клеточном уровнях.

В последнее десятилетие огромное внимание исследователей привлекают кальций-зависимые механизмы, обеспечивающие широкий спектр сложнейших реакций нервной клетки, связанных с регуляцией ее метаболизма, формированием и поддержанием структуры, трансдукцией химических и биоэлектрических сигналов, синаптической пластичностью, формированием элементарных процессов обучения и памяти. Особое место в этом ряду занимают исследованияния кальций-зависимых механизмов реагирования нейронов мозга на гипоксию (Hansen, 1982; Peters, 1986; Choi,

1988. 1995; Mayer. Miller. 1990; Kluge, 1991; Siesjo. 1981. 1994: Sicsjo. Bengtsson, 1989; Kristian. Siesjo. 1996. 1997; Косткж. 1997 и ми. др.). Несмотря на интенсивное изучение этой проблемы, большинство исследователей сосредоточивают свое внимание на патогенных эффектах нарушения проницаемости мембран нейронов для внеклеточного Са²⁺ (Са²⁺_сх), вызванных относительно длптельнымдействи-ем гипоксии/ишемии. Вместе с тем, наиболее ранние реакции нейронов на гипоксию а также постгипоксические процессы, протекающие с вовлечением внутриклеточных пулов связанного кальция (Са-с) и роль этих пулов в механизмах клеточной адаптации и повреждения мало изучены. В этом плане настоящая работа относится к немногочисленным, но актуальным современным исследованиям, показывающим ключевую роль кальциевой внутриклеточной регуляторной системы (ВРС) в инициации как патогенных (Самойлов, 1985; Fasolato et al., 1994; Belousov et al.. 1995; Kaplin et al., 1996), так и адаптивных (Самойлов, 1995; Самойлов, Мокру-шин, 1999) реакций нервных клеток на гипоксию.

Для борьбы с повреждающим действием гипоксии на мозг фармакологами предложен огромный арсенал медикаментозных средств - антигипоксантов, обладающих различными специфическими свойствами, повышающими резистентность организма к кислородному голоданию и облегчающими постгипоксическую нормализацию метаболизма и функций. Особое внимание уделяется средствам, препятствующим нарушению гомеостаза Са²⁺ в нейронах. В связи с этим класс кальциевых антагонистов (блока-торы входа Са²⁺ и «кальциевой перегрузки», модуляторы Са²⁺-свя-зывающих белков и др.) интенсивно исследуется и пополняется. Одним из ведущих Са^2н-опосредованных механизмов необратимого повреждения нейронов, вызванного гипоксией, является нерекисное окисление липидов и белков. Для предупреждения (подавления) этих патологических явлений используют препараты антиоксидативного действия (Жданов и др., 1989; ВопГосо et al., 1995 и др.). Замечено, чтоантигипоксанты, относящиеся к различным классам фармакологических препаратов, нередко обладают единым неспецифическим эффектом па механизмы клеточного адаптогенеза. В некоторых классификациях такие препараты выделяются в отдельную группу антигипоксантов неспецифического нейротропного действия (Лукьянова. 1987). Определение

роли внутриклеточных регулятррныхсистем в механизмах этого явления, которые до настоящего времени мало изучены, актуально для разработки новых фармакологических средств и тактики фармакотерапии, повышающей резистентность мозга человека к гипоксии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы -изучение роли Са²" в индукции и формировании адаптивных и патологических реакций коры головного мозга, вызванных временным прекращением кислородного снабжения. Основные задачи исследования:

1. Изучить динамику фоновой биоэлектрической активности нейронов коры мозга во время и в течение десятков минут после аноксии различной длительности в экспериментах in vivo.

2. Выявить в этих условиях закономерности изменения активности кальциевой ВРС, характеризуемой динамикой содержания Са-с, и установить их связь с изменениями биоэлектрической активности нейронов.

3. Оценить влияние аноксии различной длительности на Са² '-зависимые механизмы глутамат- и холинергической передачи сигналов в коре мозга.

4. Провести сравнительное исследование роли Са²⁺-зависимых механизмов в формировании нейропротектирующего действия гипок-сического стресса (прекондиционирующая аноксия) и представителей разных классов антигипоксантов (оксиметацил, флунаризин).

5. В экспериментах in vitro на срезах обонятельной коры мозга изучить динамику содержания Са-с и свободного внутриклеточного кальция (Са²⁺_|п) во время и после аноксии различной длительности. Оценить вовлечение NMDA рецепторов в процессы изменения внутриклеточного кальциевого гомеостаза в этих условиях.

6. На этой же экспериментальной модели изучить особенности протекции кальциевой ВРС в условиях аноксического преконди-иионнрования.

7. Исследовать эффекты нейромодуляторных факторов, выделяемых срезами-донорами, пережившими кратковременную анок-сию (КА). на состояние кальциевой ВРС срезов-реципиентов - ин-тактных и подвергнутых долговременной аноксии (ДА).

8. Кальций-зависимые процессы вовлекаются в приспособительные реакции нейронов мозга на КА, проявляясь в стойком умеренном повышении активности кальциевой ВРС. Вместе с тем. кальциевые механизмы лежат и в основе повреждающего воздействия ДА и выражаются длительной гиперактивацией ВРС.

9. Инициация сложной цепи реакций на аноксию связана с мобилизацией внутриклеточного связанного кальция. При усилении гипоксического воздействия добавляется фактор резкого повышения проницаемости плазмолеммы для Са²⁺_сх. При реоксиге-нации после КА и ДА в устойчивое изменение кальциевого гомеос-таза вносят вклад как Са-с, так и Са²⁺_ех. Важную роль в этих процессах играет модификация активности глутаматных рецепторов.

10. Аноксические воздействия различной продолжительности вызывают характерные изменения активности Са^-зависимых механизмов холин- и глутаматергической сигнальной трансдукции.

11. Протектирующий эффект фармакологических средств анти-гипоксического действия (антиоксиданты, кальциевые антагонисты) и прекондиционирующей КА связан с умеренной активацией кальциевой и фосфоинозитидной регуляториых систем клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые в условиях in vivo и in vitro установлена и проанализирована динамика содержания Са-с в коре головного мозга млекопитающих на различных этапах аноксии и в раннем периоде постаноксического восстановления. Использование комплексного методического подхода в экспериментах in situ позволило совместить изучение этих процессов с анализом динамики импульсной активности нейронов коры и сопоставить полученные данные с динамикой ряда функциональных и метаболических показателей органного и организменного уровней, определяемых в тех же экспериментальных условиях.

Установлена ведущая роль пула Са-с в индукции комплекса Са²⁺-опосредованных внутриклеточных метаболических реакций, развивающихся в нейронах в пределах 5 мин аноксии и в течение 60 мин реоксигеиаиии in situ. В этих экспериментах исследовано вызванное КА (до 2.5 мин) явление постанокспческой гиперактивации нейронов коры мозга в сопоставлении с динамикой активности кальциевой ВРС. Показано, что в основе постанокспческой

гиперактиваиии лежит усиление Са²*-опосредованных процессов глутаматергической сигнальной трансдукции.

Установлена важная роль умеренной активации кальциевой и связанной с ней фосфоинозитидной ВРС в молекулярно-клеточ-ных механизмах антигипоксической протекции коры мозга, инициируемых как антигипоксантами (флунаризин, оксиметацил), так и превентивной КА. Определены оптимальные условия для реализации Са^:'-зависимых реакций клеточного адаптогенеза, индуцируемого указанными нейропротектирующими средствами.

В модельных экспериментах на срезах коры головного мозга впервые проведено параллельное синхронизированное измерение динамики содержания Са-с и Са²⁺._п во время и после аноксии различной длительности. Установлено, что КА (2 мин) создает длительную умеренную активацию кальциевой ВРС в постаноксическом периоде, выражающуюся в небольшом повышении содержания внутриклеточного Са²⁺ как связанного, так и свободного. Важную роль в этой активации играют NMDA рецепторы. В то же время ДА(10 мни) инициирует гиперактивацию ВРС, которая сопровождается мощным NMDA-опосредованным входом Са²⁺_сх во время и после ДА. На самых ранних этапах реоксигенации рост содержания Са²⁺_т может сдерживаться внутриклеточными системами кальциевого гомеостаза, но после 20-30 мин накопление Ca^2f_in возобновляется.

В экспериментах in vitro установлен новый факт, свидетельствующий о том, что нейромодуляторные факторы (НМФ), выделяемые после КА срезом-донором в перфузат в период умеренной адап-тогенной активации его ВРС, способны вызывать в интактном срезе-реципиенте идентичную активацию. Протектирующий эффект этих факторов, как и самой превентивной КА, проявляется в предотвращении патогенной гиперактивации ВРС в срезе-реципиенте, подвергнутом ДА.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Продемонстрированные в работе закономерности изменения активности кальциевой ВРС и связанная с ними динамика биоэлектрической активности коры мозга животного, подвергнутого аноксии различной длительности, выявляют ключевую роль внутриклеточных Са²* -зависимых процессов в индукции и формировании широкого спектра реакций нейронов, вызванных нарушением их кислород-

ного снабжения. Эти данные, наряду с результатами, раскрывающими Са²'-зависимые неспецифические механизмы адаптации мозга к гипоксии, инициируемые на молекулярно-клеточно.м уровне фармакологическими и немедикаментозными средствами, вносят вклад в решение крупной научной проблемы определения роли внутриклеточного Са²⁺ и Са²⁺-зависимых процессов в развитии адаптивных и патологических состояний мозга. Выявленные механизмы и условия реализации протектируюших антигипоксических эффектов примененных фармакологических препаратов и анокси-ческого ирекондиционирования могут найти применение в сфере практической медицины (реаниматология, нейро- и психопатология, травматология и др.), в профилактических направлениях спортивной и военной медицины, а также во многих сферах человеческой Деятельности, связанных с высокой вероятностью экстремальных ситуаций, приводящих к гипоксии мозга (подводные и высокогорные работы, авиация, космонавтика, работы в очагах природных и техногенных катастроф и др.).

Развиваемые в работе теоретические представления о механизмах реагирования нейронов мозга на кислородное голодание могут найти практическую реализацию в учебных процессах медицинских и биологических высших учебных заведений.

Методические разработки и усовершенствования, описанные в работе, опубликованные и оформленные автором в виде изобретений и рационализаторских предложений, могут найти применение в экспериментальной практике микрофизиологических и биохимических исследований мозга in vivo и in vitro.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на 13-ом Всесоюзном съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Алма-Ата, 1979), 1-ом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); на Всесоюзных и Всероссийских конференциях, симпозиумах: "Аппаратура и методы количественной микроскопии" (Ленинград, 1980), "Применение контактной микроскопии в биологии и медицине" (Москва, 1981), "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пушино. 1990), "Токсикологические проблемы химических катастроф" (Ленинград, 1991), "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991),"Антигипоксанты и актопротекторы" (С.-Петербург, 1994), "Молекулярно-клеточные и генетические механизмы адаптивного

поведения" (С-Петербург, 1994), "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1997); на 10-м и 13-м международных Конгрессах Европейской Нейрологической Ассоциации (Стокгольм, 1986, 1990), 1-ом Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991), 33-м Всемирном Конгрессе физиологических наук (С.-Петербург, 1997); международных конференциях, симпозиумах "Физиологические и биохимические основы активности мозга" (С.-Петербург, 1994), "Контактная и конфокальная микроскопическая техника" (Варшава, 1996), "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (С.-Петербург, 1997), "Экспериментальная и клиническая патофизиология" (Варшава, 1997), "Гипоксия в медицине" (Москва, 1998, 1999); на заседаниях отдела нейрохимии Медицинского Исследовательского Центра ПАН (Варшава, 1996, 1997, 1998) и отдела физиологии и патологии высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (С.-Петербург, 1999).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 53 научные работы в отечественной и зарубежной печати, среди них глава в коллективной монографии и 2 изобретения.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографии. Диссертация изложена на 320 стр. печатного текста, иллюстрирована 85 рисунками. Библиография включает 81 русский и 236 иностранных источников.

Основная часть работы in vivo выполнена на 223 кошках самцах весом 3-3.5 кг. Животные были легко наркотизированы нембуталом, обездвижены трикураном и переведены на искусственное дыхание. Основным методическим подходом in vivo являлось совмещенное определение параметров биоэлектрической активности нейронов коры мозга и динамики содержания в ней внутриклеточного связанного кальция (Са-с). Биоэлектрическую активность нейронов коры мозга характеризовали главным образом частотой спонтанной спайковой импульсации, регистрируемой стандартными электрофизиологическими методами с помощью металлических микроэлектродов (Samoilov et al., 1992; Семенов,

Ермолин, 1994). В ряде экспериментов применяли регистрацию
суммарной фоновой активности сенсомоторной области коры
(ЭКоГ) и прямого коркового ответа на афферентную электрости-
муляцию. Динамику содержания Са-с її различных эксперименталь
ных условиях определяли спектрофлуориметрическим методом
в микроучастках специально изготовляемого живого препарата
коры мозга (Самойлов, Семенов. 1978) с помощью хлортетрацик-
линовойфлуоресцентной пробы, используя контактный микроскоп
ЛЮМАМ-КФ (ЛОМО, СПб) (Самойлов и др., 1984; Семенов.
Ермолин, 1993,1994). В качестве дополнительного методического
приема, предназначенного для определения проницемости гемато-
энцефалического барьера, внутрикоркового содержания Са²⁺ и сво
бодных аминокислот в ходе опытов in vivo, применяли внутрикор-
ковую микродиализную перфузию коры мозга с последующим флу-
ориметрическим, радиологическим или хроматографическим ана
лизом диализата, соответственно (Ungerstedt, 1984; Lazarewicz et
al., 1986). Помимо указанных методик исследования мозга приме
няли некоторые стандартные методические приемы оценки функ
ционального состояния подопытного животного на организменном
уровне с использованием соответствующих лабораторных проце
дур и оборудования. - . .

Исследования in vitro проведены на инкубируемых срезах обонятельной коры мозга 92 крыс самцов линии Вистар-Киото весом 180-220 г. Срезы толщиной 300-400 мкм инкубировали в искусственной среде следующего состава (в мМ): NaCl-124, К.С1-5, СаС1₂-2.6, MgS0₄-1.2, К₂НР0₄-1.24, -NaHCO.-З, глюкоза-10, трис-НС1-23; температура 37С, рН-7.4 (Митюшов и др., 1986). Для определения содержания Са-с применяли модифицированную для условий in vitro микрофлуориметрическую методику с использованием маркера хлортетрациклина (Семенов и др.. 1999). Содержание Ca²⁺inопределяли наспектрофлуориметре HITACHI F-2000(Токіо) с помощью флуоресцентного маркера fu га - 2 (Zielonka et al.. 1996). Проникновение Са²⁴ из экстраклеточной среды, опосредованное активацией NMDA-ассошшрованных кальциевых каналов, оценивали, используя неконкурентный антагонист NMDA рецепторов -МК-801. В экспериментах in vitro, с целью повышения корректности контрольных измерений, использованы перфузионные камеры, сконструированные автором, рассчитанные на одновременную

(но независимую по режиму) инкубацию двух срезов одного мозга и их параллельную спектрофлуориметрию (Семенов, 1999).

Большинство экспериментов in vivo и in vitro было выполнено по единой схеме: 1 -измерения контрольных уровней определяемых биоэлектрических и/или метаболических параметров и динамики их спонтанного дрейфа; 2 -регистрация их изменений в ответ па определенные кондиционирующие воздействия (агонисты или антагонисты рецепторов, антигипоксанты, кратковременная анок-сия и др.); 3 -мониторинг этих параметров и реакций в условиях аноксии различной длительности и в течение 1-2 часов соответствующих псриолов реоксигенации на фоне или вследствие кондиционирующих воздействий и/или без них. В экспериментах in vivo анок-сию создавали путем временного (на 1-5 мин) отключения искусственного дыхания иммобилизированного животного; на срезах коры аноксию моделировали временной заменой (на 2 или 10 мин) кисло-род-содержаших жидкой и газовой инкубационных сред на азот-со-де'ржащие. Все данные обрабатывали статистически, используя стандартные пакеты компьютерных программ: STATGRAPH, SIGMAPLOT, SIGMASTAT и программы математической обработки, инсталлированные в соответствующие аналитические приборы.