Исследование роли нейропептидных факторов в формировании центральных двигательных асимметрий Клементьев, Борис Исаакович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Проблема функционачьной асимметрии моз--- -га- является одной из актуальных в экспериментальной нейробиологии, неврологии и психиатрии (Балояов с соавт. ,1976; Брагина, Доброхотова, 1977,1978; Diamond ,1977; Levy ,1977; Костандов,І933; Геш-винд,І984; Бианки,1985; Мосидзе, Ээрохи,1986; Отмахова, Коновалов,1988). Бурно развиваясь в последнее время, исследования в . этой области существенно пополнили наши знания о принципах работы мозга как парного органа в реализации таких функций, как мыслительная деятельность, память, сон, эмоции. С позиции нарушения иерархии мекполушарных отношений в настоящее время рассматривается патогенез ряда заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как шизофрения, маниакально-депрессивный психоз, алкоголизм (Дег-ЛИНД970; Jeruesi, Taylor ,1982; Flor-Henry ,1983; Hallett, Green »1983; McShane,. Willenbring ,1984). В связи с этим очевидна перспективность дальнейшего развития этих исследований не только в теоретическом, ко и в прикладном аспектах.

Центральные механизмы регуляции двигательной функции также осуществляются на основе интеграции парных систем мозга. К настоящему времени накоплено значительное количество экспериментальных данных, а также клинических наблюдений, свидетельствующих о различиях иелду сишетричндаи зонами ВДС в реализации двигательной функции (Aimett ,1972,1974; Levy, Hagylald. ,1972; Robinson, Coyle, 1980; Брагина, Доброхотова, 1981; Бианки с соавт.,1982; Иоффе с соавт.,1984; Мао Hellage et аі ,1987). Один из наиболее эффективных, подходов к изучению этого вопроса основан на моделировании центральных двигательных асимметрий с помощью односторонних по в- ' реадений мозга. Вакным достоинством указанного подхода является то, что он включает в себя моделирование состояний, близких или идентичных тем, которые широко распространены в клинике нервных болезней в ввде односторонних центральных двигательных расстройств травматического и васкулярного генеза.

Стремление исследовать нейрохимическую основу функциональной латералиэацяи ВДС привело к возникновению сравнительно нового направления в нейробиологии - изучению нейрохимической асимметрии мозга (Кононенко, 1979,1980; GlicU et аі ,1932; Schneider et al, 1982; Луценко, Карганов,1935; Sandhu et al ,1936). Эти исследования обогатили нас информацией о возможных вариантах соотношения

_ 4 -

биохимических показателей функционирования гомотопных образований мозга. Вместе с тем, оценивая общие тенденции в развитии этого направления, приходится признать, что в подалящем большинстве работ внимание специалистов сконцентрировано на изучении метаболизма нейромедиаторных систем, являющихся исполнительным звеном механизма химической регуляции функций ЦНС. Исследованию роли ней-ромодуляторного, в частности, нейропептидного канала регуляции парных функций мозга посвящены лишь единичные работы. Однако в этих исследованиях показана перспективность изучения роли нейро-пептидов в формировании функциональных асимметрий мозга. Обнаружена способность некоторых нейропептидов индуцировать асимметри-ные функциональные реакции ЦНС при их системном введении ( Cohn, Cohn ,1975; Чазов, Бехтерева,1986). Установлено, что в ткани головного и спинного мозга содержатся факторы пептидной природы, характеризующиеся избирательной тропностьа к одной из симметричных (правой или левой) зон ЦНС (Вартанян, Балабанов,1978; Варта-нян,1981; Бакалкин с соавт.,1981; Крыяановский с соавт.,1981,1982, I98V; Барлинская,1982} Шатик,1935; Богданов с соавт. ,1937).

Таким образом, к настоящему времени созданы предпосылки к смещению акцента в исследовании нейрохимических основ функциональной асимметрии из области описательной, предусматривающей выявление биохимических коррелят этих состояний, в область изучения роли пептидных нейромодуляторов в индукции функциональной латерализации мозга. Целесообразность реализации этого направления исследований определяется его адекватностью решению актуальной задачи теоретической и прикладной нейробиологии - разработке способов направленного унилахерального воздействия на ЩС с целью химической регуляции (в том числе к коррекции) парных функций мозга.

Проведённые исследования выполнялись в рамках Программы ГКНТ (0.74.05), утвервдённой в соответствии с Постановлением ЦК КПСС и СМ СССР "0 дальнейшем развитии физико -химической биологии и биотехнологии в использовании их достижений в.медицине , сельском хозяйстве и промышленности", а также Всесоюзной Программы "Мозг" ДІЇ СССР и комплексной Программы "фундаментальные науки - медицине" АН и А№ СССР.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение основных закономерностей формирования двигательных асиммет-

- 5 -рий на моделях унилатеральных повревдений ЦНС и анализ участия в этом механизме нейропептидных компонентов мозга.

В соответствии с этим в ходе проведения исследований решались следующие основные задачи:

1. Сопоставление особенностей центральных двигательных асимметрий, формирующихся в результате право- и левосторонних повревде-ний головного и спинного мозга.

2. Изучение основных стадий регуляции биологической активности эндогенных нейропептидных факторов (факторов позной асимметрии -<ША), индуцирующих формирование центральных двигательных асимметрий при односторонних повревдениях мозга.

3. Сравнительный анализ физико-химических свойств право- и левосторонних ФПА. Выделение ФПА и определение его молекулярной структуры.

4. Изучение возможности использования ФПА с целью ускорения восстановления двигательной функции после унилатерального повреждения мозга.

Научная новизна. Установлена универсальность феномена спинномозговой фиксации позной асимметрии (ПА) в условиях различной локализации (головной мозг, спинной мозг) и различного характера (экстирпация, перерезка, ишемия) односторонних структурных повре-звдений ВДС. Обнаружены различия в степени выраженности и в дина-,мике протекания центральных двигательных асимметрий при право- и левосторонних повревдениях моага. Охарактеризованы основные этапы регуляции биологической активности нейропептидных ФПА, включающие в себя: а)первичную нейрогуморальную активацию ФПА в нейроэндокрин-ной системе на стадии, предшествующей спинномозговой фиксации ПА; б)возникновение дисбаланса в биологической активности право- и левостороннего ФПА за счёт активации ФПА, локализованного в денерви-рованной половине спинного мозга (стадия спинномозговой фиксации ПА); в)восстановление баланса биологической активности право - и левостороннего $ПА на стадии восстановления симметрии позы. Показана химическая гетерогенность ВДА, выявлены физико-химические различия мевду факторами, характеризующимися разнонаправленным по стороне действием. Обнаружено, что молекулярная структура одного из правосторонних ФПА идентична структуре аргинин -вазопрессина. Доказано унклатеральное активирующее действие ФПА на восстановление двигательной функции после одностороннего повреждения неокор-

- б -

текса.

Теоретическое и практическое значение работы. Выявлены и охарактеризованы межполушарные различия в регуляции двигательной функции. Установлено, что нейрогуморальний контроль парных функций мозга осуществляется за счёт регуляции биологической активности нейропептидных факторов латерализованного действия. На основании полученных данных о различиях в физико-химических свойствах право- и левосторонних ФПА сформулирована гипотеза о химической диссимметрии мозга. Показано, что активация нейропептидных факторов является индуцирующим эвеном в формировании постденервацион-ной гипервозбудимости спинномозговых центров. Экспериментально подтверждено одно из следствий закона денерващи, согласно которому состояние постденеррационной гипервоэбудимости представляет собой важный этап компенсаторного процесса.

Практическое значение работы связано с разработкой новых возможностей направленной коррекции меетюлушарных отношений на основе использования эндогенных нейропепуиднызс факторов, обладающих латерализованным действием на ЩС. Получено экспериментальное доказательство эффективности указанного подхода в регуляции восстановления двигательной функции после одностороннего повреждения нескортекса. Практическое значение таете имеют: разработанная схема выделения пептидных компонентов гипофиза, а также описание особенностей применения метода биотесткрования для идентификации эндогенных биологически активных соединений пептидной природы.

Положения, выносимые на защиту.

1. Моторные области неокортекса правого и левого полушарий
функционально асимметричны. После повреждения неокортекса левого
полушария облегчение рефлекторной деятельности спинного мозга
происходит в более ранние сроки после травмы, по сравнению с иден
тичным повреждением правого полушария. Восстановление двигатель
ной функции контралатеральной конечности выявляется в 100^ случа
ев после экстирпации моторной зоны неокортекса левого полушария

и только у 60 - 10% животных с аналогичной травмой правого полушария.

2. Асимметричное функционирование спинномозговых центров вызы
вается эндогенными нейропептидндаи факторами латерализованного
действия (ФПА). Динамика активности Шк при одностороннем поврек-

денна иеокортекса складывается из трёх этапов: а)первичная активація (индукция) ВДЛ в гипофизе (2 часа после травмы); б)возрастание биологической активности ЗЗПА в церебро-сшнальной жидкости и з ткани мозга на стадии спинномозговой фиксации ПА (2 - 18-ые сутім после травмы); э)химическая инактивация <ЖІА на стадии восстаковле-івія симметрии позы (21 сутіаі после травмы)..

3. ФПА химически гетерогекны и представляют собой индивидуальные соединения олигопептидной природы с молекулярными массами в пределах 0,7 - 1,3 кДа. <5ПА с противоположным го стороне действием (правосторонний и левосторонний) отличаются друг от друга по физико-химическим характеристикам. Структура одного из выделенных правосторонних Шк идентична структуре аргинин -вазопрессина. Свойствами правостороннего Шк обладают таюхе лизин -вазопрессин и ок-ситоцин. Действие этих пептидов в качестве ЗДА реализуется в суб-гормональиых дозах.

4. Динаміка восстановления движений в контралатеральной конечности после одностороннего повреждения моторной зоны неокортекса определяется уровнем биологической активности ФПА в церебро-спина-льной гмдкости. Интрацистернальное введение дополнительных количеств ПА ускоряет восстановление двигательной функции. Лечебный эффект ШПЛ характеризуется унилатеральностью действия: аргинин -вазопрессин эффективен при правосторонних двигательных расстройствах и неэффективен при левосторонних.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации докладывались и представлялись на III Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию новых физиологически активных веществ, Рига, 1979 г.; Всесоюзной конференции по нейрофармакологни (новые, препараты в неврологии), Ленинград, 1980 г.; II Всесоюзном съезде эндокринологов, Ленинград, 1980 г.; Советско-Итальянском симпозиуме по нейрофармакологни, Москва, 1981 г.; Н? тшой сессии отделения медико-биологических наук АНИ СССР по проблеме "Биологически активные пептиды", Москва, 1983 г.; 14 Всесоюзном съезде физиологического общества, Баку, 1983 г.; Всесоюзном симпозиуме "Нейрохимические механизмы регуляции памяти", Пущино, 1984 г.; Всесоюзном симпозиуме "Система мозговых и внемозговых пептидов", Ленинград, 1984 г.; I Всесоюзном рабочем совещании "Мэрфогенетически активные вещества", Пущино, 1985 г.; I Всесоюзной конференции

"Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии", Томск, 1985 г.; 4-ом заседании Научного совета ЛН и АШ СССР по физиологии человека и Президиума СО АШ СССР "Механизмы повреждения и восстановления целостного мозга", Иркутск, 1987 г.; 15 Всесоюзном съезде физиологического общества, Кишинёв, 1937 г.; Советско-Британском симпозиуме по неврологии "Приципы и механизмы заболевания мозга человека", Ленинград, 1988 г.

Публикации результатов исследования. Основные положения и результаты диссертации изложены в 25 печатных работах.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на
страницах машинописного текста, из них рисунков и таблиц.

Список литературы включает в себя работ отечественных и за-

рубежных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, четырёх глав с изложением полученных результатов, заключения и выводов.

В работе использованы белые нелинейные крысы-самцы, а также крысы линии "Вистар" (самцы и самки) массой 160 - 220 г., всего около 5000 животных.

Моделирование и регистрация центральных двигательных асимметрий

Все операции проводили год эфирным или нембуталовым (40 мг/кг) наркозом. При односторонней экстирпации моторной зоны неокортекса удаляли участок теменной кости, медиальный край которого отстоял на 2 мм от срединного шва. Вскрывали твёрдую мозговую оболочку и с помощью стимуляции игольчатыми электродами находили зону неокортекса, раздражение которой вызывало сокращение мышц контралатера-льной задней конечности. Идентифицированную зону удаляли с помощью вакуум-экстрактора.

При латеральной гемисекции спинного мозга осуществляли доступ к средним грудным позвонкам (Т^ - Тс). После ламигоктомии вскрывали твёрдую мозговую оболочку и под визуальным контролем остро заточенным скальпелем перерезали правую или левую половину спинного мозга одним движением в вентро-дорзальном направлении. В случае хордотомии те же манипуляции завершались полной перерезкой спинного мозга.

При моделировании одностороннего ишемического инфаркта мозга

использовали рекомендации Kogure et al, (1974). В качестве эмбо-лов применяли суспензию гранул (20 - 50 мкм) сефадекса G- - 50, являющегося биологически инертным материалом, допускающим стерилизацию кипячением. Суспензию вводили в общую сонную артерию у места её бифуркации при перевязанной наружной сонной артерии.

Трансаурикулярную гипофизактомию производили путём вакуумной экстракции гипофиза через инъекционную иглу, подведённую к области турецкого седла через слуховой канал. Угол наклона направляющего иглу стержня определяли с помощью приспособления на приборе конструкция Федотова и Баграмяна (1963). Эффективность гипофизэк-томии контролировали постмортальной ревизией области турецкого седла.

Спинномозговую фиксацию ПА задних конечностей регистрировали через I час после хордотомии на уровне Тт - То» ПА проявляется в преимущественной флексии одной из задних конечностей в ответ на одновременное полное подошвенное сгибание голеностопных и разгибание тазобедренных и коленных суставов обеих конечностей ( Chamberlain, 196З ) ПА считалась значимой, если длина проекции отрезка прямой, соединяющей большие пальцы задних конечностей, на продольную ось тела животного превышала 5 мм.

При ЭМГ-регистрации оценивали биоэлектрическую активность одноимённых мышц обеих задних конечностей (двухглавых и четырёхглавых) с помощью стальных биполярных электродов (диаметр 0,5 мм, межэлектродное расстояние 3 мм, глубина погружения 1,0 - 1,5 мм). Регистрацию производили на восьмиканальном энцефалографе ЕЮ- 4751-2 MB 5606 В (ВНР). Оценивали коэффициент асимметрии (КА) интегрированной по частоте и амплитуде биоэлектрической активности одной- . мённых мышц (в изометрическом режиме) по формуле:

~ эж_{щ +} эыг_лев

Значения КА вычислялись автоматически на моделирующей нелинейной установке Ш - 10 М. Значения КА, полученные в одном эксперименте (300 - 400 значений), усреднялись. Результаты каядой экспериментальной серии обрабатывались на системе вычислительной техники М-6000 кандидатом биологических наук И.D.Забродиным.

Восстановление двигательной функции поело одностороннего пов-

решения моторной зоны нсокортекса изучали с помощью теста на реакцию захвата задними конечностями металлического стержня диаметром Ю мм ( Prendergaot et al,I982). Состояние двигательной функции оценивали по трёхбальной шкале: критерий восстановления "0" -отсутствие попыток осуществить реакцию захвата; критерий восстановления "I" - неэффективные попытки осуществления реакции ( а) незавершающиеся захватом, б Завершающиеся захватом, но с латентным периодом, превышающим 3 секунды ); критерий восстановления "2" - реакция осуществляется с латентным периодом менее 3 секунд, равным таковому на условно здоровой стороне (двигательная симметрия).

Идентификация Шк в биотесте. Тестируемый материал в объёме 10 - 50 мкл вводили интрацистернально интактшм ясивотным-реципи-ентам. Через 10 кинут после инъекции перерезали спинной мозг на уровне верхних грудных сегментов и через I, 2 и 3 часа после хор-дотомии регистрировали наличие или отсутствие ПЛ. Для оценки уровня биологической активности ФПА тестируемый материал подвергали последовательным 10-кратным разведениям. При определении минимальной активной дозы исходили из степени максимального разведешя»' при котором донорский материал сохранял способность вызывать ПЛ у реципиентов. Тестирование кавдого из образцов проводили на группе реципиентов, состоящей не менее чем из 10 животных. Активность ФПА оценивали в количестве минимальных активных доз на единицу объёма ликвора, веса ткани или содержания белка в тестируемом материале. ФПЛ обозначались как правосторонние или левосторонние в зависимости от стороны вызываемой ими флексии.

В некоторых экспериментах сторона действия ФПА, полученных от животных с односторонним повреждением неокортекса, оценивалась в виде коэффициента латерализации (КЛ), рассчитанного по формуле:

"конт *нп

КП = ,

*конт ип где Ф_кочт и Ф_ип - соответственно количество реципиентов с контра-и ипсплатеральной флексией относительно стороны поврегдения мозга донора.

Биохимические методы. Мозговую ткань и ткань гипофиза извлекали в течение 1-2 минут после декапитации и помещали в жидкий

- II -

азот. Ткань гомогенизировали в пяти- или в десятикратном избытке по объёму 0,2 М HCI. Экстракцию проводили в течение 30 минут при +4С. После центрифугирования надосадочнуга жидкость нейтрализовали 0,2 М КОН до рН 7,0 и от образующегося осадка освобождались центрифугированием. Супернатант замораживали и лиофилизировали. Лиофилизированный продукт хранили при -20С.

Белок определяли ПО методам Lowry et al (1951), Bradford (1976)

При определении чувствительности компонентов экстракта к ферментам в 1,0 мл инкубационной смеси добавляли навеску лиофилиэи-рованного экстракта, содержащую 500 мкг белка. Инкубацию с 20 мкг трипсина < Sigma ) проводили в 0,01 М ИН₄НС0₃, рН 8,0 при 37С в течение 5 или 24 часов. Продолжительность инкубации выбрана согласно кинетике гидролиза трипсином азаальбумита (Calbochem ) в тех же условиях.Обработку экстракта 5-ью мкг рибонуклеази A (Sigma), свободной от протеаз, вели в 0,1 М трис-НСІ, рН 7,5 при 37С в течение 4 часов. Время инкубации определено по кинетике ферментативного гидролиза мРНК E.coli (Sigma). Ферменты инактивировали кипячением.

Для гель-фильтрации использовали сефадекс G - 25 (Pharmacia ). фракционирование смесей на колонках (К 26/40, К І6/Ю0) проводили в I М уксусной кислоте или в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Скорость элюирования 3.0 - 3,5 мл/ч^;смг. фракции элюата нейтрализовали I М ВД^ОН и лиофилизировали.. Оптический профиль элюата регистрировали с помощью спектрофотометра "Бекман" (модель 26) и при ставки "Увикорд s Ц" (LKB).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию под давлением проводили на хроматографе "Altex" (модель 322). Использовали колонки размером 4,6 х 250 мм и 10 х 250 мм, заполненные "ультрасфер -ods " с размером частиц 5 мкм. Градиенты концентрации ацетонитри-ла в 0,1% ТФУ задавались и поддерживались ав" -матически. Скорость элюирования I мл/мин. Профиль элюата регистрировали в проточной кювете при длине волны 220 нм. Техническую помощь в проведении высокоэффективной хроматографии оказывал кандидат химических наук А.СМолокоедов.

При приготовлении образцов для рехроматографии учитывалась возможность потерь продуктов выделения в условиях обычной лиофильной сушки. Поэтому концентрирование образцов проводилось в центрифуж-

ных пробирках, находящихся во вращающемся роторе настольной центрифуги под вакуумом.

На всех стадиях выделения образцы помещались в посуду, обработанную 2%-ой силиконовой эмульсией ( Amersham ).

Для получения ШР-спектров выделенный продукт лиофилизировали . и перерастворяли в Д0. 500 МГц спектры снимали при 0С на приборе "/№ - 500 BruJcer" с рабочей частотой по протонам. Получение и расшифровка спеїстров проводились кандидатами физико-математических наук В.И.Бушуевым и Н.Ф.Сепетовым.

Использованные в работе аналоги метионин- и лейцин-энкефалинов синтезированы в Лаборатории синтеза пептидов ВДНЦ АШ СССР.

Статистические методы анализа. При статистической обработке результатов применялись непараметрическяе методы анализа: критерий знаков, точный метод Фишера и метод углового преобразования Фишера.