Эффекты дельта-сон индуцирующего пептида при гипоксии мозга Мационис, Александр Эдуардович

Введение к работе

Актуальность исследовании.

Данные последнего времени свидетельствуют, что взаимодействия ыелсду нервными клетками не ограничиваются лшаптическими связями и что огромную роль в этом нгра-от процессы регуляции и ауторегуляции на про- и постси-іаптическом уровнях. В зтой связи отмечается повышений интерес к изучению эффектов регуляторных пептидов, который связан с перспективой их практического использования в медицине для коррекции функциональных сдвигов і центральной нервной системе при действии экстремальных факторов среды и некоторых патологических состоя-шії. Отличительной особенностью этих соединений является их способность регулировать сразу несколько функций )рганизма одновременно. В результате многочисленных исследований гффектов и механизмов действия регуляторных юпгидов была сформулирована концепция о регуляторном ієнтпдном континиуме (И. П. Ашмарнн, 1986; И. П. Ашма-лш, М. А. Каменская, 1988). Биологические зффекты этих 5еществ уникальны: они влияют на память, обучение, но-ісденне, эмоциональный статус организма, путем измене-шя функционального состояния различных цейромедна-ерных систем на рецепторпом н метаболическом уровне.

Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), который и іастоящее время относят к группе регуляторных нейропеп-'идов, был выделен в 1964 г. в лаборатории Монье и Шонен->ергера как фактор гуморальной передачи сна (Monnier -1 al., 1963). При введении отого нанопептида в электрокор-чікограмме реципиента регистрируется появление дельта-шлновой активности, характерной для медленноволновой разы сна, однако поведенческий сон при этом отсутствует. Зальнейшие исследования позволили выявить целый спектр їсихофармакологическпх свойств у ДСИПа, среди которых штнетрессориые, хронобнологические и ряд других (Graf. , 1988; Graf Kaslin, 1989).

По современным представлениям ДСИП относится к ти-шчным нейромодуляторам, то есть к пептидам, реализующим свое действие через классические нейромедиаторные системы. Одним из интереснейших эффектов ДСИП являет-:я его способность к пролонгированному действию, по-види-

MOisiy, опосредованному через адренсргическне механизмы. Введенный однократно в дозе 120 ыг/кг, пептид обнаруживает свои эффекты через одни, трое, семь суток (Т. И.Бондаренко п солвт., 1986; А. М. Менджерпцкий и соавт., 1990; Г. А. Курае; и соавт., 1991). Имеются данные о его действии на адрснерпіческую и сєротонпнеріическую системы (Е. Л. Доведова, 1989; Gr;if, К а > 1 і п, 1989). Исследования, проведенные к нлшеіі лаборатории, показали модуляцию пептидом активности системы ГАМК — основноіі тор-мозноіі системы 1JНС (А. М. Менджерпцкий п соавт., 1987, 1991, 1992).

Изменения, происходящие в неііромедпаторньїх системах под влиянием ДСИП, должны сопровождаться соответствующими изменениями ультраструктуры спнантического аппарата. Однако наблюдемый модуляторный эффект пептида находится в пределах физиологической нормы, вероятно, в связи с этим проведенный нами ранее визуальный анализ не дал конкретных доказательств альтерации структуры синапсов под влиянием ДСИП (Г. А. Кураев и соавт. 1991).

Наиболее эффективно модулирующие свойства ДСИП реализуются на фоне стрессорных состояний. Наблюдается повышение устойчивости организма к разнообразным видам стресса — смоцпоналыго-белсвому, холодовому, гипокинетическому, иммобнлизащюшюму (Е. В. Коплик и соавт., 1982; Е. 10. Крупешшкова п есавт., 1986; Ф. 3. Меер сон, 1986; А. М. Менджерпцкий с соавт., 1992).

В нашей работе в качестве экспериментального воздействия выбрана гнпокенческая гипоксия, что обусловлено в первую очередь актуальностью зтой проблемы для клинической медицины. Необходимо отметить, что вряд ли есть друюе столь универсальное, тщательно иеученное и нуждающееся в дальнейшем глубоком исследовании пзтологическоэ состояние, как гипоксия мозга. Возможность использования адаптогениых свойств ДСИП для повышения устойчивости ткани мозга к кислородному голоданию представляется весьма перспективной с позиций таких областей практической медицины, как невропатология, анестезиология, нейрохирургия, реаниматология.

Цель її задачи исследования.

В этой связи в настоящей работе была поставлена цель — с помощью комплекса морфологических и биохимических методов изучить механизмы модулирующего действия ДСИП на синаптический аппарат неокортекса в норме и в условиях гппоксической гипоксии.

Конкретными задачами работы являлись:

1. Исследование ультраструктуры III—V слоев сенсомо-ториой коры головною мозга крыс черев 4 часа после впу-трибрюшинного введения 120мг,кг массы ДСИП и морфоме-трическая оценка ультраструктуры аксосоматнческих и ак-сошипиковых синапсов.

2. Изучение системы ГАМК — глутаматдекарооксилаза (ГДК) — глутаминовая кислота через 1 час и 4 часа после зведення 120 мг/кг массы ДСИП крысам.

3. Изучение активности Ю , \^та '<-—АТРазы и Са + +— АТРазы через 4 часа после введения 120 мг кг массы ДСИП крысам в коре больших полушарий.

4. Исследование ультраструктуры III—V слоев сенсомо-торной коры головного мозга крыс в условиях гшюкепчес-кей гипоксии (0,029 МПа, 9000 м н. у. м., 3 часа) и при гн-ИСКСІШ на фоне предварительного введения ДСИП в дозе 120 мг/кг массы с морфометрической оценкой ультраструктуры аксосоматнческих и аксошипиковых синапсов.

5. Изучение системы ГАМК — глутаматдекарооксилаза (ГДК) —глутаминовая кислота в условиях гппоксической гипоксии и при гипоксии на фоне введения 120 мгкг массы ДСИП крысам.

6. Игученис активности К-⁴-, Nat—АТРазы и Са+ + — АТРазы при гппоксической гипоксии и при гипоксии на фоне введения 120 мг/кг массы ДСИП крысам в митохон-дрналъноп и синаптической фракциях коры больших полушарий.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований впервые установлено, что модулирующее действие ДСІІІІ на центральную нервную систему сопровождается изменениями ультраструктуры тормозных и возбуждающих спнаптических контактов. Впервые проведена не только качественная, но и количественная оценка выявленных ультраструктурных из-

менений аксосоматических синапсов в ответ на введение ДСИП.

Нами впервые показано, что ДСИП является модулятором спнаптической трансмиссии, поскольку в норме его действие зависит от функциональной принадлежности си-наптического контакта: пептид повышает эффективность тормозных аксосоматических синапсов, способствует их дополнительной знергнзации, в возбуждающих синапсах происходит накопление общих синаптическнх везикул, однако эффективность спнаптической передачи, судя по количеству активных синаптическнх везикул и сужению спнаптической щели, падает. Количественная оценка стшаптпческого покрытия пирамидных нейронов глубоких слоев коры показала увеличение этого параметра в ответ на введение ДСИП. Показано, что одновременно с изменениями ультраструктуры синапсов снижается активность Са + +—, К + , Na + — АТРаз. Результаты морфометрического исследования синапсов коррелируют с полученными данными, свидетельствующими о накоплении в коре тормозного ненромедиатора ЦНС — ГАМК и падении уровня возбуждающего ненромедиатора — глутамшювоп кислоты через 4 часа после введения ДСИП.

Показано, что предварительное введение ДСИП нормализует большинство исследованных параметров тормозных it возбуждающих синаптическнх контактов коры, способствует расвитию на электронномикроскопнческом уровне адаптивных изменений в нервных и глиальных клетках, микроцнркуляторном русле и нейропиле при гипокепчес-кой гипоксии.

Показано, что введение ДСИП за 1 час до помещения животных в барокамеру приводит в результате к снижению активности как Са + 4-, так и К+, Na + +—АТРаз, в то время как сама гипоксия активирует К+, Na + —АТРазу и незначительно снижает активность Са+ +—АТРазы.

Установлено, что предварительное введение ДСИП способствует снижению уровня тормозного медиатора ЦНС — ГАМК, количество которого при гипоксии повышается более, чем в два раза и нормализует содержание возбуждающего нейромедиатора — глутаминовой кислоты, что свидетельствует о поддержании баланса между тормозным и возбуждающим нейромедиатором в условиях гипоксии при введении ДСИП.

Сопоставление результатов изучения влияния ДСИП иа развитие метаболических и ультраструктурных гнпоксиче-ских повреждений мозга позволяет заключить, что введение пептида мобилизует механизмы, обеспечивающие сохранение «нормального» физиологического уровня спнап-тнческой регуляции в условиях экстремальных воздействий.

Основные поло ж е и и я, вынос и лі ы є на з а-

щпт у:

7. ДСИП является модулятором сштптической передачи, так как изменяет наиболее существенные параметры ультраструктуры двух функционально различных типов епнапшческнх контактов коры — его действие способствует снижению активности аксошипиковых синапсов и активирует аксосоматические синапсы, что свидетельствует о развитии торможения в ЦНС.

8. Введение ДСИП уменьшает активность Na+, К + — и С;Н- +АТРаз в мозге, что приводит к стабилизации ионных трансмембранных токов и, следовательно, к стабилизации функционального состояния пре- и постсинаптнческпх структур мозга.

9. Ультраструктурная активация н увеличение числа активных аксосоматпческих спнаптических структур при введении ДСИП коррелирует во времени с увеличением содержания тормозного нейромедиатора ГАМК.

L Предварительное введение ДСИП регулирует развитие метаболпческих сдвигов в системе тормозного нейромедиатора ГАМК, препятствует активации Nat-, К+ и Са+ь АТРаз, а также предотвращает некоторые лопрелсдения ультраструктуры, определяя адаптивный характер изменений в мозге при гипоксии.

Теоретическая и практическая значимость работы,

В работе получены данные, свидетельствующие о модулирующем эффекте ДСИП на функциональное состояние различных типов синапсов сенсомоторнои коры. Причем ото модулирующее действие в условиях гипоксии имеет адаптивный характер. Адаптивная перестройка спнаптических структур, обусловленная введением ДСИП, сопровождается язіиененнем активности транспортных АТРаз, опре-

делающих интенсивность ионных потоков в синаптнческих образованиях, и функционального состояния тормозной системы мозга, поддерживая адаптивный характер баланса ГАМК/глутаминовая кислота в мозге.

Полученные в работе данные имеют практическое значение в связи с актуальностью проблемы гипоксии и ишемии мозга для клинической медицины. Современные специализированные области клинической медицины — невропатология, нейрохирургия, анестезиология, реаниматология и другие — нуждаются в глубоком исследовании структурных и молекулярных основ повреждения центральной нервной системы при кислородном голодании.

Ресультаты настоящего исследования указывают на перспективность использования ДСИП в клинической медицинской практике в качестве препарата, способствующего повышению адаптивных возможностей ЦНС в условиях гипоксии, тем более, что по ряду показателей ДСИП уже рекомендован Фармкомитетом Минздрава России в качестве лекарственного препарата.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались па Рабочем совещании по нейропептидам (Ростов-на-Дону, 1991 г.) на X Международной конференции по неирокибернетнке (Ростов-на-Дону, 1992 г.), на заседании Российского общества патологоанатомов (Москва, 1992 г.).

Публикация результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем работы.

Диссертация наложена па Ш страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов.

Работа содержит 14 таблиц и 39 рисунков, в списке литературы приведено 257 источников, из них Ш иностранных авторов.

Исследования проводили на самцах белых крыс массой 130 — 150 г. В экспериментах использовано 117 лснвотных.

Проведены следующие серии экспериментов:

1. Внутрпбрюшинное введение ДСЇШ крысам в дозе J2 мг/кг массы, растворенного в физиологическом растворе, интервал времени — -1 часа. Контрольным животным вну-трпбрюшинно вводился физиологический раствор.

2. Действие гппоксической гипоксии при 0,029 МПа в течение 3 часов. Контролем служили животные, находившиеся в гппоксической камере в условиях нормокспи.

3. Действие гппоксической гипоксии при 0,029 МПа в течение 3 часов на фоне предварительного внутрпбрюшин-пого введения ДСИП. Пептид вводился за 1 час до помещения животных в гипоксическую камеру. Контролем служили животные первой серии, находившиеся в гппоксической камере в условиях нормокспи.

Гипоксическую гипоксию вызывали в барокамере проточного типа. Опыты проводили при атмосферном давлении в барокамере 0,029 МПа. Животные находились ц барокамере в условиях свободного поведения. Крыс дскапитиро-валн через 4 часа после виутрибрюпшннон инъекции ДСИП, или через 3 часа после помещения животных в гипоксическую камеру.

Материал для электронной микроскопии получали тотчас после декапитащш животного. Кусочки из коры головного мозга обрабатывали по общепринятой методике (Н. Т. Райхлин, 1977). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме УМТП-6, контрастировали на сетках цитратом евнниа и просматривали в электронном микроскопе ПЭМ-100.

Морфометрпческий анализ элсктроннограмм синапсов проводили на автоматизированном анализаторе изображения «ИБАС» («Оптон», Германия) с использованием разработанных программ и имеющегося программного обеспечения. На негативах, снятых при увеличении 15 000, производили детальное морфомстрическое изучение структуры аксо-соматнческих и аксошшшковых синапсов. Измерялись следующие структуры: пресинаптичоское окончание, синаптн-

ческие везикулы, активная зона, сннаптическая щель, митохондрии. В аксошипнковых синапсах кроме того измерялся постсинапс (шшшк).

Оценка пре- и псстсинаптическпх окончаний и митохондрий проводилась по следующим базовым параметрам: площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр, фактор формы. Для митохондрий вычислялось количество ерганелл в каждом пресинаптическом окончании. Спнаптическне везикулы оценивались по следующим базовым параметрам: их общее количество в пресинаптическом аксонном окончании, количество везикул вблизи активной зоны. Вычислялись следующие производные параметры: общая плотность еннаптнчеекпх везикул на 1 квадратный микрон пресинапса, число активных везикул на 1 микрон длины активной зоны, плотность митохондрий на 1 квадратный микрон площади пресинапса. Для активной зоны измерялась ее длина. Для синаптнческой щели измерялась се ширина в 10 случаіпіо выбранных местах и давалось среднее значение.

Определение содержания ГЛМК и глутаминовой кислоты в мозге проводилось методом высоковольтного электрофореза на бумаге в Na-ацетатном буфере (Siskcn ct al, 1961). Об активности ГДК судили по накоплению продукта реакции— ГАМК (Scliousdoe ,1981).

Активность Na+, К + , Са ++АТРаз определяли в мито-хондриальнон и еннаптической фракциях гомогената коры больших полушарий юловного мозга крыс, полученных методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (Po^is, 1981). Активность ферментов определяли по приросту неорганического фосфора при инкубации препарата в течение 15 минут в соответствующей среде. Активность Mg- + — зависимой Na+, К+ АТРазы рассчитывали по разности между ебщей и Мц+ + —АТРаз-ной активностью. Активность ферментов выражали в мкМ неорганического фосфора на 1 мг белка за 1 час.

Статпстичская обработка проводилась с использованием прикладного пакета статанализа к «ИБАС»у, производные параметры обрабатывались независимо. Оценка достоверности различий меяеду средними величинами во всех сериях экспериментов проведена с использованием критерия Стью-дента, при этом достоверными считались различия с вероятностью не хуже 0,05.