Исследование процессов специализации и интеграции клеток и морфогенез эпителиев в норме и патологии Савостьянов, Геннадий Александрович

Введение к работе

І. Проблемі и ее актуальность. Одной из главных проблем эволю-щошой теории является разработка вопросов, позволяющих прогно-жровать возможные пути эволюционного развития. В особенности это ?ажно применительно к становлении многоклеточное и изучению возможностей развития многоклеточных организмов, их органов и зистем и, в частности, тканей. Эта проблема важна потому, что без эе решения невозможно изучение таких вогіросов биологии и медици-щ, как прогнозирование морфогенеза в нормальном развитии, упражнение им при регенерации, а также контроля за злокачеотвенннм ростом.

Принципиальная возможность прогнозирования тканевого развития Зыла обоснована работами Беклемишева, Заворзина, Хлоігина и их ^следователей. Для практического же прогнозирования тканевого развития необходимо иметь способы нахождения полного набора возможных установившихся мор{офункциональных состояний тканей, т.е. их конструкций. Однако этот вопрос в эволюционной гистологии остается нерешенным.

Наиболее мощные и содержательные подходы к решению подобных проблем основываются обычно на представлениях о том, что изучаемые объекты имеют модульное строение. Другими словами, они состоят из элементарных морфофункционалытх единиц, упакованных некоторым образом в ограниченном пространстве» Как правило, это проявляется в симметрии состоящих из модулей обьектов, к изучению преобразований которой и сводится обычно дело.

.Со времен Мильн-Эдвардса, Бэра и Бирховя известно, что в биологии основой становления многоклеточных организмов и развития их элементарных моріофункционольннх единиц являются процессы специализации и интеграции алиментов, т.е. "разделение Функций" между ними. К настоящему времени установлено, что злемпнтярннч единицы и симметрия обнчнн для целого ряда ультраструктурних и макроскопических биологических образований. Например, у вирусов это кяпсомеры, в органах это нефронн, гепятонн и т.д., в расположении которых выявляется выраженная симметрия.

Высказываеся мысль, что и ткани также состоят не из клеток как таковых, а из клеточных объединений, являщихеи элементарными тканевыми модулями (Хрущев и Бродский 19в1, Казначеев, Субботин IS7I, Pollen a. Allen 197. Фридпндитейн и Лурия ItW), Гр»Т>ж> 1983, Гавриш и Пауков Г?>88 и Др.). Зти модули названы ними <[>jitm циинами. Л развитии тканей инмецнштся состан, структур-* и tvn»*.

- 4 -расположение функционов, что требует их топологического и геометрического описания (Беклемишев 1924, Томпсон 1942, Мещеряков і Белоусов 1978, Преснов и Исаева 1985, и др.). Их нарушения составляют также основу важнейших видов тканевой патологии, такт как воспаление и опухолевый рост. (Саркисов, 1985, Серов 1986 і др.)

Таким образом, выяснение закономерностей и разработка методов прогнозирования тканевого развития в норме и патологии сводится к изучению процессов специализации и интеграции клеток л определению состава и структуры возникающих в- результате клеточных групп - функционов, а также правил их полимеризации при возникновении тканей и органов. Другими словами, разработка теории биологичеокого развития в значительной мере сводится к изучайте механизмов и законов разделения функций между клетками, нахождению множества вариантов этого разделения и критериев для построения такой их классификации, которая включала бы не только существующие, но и могущие существовать варианты.

Казалось бы, именно процессы разделения функций, порождаемые ими модули и их полимеризация и должны быть в центре внимания специалистов, занимающихся проблемами развития тканей в норме и патологии.

Однако в тканях, в отличие от органов, модули непосредственно не наблюдаются и их существование не очевидно (исключение -пролиферативные единица эпидермиса). Поэтому понятие об элементарной морфофункциональной единице ткани остается интуитивным и при экспериментальном исследовании развития тканей основное внимание обычно уделяется либо процессам диффэренцировки клеток как таковых (Альберте В., Брей Д., Льюис Дж. и др. 1986), либо технологии отправления ими специализированных функций (Уголев 1985, 1990). Объединение же клеток в. целостные группировки практически йе исследовано, до сих пор неизвестно, в каких макроскопических свойствах ткани проявляется ее модульное строение, не разработаны и метода экспериментального определения их состава и структуры. Б частности, представления о модулях никак не связываются с цитоар-хитектоникой ткан я и симметрией клеточных мозаик тканевых пластов, а сами мозаики понимаются упрощенно (считается, что однослойные ткани формируют единственный вид мозаики из гекоагонов, а многослойные - из четырнадЦатигранников). Эти представления установились настолько, что их не поколебали единичные экспериментальные находки и других топологических вариантов мозаик.

Теоретические представления о процедуре .разделения функций, ороадающей модули, и об их классификации также не развиты. В ли-ературе имеются отдельные указания на фундаментальную роль и итердисцйгошнарный характер этой процедуры (Завадский. 1970, Хэм : Кормак 1982 др.). Однако теория разделения функций, описывявдая іозникяовение морфофункциональнш единиц, практически не разрабо-ана и на этом пути сделаны лиш первые шаги (Ферстер, 1965, Ра-іевскиЯ,"І968, 1970).

Как итог - нет естественнонаучной методики для определения юстава и структуры тканевых модулей, а существующие првдставде-[ия не могут служить основанием для выявления тканевых модулей и прогнозирования тканевого развития.

Это является причиной того, что и при изучении патогенеза ювообразований основное внимание обычно уделяется не модулям как ;амостоятелышм объектам и не характеризующей их архитектонике рканей, а клеткам и, в частности, исследованию внутриклеточных маниэмов жизнедеятельности и дифференцировки. В особенности аго (асэется клеточного генома. Межклеточные же взаимодействия, определяющие целостность клеточных группировок, при этом явно недоу-іитнваютея. Возможно, именно этим объясняется медленный прогресс ^ решении ряда проблем патологии, в частности, злокачественного хюта.

Поэтому именно тканевые яоЪцач - 4ункциокн и теорля их воэ-ишновения, формі{юв(шія из пих тнаней и ее цитоарзшеюпонгтл, а <е соапивлятрмв vuv нмпюх нем гхмовие и явмчхтоя підметом wxueeo :аосммреюія в немютв* новж мпррофункщюнальнчх; единиц, играх>-тх вожнъФную роль б развитии и яммеОваяшьносш органи»жі.

//«.<« и ааОачч. Исходя из изложенного, целью нашей работы было (роьвЛУчщв системного анализа процессов разделения функций между «летками как осноьи становления многоклеточное и формирования елементарних тканешх морфофункщтональных единиц - Функционон в Вило- и онтогенезе, ь также роста, отроения и морфогенеза тканевых пластои кал результата полимеризации Функционер, и на этой зонове - прогнозирование тканевого развития.

В соотеетогнви о поставленной целы» предполагается (мшить іувдумцие задачи:

I) Разработать формализованный язик для описания iipun-'гіч..в

ОПОЦИ'НИЗаЦИИ И ИИТ^ГрнЦИИ К.іІвТОК В ризВИТИИ, а Т'ШЖн О'КІ'і'І-а и

г-груктурн нозникмипих в результате зтгіі'о Функції¹'Чом.

?) Гизраг»'т-іть ін'ніН'К «'v[v.''vi'l»^lnn<'fl к.Ч'ич'ифмкацич v_vn-M-pa-iv

тканевых модулей - функционов.

1. Рассмотреть формирование тканей из функционов и найти такие свойства тканей, в которых проявляются состав и структура их функционов.

2. Дать прогноз тканевого риаьития путем нахоадения множества всех возможных вариантов цитоархитектоники, т.е. топологических конструкций тканевых пластов, и их сопоставления с реальными тканями.

Б) Построить модели нормальных и патологических функционов. 7) Провести экспериментальную апробацию предложений теории и вытекающих из нее моделей.

Основные положения и иг новизна

1. В рамках системного подхода впервые исследованы морфо-функциональные аспекты процессов разделения функций мевду клетками в развитии многоклеточностии и разработан формализованный язык, позволяющий с единых позиций давать аксиоматизированное описание процессов развития и морфогенеза в норме и патологии.

2. В качестве следствия впервые достаточно строго определено понятие клеточного модуля или функциона - элементарной морфофунк-циональной единица многоклеточности и ткани. Функционы - образования, реально существующие как в мономерном, так и в полимеризо-ванном виде, и именно они, а не входящие в них клетки как таковые составляют основу жизнедеятельности тканей. Они представляют собой самостоятельный уровень биологической организации, лежащий между уровнями клеток и тканей, и должны входить в состав предмета, изучаемого гистологией и биологией развития. Ключом для их развития являются клеточные мозаики.

Тем самым выделен новый для гистологии предмет изучения -функцион и предложен метод его исследования.

3. Впервые построена естественная система функционов идеаль
ного многоклеточного организма, имеющая вид периодической табли
цы, параметры которой имеют биологический" смысл и пригодны для
количественного описания развития. .

4. Приведены экспериментальные доказательства реальности
существования фу> ционов в мономерном виде и дано объяснение за
кономерного характера пространственной организации дробления: оно
определяется свойствами мономерных функционов.

Б. Впервые показано,¹ что общим принципом построения эпите-лиеь является полимеризация их, функционов, т.е. епителий - это гюлимериэованый Функцион. Состав и структура функционов проявля-

- 7 -отся в таких макроскопических свойствах тквни, как периодические <леточные мозаики. Предложено деление тканей но составу их функдионов на простыв и сложные и показано, что состав функциона определяет хроматические, а структура - топологические свойства даээеик.

6. Впервые предложен набор правил полимеризации функционов, играющих роль законов тканевого морфогенеза. Показано, что мно-иество всех теоретически возможных клеточных мозаик плоских эпи-телиев образует II правильных топологических конструкций (а не одну, как это было принято считать), .и найдены состав и структуре, их функционов.

7. Собраны и проанализированы экспериментальные данные, показывающие, что по меньшей мере 7 из II теоретически найденных мозаик реализуются у различных ныне существуших животных. Таким образом, впервые получены основания предсказать возможность обнаружения еще 4 оставшихся вариантов мозаик.

8. Впервые предложен набор хртматичэских правил полимериза-ции и дана их физиологическая интерпретация. Найдены хроматические варианты правильных плоских клеточных мозвик. В частности, показано, что предельное число входящих в них клеточных тиноь. равно 7. Тем самым разработаны научные основы для прогнозирования моріюгенезв тканевых пластов в фило- и онтогенезе.

Э. Впервые показано, что параметры клеточных мозаик делятся на метрические, топологические и хроматические. Они характеризуют Физиологический аспект жизнедеятельности ткьнн и образуют систему новЫ)( информативных признаков для нахождения состава и структури тканевых функционов, а также для диагностики и прогнозирования тканевого развития в норме и патологии.

10. На основании результатов сканирующей электронной микроскопии клеточных мозаик эктодермы зародышей травяной лягушки впервые описаны их хроматические варианты, определены их функци-оны на различных сроках нормального развития и показано, что изменение клеточного ооотпри функционов и клеточных мозаик носит характер фазовых переходов и происходит с выполнением нрчнил стехиометрии.

11. Впервые обосновано, что ирмпнчния тканей >< нормані.ном развитии и патологии являются дну читанными: я) ьнутриФ^чн" и<м><-

Н«НИЯ МОЗЗИК, Г.&ЯИННННе О рИЗІІроООМ МеТрИЧИСКИХ ll>ip«Mt'Vl»>l< чкиней И НПКОПЛеНИвМ ДЄ>І**НТОВ M'J^liiK. И б) 1Ч>ІЮЛі.іІ'ИЧОСКИИ Тр^;ІН':фи|іМ.Ч|і.ии МОМЯИН, ММВЩИІИі» ХЯриКТй[і Пр^ДСКП^уИМИХ ifVl.'JOBHX НчреХОД'і», Гі|.'Иі.«>

- 8 -дящих к морфофункциональной перестройке ткани.

12. Показано, что трансформации мозаик сводятся к изменении состава и структуры тканевых функционов. Тем самым переформулируется проблема исследования тканевого развития. В качестве таковой провозглашается проблема изучения состава и структуры тканевых функционов.

13. Построена модель функциона, отражающего злокачественный рост, в которой упрощение одних клеток сопровождается усложнением других. Тем самым разрешено противоречие одновременного усложнения и упрощения клеток в опухолях.

14. Проведено электронномикроскопмчеекое изучение опухолевых клеток in vivo и in vitro и показано,что характер изменения их ультраструктура хорошо согласуется с предсказаниями, следующими из анализа модели функциона злокачественного роста.

Таким образом, на основании изложенного быше жожко выделить следующее основное научное положение настоящей диссертационной роботи. Теоретически и экспериментально обосновано выЭеле-нив нового уровня биологической организации, занимещвго промежуточно положение между уровнями клеток и тканей. Его объектом являемся элементарная морфофункционалънш единица тнани, возникающая в результате разделения функций между клетками и названная фуннци-оном. Разработан метод шучения и описания состава и структуры функционов.

Представления о функционах позволяют с единых позиций рассматривать и прогнозировать развитие и морфогенез тканей в норме и патологии.

Научное и практическое значение

I. Изучение процессов специализации и интеграции клеток и

описание тканевых модулей позволило расширить представления об

уровнях биологической организации и выделить ати модули в новый,

самостоятельный уровень, лежащий между уровнями клеток и тканей. .

Представления с модульном строении тканей позволяют вычислять множество воех возможных топологических конструкций тканей в виде периодических клеточных мозаик и впервые дают основу для прогнозирования j ізьития тканевых пластов в фило- и онтогенезе. Данные о мозаиках расширяют сведения о цитоархитбктонике епите-лиев и могут войти в учебники и руководства по гистологии.

Представления о модулях позволяют проблему классификации тканей переформулировать как проблему систематики их модулей и строить эту систему в виде периодической таблицы, параметры кото-

- 9.-

»й можно использовать для количественной характеристики зволюци-)нного развития.

Перечисленные результаты имеют принципиальное значение для юследоввтельских учреждений, занимающихся изучением Фундаментальных вопросов биологии развития. Кроме того, подход, рнзрвбо-ганный для изученкя процессов специализации и интеграции {или раз-адления функций), может использоваться как методологическая базо гри изучении этих процессов у социальны* насекомых, колониальных кивотяых и екосистем, а также в системах иной, в том числе и не Экологической, природы.

2. Разработанный подход позволяет давать компактное аксиоматизированное описание многочисленных разрозненных и труднообозримых,данных биологии развития и патологии. Другими слотами, он позволяет "сжимать" инфляцию и благодаря втому может использоваться в учебном процессе в институтах биологического, медицинского и сельскохозяйственного профиля.

3. Параметры клеточных мозаик тканей являются новыми информативными признаками, пригодными для определения состава и структуры тканевых Функционов. Они составляют новый тест для диагностики патологии тканей и могут использоваться в лабораториях морфологического профиля.

Публхшщш. По материалам диссертации опубликовано 45 работ.

Апробация робеет. Диссертация апробирована на расширенном заседании секции эволюции сенсорных систем Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, С. Петербург.

_tВключенный в работу материал был доложен и обсужден на: 24 конференции ЛО НТОРЭС им. А.С.Попова (Ленинград,1969); Втором Всесоюзном Академическом симпозиуме по применению математических методов в медико-биологических исследованиях (Обнинск, 1971); на симпозиуме "Механизмы канцерогенеза", (Киев, 1972); В^есошной конференции "Вирусологические аспекты изучения этиологии лейкозов" (Рига, 1973);.Ленинградском научном Обществе рентгенологов и радиологов (Ленинград, 1973, 1978); Первом еьезде онкологии FC0KTF (Уфа, 1973); симпозиуме "Факторы антикйнцерогенозя", (Киев, 1974); Второй Всесоюзной коН'»і|>єнциіі "Биологическая и медицинская Кибернетика" (Ленинград, 1974); Всесоюзном симпозиуме о участием иностранных ученых "Физиологическое понятие ьс:.<{>аот№й Н'.рмы" (Ленинград, 1974); заседании кяфмдры амбріюлогии ЛГУ (Теиингрнд, I97B)j'Тр"Тьей встрече Cofn'1-стко - Американской рабочей группы по программ* вирусной онкологии (В»т>?зда, СІПА, Т97Г>); В'.'»ччч«<ж*1

- 10 -симпозиуме "Генетика и адаптация клеточных популяций" (Ленинград, 1975); VI Всесоюзной научно-методической и IX Всесоюзной научно-производственной конференции по патологической анатомии сельскохозяйственных животных (Таллин, І97Б, Каунас,1984); v Всесоюзном совещании эмбриологов (Ленинград, І97Б); Первом симпозиуме по комплексной проблеме "Канцерогены и растения" (Ленинград, 1976); Седьмой и Восьмой итоговых научных конференциях онкологов (Ленинград, І97Є); Всесоюзном симпозиуме по математическому обеспечению и использованию ЭВМ в медико-биологических исследованиях (Обнинск, 1976); Четвертой Всесоюзной конференции патологоанатомов (Тарту, 1976); Второй Всесоюзной конференции "Современные методы морфологических исследований в теоретической и практической онкологии" (Тбилиси, 1978); Третьем и Четвертом Всесоюзных Съездах онкологов (Ташкент, 1979, Ленинград 1986); Всесоюзном совещании по проблемам тератологии (Ленинград, 1981); заседании семинара по теоретической биологии ЛОБ (Ленинград, 1982); Второй Всесоюзной конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов" (Москва, 1981); рабочих совещаниях "Теоретические и математические аспекты морфогенеза и дифференцировки" (Махачкала, 1987), Пущино, 1991); Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград, 1988); научной межреспубликанской конференции "Самоорганизация в природе и обществе" (Ленинград, 1988); на Одиннадцатом Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Ленинград, 1988); Второй Всесоюзной конференции по проблемам эволюции (Москва, 1988); Первой Республиканской научной конференции "Управление морфогенезом тканей и органов в процессах адаптации" (Иркутск, 1989); Десятом Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии, посвященном памяти акад. Л.А. Орбели, Ленинград, 1990; Пятой Всесоюзной конференции, посвященной 90-летию со дня роад. академика АН Армянской ССР, чл.-корр АН СССР, X. С. Коштоянца (Москва,1990); Международной конф. "Пространственные группы симметрии и их современное развитие, (к 100-летию вывода федоровских груші)", Т4 - 18 мая 1991, Ленинград.

Структура и 'бьем Оиссерпацш. Диссертация изложена на 344 стр. и состоит из введения, обзора литературы, теоретической части с изложением гипотезы, материалов и методов,' использованных в работе, сопоставления теоретических выводов с данными литературы, раздела собственных зкспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. В работу включено 6

- 11 -аблиц и 124 рисунка (графики, схеми, микрофотографии и электрон-ограмш). Указатель литературы содержит 353 работы отечественных иностранных авторов.

Излокенные выше введение, обзор литературы, цели и задачи «боты представлены в первых трек главах диссертации.

Иапвршин и методы исследования описана в четвертой главе. Материалом для разработки теоретической части исследования лужили основные биологические обобщеншь содержащиеся в руковод-ітвах и справочниках по общей биологии, биологии развития, морфо-гогии, эволюционной физиологии, общей патологии и онкологии, ко-орые анализировались с позиций разработанного подхода.

При построении формализованного аппарата использованы основы тотемного анализа, теории графов и кристаллографии.

Материалом для собственного экспериментального исследования формирования клеточных мозаик служили зародыши Rana temporaria ь. m различных стадиях развития, определяемых по Дабагян и Слепце— юй (1975).

При исследовании изменения ультраструктура клеток использо-зали нормальные ткани различных животных и человека, а также опу-(оли из этих тканей (лимфомы, саркомы, мышечные опухоли) и раки вдщавода, молочной келезы, яичников и полости рта человека. Ио-зледоввли также культуры клеток куриных эмбриональных фиброблас-гов в норме и при заражении онкогеяными онкорна- и герпесвируса-«м,

Материал фиксировали в 2,5$ растворе глутарового альдегида с цофиксециай в 1% растворе четырехокиси осмия не фоофатном буфере л обезвоживали в спиртах возраетаицей крепости.

Для сканирующей электронной микроскопии образин готовили по общепринятой методике (Ровенокий, 1979). Фиксированный и обезволенный материал высушивали методом перехода критической точки Со_г ffa приборе DK-1. Далее образны монтировали на дшралевие держатели и покрывали слоем платины в установке для ионного напыления IB-5 (оба прибора фирмы Хитачи, Япония).

Материал для просвечивающей электронной микроскопия задирали в епон, получали лолутонкие ср*<зы на ультратоме ИСВ III и окрашивали их тилуидшювнм синим. После выборе подходящего учнеткя тка-ни проводили прицельную здточку блоков, получали ультрмтонкие срезы на том ж» ультратом» и контрастировали их цитратом свинца по Рейнольдсу.

TtpHT'OTofvi'uHime нреіш[шіи иоі-лидорпли о помощью (<'пич*>і;к«'іч>

- 12 -микроскопа МВЙ-І5 в просвечивающем и отраженном режимах. Поверхность клеточных мозаик исследовали с помощью сканирующих микроскопов JSM Т-ЗОО (Япония), Camsoan. 4 (Англия) и BS 340 (ЧССР). Ультратонкие срезы исследовали с помощью просвечивающих микроскопов <лм 7а фирмы JEOli, Япония, и BS 540 фирма Тевіа (ЧССР).

Для изучения количественных показателей мозаик подсчитывали их клеточный состав и связность как на екране микроскопа, так л на фотографиях. С каждого участка подсчитывали по^ІОО - 300 клеток. Результаты обрабатывали с помощью обычных методов биометрии (Лакин, 1973). Для определения состава и структуры тканевых функ-ционов клеточная мозаика аппроксимировалась правильной моделью, е которой по правилам кристаллографии выделялась элементарная ячейка. Клеточный состав и связность ячейки и отражали состав и структуру ее функциона.