Исследование механизмов регуляторного и токсического действия нитритов и NO-генерирующих веществ в биологических системах Реутов, Валентин Палладиевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Нитросоединения (нитраты, нитриты и оксиды азота) широко используются в различных отраслях промышленности, в агрохимии и фармакологии. В организм человека эти вещества поступают вместе с воздухом, водой, продуктами питания и лекарственными препаратами. В последние годы стало известно, что эти соединения способны также эндогенно синтезироваться в живых организмах из L-аргинина. В качестве промежуточного соединения в этой реакции образуется оксид азота (N0) -чрезвычайно важный регулятор, участвующий во внутри- и межклеточной сигнализации и способный оказывать свое влияние на многочисленные процессы в клетках и в организме (А.Н. Саприн и др., 1968-2002; М.К. Пулатова и др., 1985-2003; З.В. Куроптева и др. 1985-2004; А.А. Каменский, К.В. Савельева, ВА Дубынин, И.П. Ашмарин, 1994, 1996, 2002; В.Б. Кошелев, А.Л. Крушинский, B.C. Кузенков, 1999; А.С. Пивоваров, У. Эхидо-Вилларреаль, 1995; СМ. Струкова, Б.А. Умарова, Т.Н. Дугина и др., 1999; А.П. Бонарцев, СА Гаврилова, М.П. Давыдова, А.Б. Постников, НА Медведева, 2001; А.Я. Коц, МА Графов, И.В. Овчинников, А.С. Куликов, Ю.В. Хропов, Т.В. Буларпша, 1998; М. Mori, Т. Gotoh, 2000; P. Sarti et al, 2000). В 1992 г журнал "Science" назвал NO молекулой года, а в 1998 г трое американских исследователей Р. Фурчготт, Л. Игнарро и Ф. Мурад были удостоены Нобелевской премии за "открытие роли оксида азота как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы" (R.F. Furchgott, I.V. Zawadzki, 1980; L.J. Ignarro et al, 1987-2000; F. Muradetal, 1978-1994; R.M.J. Palmer et al, 1987; S. Moncada et al., 1987 - 1991). Однако проблема NO в биологии и медицине, как правило, изучается отдельно от проблемы нитросоединений, синтезирующихся эндогенно, или поступающих вместе с воздухом, водой и пищевыми продуктами, способных высвобождать NO, и, тем самым, оказывать

воздействие на организм человека и животных (П 1 Fluthu, Tf G finrrturr. 1977,

Г РОС НАЦИОНАЛЬНА» і
I БИБЛИОТЕКА !

І СПтрбгрг І-ДЛ{

\ о» WO^Mti/ЧЛЇ

1979; R. Kahl, et al, 1978; H.G. Shertzer, G.B. Duthu, 1979; R.H. Morse, S.I. Chan, 1980; A. Tomoda et al., 1997; J.A. Wingrow, P.H. OTarrell, 1999).

Отсутствие целостного понимания взаимосвязанных задач и проблем затрудняет дальнейший прогресс и в частных исследованиях проблемы N0 (А.В. Турин, В.Н. Турин, 1994-2003; В.В. Зинчук, 1999; В.А Кульчицкий, СВ. Кульчицкий, 1998; В.Г. Башкатова, К.С. Раевский, 1996-2000; И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина, 1994-2004; И.И. Степуро, 1997; АГ. Чумак, 2003; АА. Мойбенко, В.Ф. Сагач, 1998-2004; A.R Гоженко, 1997-2004; АЛ. Зефиров, 1998-2004; АХ. Уразаев, 1995-1999). Таким образом, становится очевидным, что наши представления о роли NO в биологических системах представляют совокупность неполных и разрозненных объяснений, характерных для данного уровня знаний.

За последние 30 лет проблема воздействия нитросоединений на организм человека и животных приобрела, по крайней мере, три аспекта: регуляторный, фармакологический и токсикологический (М.Р. Doyle et al., 1981, 1982; Н. Kosaka, et al, 1979; AV. Kozlov et al, 1999; A. Tomoda, et al, 1997; M. Mori, T. Gotoh, 2000). Вместе с тем показано, что характер воздействия нитросоединений (от регуляторпого до токсического) прежде всего, зависит от дозы вещества, поступившего в организм человека или животного. Поэтому также имеется внутренняя логика в том, чтобы механизмы токсического и регуляторного действия нитритов не противопоставлялись друг другу, а изучались в контексте указанных выше двух больших проблем современной биологии и медицины - нитратно-нитритной и NO.

Изучение проблемы NO в биологических системах в России начали почти одновременно две группы исследователей: Л.А Блюменфельд, АФ. Ванин и P.M. Налбандян - первая группа и вторая группа - Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин, и Е.И. Никишкин. Достижение первой группы состояло в том, что, входящие в эту группу исследователи, впервые обнаружили в пекарских дрожжах парамагнитные центры, характеризующиеся сигналом ЭПР с g^A, ~ 2,03. Основное достижение второй группы состояло в том, что они обнаружили новые сигналы в крови и тканях крыс после введения им NaN0₂ и, основываясь на результатах модельных исследований Горди и Рексроуда (1961), назвали парамагнитные комплексы, ответственные за эти сигналы, нитрозильными комплексами железа. В дальнейшем результаты своих исследований Я. И. Ажипа, Л.П. Каюшин и Е.И. Никишкин зарегистрировали в Госкомитете по делам открытий и изобретений как научное открытие за №148. Интерес к этим комплексам возрос после того, как было установлено, что образование их резко увеличивается при канцерогенезе, токсикозах, а также при воздействии анестетиков (АН. Саприн, Т.С. Шуляковская 1968, 1969; А.Н. Саприн, 1974; Л.В. Вахнина, Э.К. Рууге, 1972; Е.П. Сидорик, 1973-1981; АФ. Ванин и соавторы, 1971-1975; М.И. Кузин и соавторы, 1971; В.Л. Шарыгин и соавторы, 1971-1979, М.К. Пулатова и соавторы, 1985-2003, З.В. Куроптева и соавторы, 1985-2001). Однако механизмы образования NO из N0₂" и локализация мест восстановления нитритных ионов в оксид азота в организме млекопитающих оставались в значительной степени не выясненными (Н. Kosaka, et al, 1979; R.

Kraszyna, et al, 1987; A.V. Kozlov et al, 1999; J.M. May et al, 2000; A. Tomoda, et al, 1997). Более того, "популярность" молекулы N0 в биологических системах отодвинула на задний план продукты превращения этой молекулы -N0₂ и N0₃\ Поэтому проблема восстановления ионов N0₂ в N0 в организме млекопитающих, в основном, оставалась вне поля зрения исследователей. В отдельных же работах, посвященных токсическому, фармакологическому или регуляторному действию нитритов в явной или в неявной форме предполагалось, что ионы N0₂ превращаются в N0 неферментативным путем (J.L. Zweieretal., 1995; 1999).

Вместе с тем, весьма актуальными для фармакологии, токсикологии и биохимии были следующие задачи: 1) локализация мест восстановления ионов N0₂ в N 0; 2) идентификация ферментов и ферме 1ггных систем, которые могли бы принимать участие в восстановлении ионов N0₂ в N0; и, наконец, 3) выяснение факторов, которые могли бы влиять на интенсивность превращения hohobNO₂~bN0.

Цель работы состояла в обнаружении, выяснении и анализе основных закономерностей, которые определяют широкий спектр токсического и регуляторного действия нитритов, а также в изучении механизмов восстановления ионов N0₂ в N0 в крови и тканях млекопитающих и анализе роли реакции восстановления нитритов в N0 в осуществлении регуляторного и токсического действия нитритов в организме животных.

В задачи работы входило:

1) выяснить, почему нитриты обладают широким спектром действия на
организм млекопитающих, проявляющимся, практически на всех структурно-
функциональных уровнях;

2) исследовать роль реакции восстановления ионов N0₂ в N0 в механизме
токсического действия нитритов;

1. локализовать места восстановления нитритных ионов в N 0;

2. идентифицировать ферменты или ферментные системы, которые могли бы принимать участие в восстановлении ионов N0₂ в N 0;

5) исследовать факторы, которые могли бы влиять на интенсивность
восстановления ионов N0₂ в N0.

6) изучить механизмы восстановления ионов N0₂ в крови;

7) выяснить факторы, влияющие на образование и распад комплексов
гемоглобина с N 0;

8) изучить механизмы восстановления ионов N0₂ в тканях;

9) проанализировать и обобщить известные данные об оксиде азота и
продуктах его метаболизма с полученными нами данными о роли
нитритредуктазной активности в крови и тканях млекопитающих в виде повой
концепции, позволяющей более глубоко понять роль NO-сшггазной и
нитритредуктазной систем в живых организмах.

Рабочие гипотезы. Впервые в середине 70-х гг. автором диссертации было высказано предположение, что основное токсическое действие нитритов на организм животных и человека связано с превращением ионов N0₂ в NO (В.П. Реутов, Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин, 1975-1978). Именно образование N0 и

N0₂ из нитритных ионов, согласно нашей гипотезе, запускает развитие многочисленных регуляторных и токсических эффектов, после поступления нитритов в организм. Эта рабочая гипотеза проверялась нами на протяжении почти 30 лет, как в наших собственных экспериментах, так и в экспериментах, проведенных нами с другими исследовательскими группами на различных биологических моделях: эритроциты крови крыс, митохондрии печени и почек крыс, зернистые клетки мозжечка крыс, мыши A/Snell и гибриды F1(C57B1XCBA), крысы линии Wistar, нейроны мозжечка крыс Wistar, лягушки Rana temporaria и нейроны улитки Helix Lucorum. В указанных выше экспериментах наша рабочая гипотеза была подтверждена, что нашло отражение в совместных публикациях. В настоящее время благодаря работам западных исследователей стало известно, что оксид азота, взаимодействуя с супероксидом, способен образовывать ионы пероксинитритов - ONOO", которые после протонирования (ONOO + Н⁺ —> ONOOH) способны распадаться с высвобождением высокореакционных молекул диоксида азота (N0₂) и ОН-радикалов (ONOOH N0₂ + ОН). Таким образом, наши данные о важной роли N0 и Ж>2 в механизме токсического действия нитритов (В.П. Реутов и др., 1978 а,б) также нашли свое подтверждение в работах зарубежных исследователей, опубликованных в 90-х гг. XX в. и в начале XXI в.

В связи с тем, что многочисленные данные литературы указывали на то, что дефицит кислорода в организме (гипоксия, ишемия, анаэробиоз) является необходимым условием для образования комплексов, ответственных за сигнал ЭПР с g-фактором 2,03 (Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин, Е.И. Никишкин, 1966; 1967; 1983; А.Ф. Ванин и соавторы, 1965-1975; А.Н. Саприн, Т.С. Шуляковская, 1968, 1969; АН. Саприн, 1974; Т.С. Шуляковская, 1973; Е.П. Сидорик, 1973-1981; М.И. Кузин и соавторы, 1971; В.Л. Шарыгин и соавторы, 1971-1979, М.К. Пулатова и соавторы, 1985-1999, З.В. Куроптева и соавторы, 1985-2001), можно было предположить, что нитриты конкурируют с теми восстановителями, которые связывают кислород. Среди кислородсвязывающих компонентов клеток основными являются гемсодержащие белки. В связи с этим требовалось проанализировать по данным литературы эволюционные аспекты гемсодержащих белков. И, если гемсодержащие белки, способные связывать кислород, могли когда-либо в процессе эволюции жизни на Земле участвовать в переносе электронов на нитриты, то в качестве рабочей гипотезы можно было бы предположить возможность участия гемсодержащих белков в восстановлении ионов N02* в NO. Кроме того, интересно отметить, что именно гемоглобин, который относится к гемсодержащим белкам, способным связывать кислород, является мишенью токсического действия нитритов и способен ими окисляться. В то же время хорошо известно, что в тех реакциях, где имеет место окисление одпих веществ, можно предполагать возможность восстановления других веществ. Анализ механизмов восстановления ионов N0₂ в NO в организме млекопитающих позволил дополнить цепочку превращения L-аргинина —> NO— N0₂/N0₃" нитритредуктазным звеном N0₂ — NO, что позволило сформулировать принципиально новую концепцию цикла оксида азота (В.П. Реутов, 1992-2003).

Концепция. Впервые на основании обобщений экспериментальных данных литературы и собственных результатов исследований, а также анализа существующей системы принципов, концепций и теорий сформулирована принципиально новая концепция, согласно которой нитритредуктазные реакции с участием гемсодержащих белков, находящихся в дезокси-форме, способны замыкать цепочку превращений: L-аргинин -> NO -> NCV/NCb* в цикл, который был нами назван циклом оксида азота (В.П. Реутов, 1992-2003). Эта концепция позволяет объяснить целый ряд экспериментальных дшгаых и хорошо согласуется с современными представлениями о нитратном дыхании как предшественнике кислородного дыхания и с эндосимбиотической гипотезой происхождения митохондрий. Эта концепция также дополняет и расширяет совремешіьіе представления о биохимическом единстве всех живых организмов - от микроорганизмов до млекопитающих, а также о единстве основных принципов организации живой материи. Дальнейший анализ структурпо-функционального единства NO-синтазных и нитритредуктазных систем позволил еще раз убедиться в том, что живые организмы в самой организации ферментных систем и метаболических путей хранят информацию о своем эволюционном происхождении. В настоящее время концепция цикла оксида азота получила подтверждение в работах зарубежных и отечественных исследователей (J. Millar, 1995; Ю.В. Данилович, 2001; В.Н. Коробов, 2003). Анализ концепции цикла оксида азота с позиций принципов симметрии, а также анализ данных литературы, позволил сформулировать новый биологический принцип - принцип циклической организации метаболических процессов (или принцип цикличности). Этот принцип открывает перспективы как для постановки новых задач и проведения экспериментов, так и для более глубокого понимания уже имеющихся экспериментальных данных. Он также позволяет осуществить преемственную связь между уже существующими идеями, концепциями, принципами и только еще возникающими, а также дает ответы на некоторые вопросы, поставленные физиологом Л.А. Орбели и математиком А. Пуанкаре, работы которого оказали значительное влияние на развитие биофизики. Таким образом, можно ожидать, что этот принцип позволит более глубоко понять, каким образом осуществляется взаимосвязь между различными структурно-функциональными уровнями, и тем самым, позволит с единых позиций рассмотреть некоторые аспекты живых систем, которые изучают физиологи и биофизики.

Научная новизна. Впервые высказана гипотеза, показано и обосновано, что в основе многообразных токсических эффектов нитритов, имеющих место на различных структурно-функциональных уровнях, может лежать реакция превращения ионов N0₂ в NO. Лишь после образования NO из ионов N0₂ возможно протекание дальнейших реакций, в ходе которых могут образовываться еще более реакционные соединения. Данные, полученные нами, как указывалось выше, нашли многочислашые подтверждения после того, как стало известно, что оксид азота способен в присутствии супероксидных анион-радикалов превращаться в пероксинитрит, который, в

свою очередь, распадается с образованием ОН-радикалов и свободно-радикального соединения N0₂.

Впервые показано, что ионы N0₂ восстанавливаются в крови при участии гемоглобина и тех систем, которые поддерживают его в восстановленном состоянии. Нитритредуктазные свойства гемоглобина значительно повышаются в отсутствие кислорода. Впервые установлено, что кислород, связанный с гемоглобином, ингибирует процесс восстановления ионов N0₂ в N0 (В.П. Реутов и др., 1983). Взаимодействие дезоксигемоглобина с ионами N0₂ приводит к образованию только R-конформеров Hb-NO комплексов (Я.И. Ажипа, В.П. Реутов, Л.П. Каюшин, 1983). В такой форме N0 может транспортироваться на относительно большие расстояния в организме и вместе с током крови доставляться в те органы и ткани, которые нуждаются в этом соединении. Впервые предложен механизм транспорта и высвобождения N0 вместе с Hb-NO комплексами (Я. И. Ажипа, В.П. Реутов, Л.П. Каюшин, 1983; В.П. Реутов, 1995; В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, В.Е. Охотен, Н.С. Косицын, 1997; 1998).

При физиологических концентрациях оксида азота в крови для высвобождения N0 необходим R->T переход Hb-NO комплексов, который по-видимому осуществляется при участии естественных регуляторов (например, 2,3-дифосфоглицерата, ионов Н⁺, СОг и др.). Одной из причин появления Т-конформеров Hb-NO при относительно высоких дозах нитритов, по-видимому, может быть также частичная денатурация глобина оксидами азота, образующимися при восстановлении ионов N0₂ в тканях. Показано, что оксигенация Т-конформеров Hb-NO комплексов может снижать концентрацию этих комплексов в крови.

Методами ЭПР, спектрофлуориметрии и спектрофотометрии получены новые данные, свидетельствующие о том, что при блокировании дыхательной цепи KCN ионы N0₂ не могут акцептировать электроны и восстанавливаться в N0. Полученные данные указывают на возможность участия ферментов дыхательной цепи митохондрий в восстановлении ионов N0₂". Локализованы места восстановления ионов N0₂ в митохондриях и показано, что ионы N0₂ могут акцептировать электроны с терминального участка дыхательной цепи -цитохромоксидазы.

Методами полярографии и спектрофлуориметрии показано ингибирующее действие ионов N0₂ на транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий. Обнаружено, что важную роль в этом процессе играет способность N0 образовывать комплексы с негемовым железом митохондрий. Этими же методами установлено разобщающее действие нитритов на окислительное фосфорилирование митохондрий. Эффект разобщения окислительного фосфорилировапия начинал проявляться лишь при высоких концентрациях NaN0₂ (10"³ М и выше) спустя некоторое время (от 30 сек и больше) после добавления этого вещества к среде инкубации. Предполагается, что за разобщение окислительного фосфорилирования ответственны не столько ионы N0₂", сколько накапливающиеся со временем высокореакционные продукты их превращения - N0 и N0₂, которые обладают способностью

участвовать в нитрозировании тирозиновых остатков белков и в свободно-радикальном окислении ненасыщенных жирных кислот.

Методом ЭПР также показано, что при взаимодействии N0₂ с ненасыщенными жирными кислотами и аминокислотой тирозином образуются парамагнитные центры. Предполагается, что ненасыщенные жирные кислоты и тирозгпювые остатки мембранных липопротеиновых комплексов могут явиться своеобразными мишенями, с которыми взаимодействует N0₂, а образование парамагнитных центров в реакции N0₂ с указанными выше веществами -первичным актом повреждения мембран.

Научно-практическая значимость. Настоящая работа является продолжением тех исследований, которые были зарегистрированы Госкомитетом СССР по делам открытий и изобретений как научное открытие за №148. Научная значимость настоящей работы состоит в том, что в ней впервые были представлены данные о ключевых механизмах токсического и регуляторного действия нитритов, сформулированы и обоснованы концепция цикла оксида азота и принцип цикличности. Полученные в работе данные могут быть использованы в клинике при лечении интоксикаций, связанных с поступлением в организм человека и животных нитросоединений. Локализация мест восстановления нитритных ионов указывает на способ регуляции процессом восстановления этих ионов. Оксигенация крови может защитить гемоглобин от окисления ионами NCV и уменьшить концентрацию N0, образующегося в крови в результате восстановления гемоглобином нитритных ионов. С другой стороны, оксигепация крови может существенно снизить концентрацию Т-конформеров Hb-NO комплексов.

Таким образом, проведение оксигемотерапии в клинической практике позволит: защитить гемоглобин от окисления ионами N0₂", уменьшить концентрацию высокотоксичных оксидов азота - N0 и N0₂; уменьшить концентрацию стабильных R- конформеров Hb-NO комплексов.

Поскольку ионы NCV могут акцептировать электроны с дыхательной цепи митохондрий, то уменьшение скорости переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий может явиться благоприятным фактором при интоксикации нитритами. Известно, что снижение энергетических потребностей в организме животных приводит к уменьшению скорости переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий. Поэтому для уменьшения интенсивности восстановления ионов N0₂" в N0, а, следовательно, и для уменьшения токсического действия ионов N0₂", благоприятными мерами могут быть те, которые снижают энергетические потребности организма. Перевод животного в состояние, близкое к физиологическому сну, удовлетворяет тем условиям, которые можно рассматривать как благоприятные. Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что оптимальным состоянием (или близким к нему) при нитритной интоксикации может явиться оксигенация крови в состояния сна.

Основные положения, выносимые на защиту,

1. Превращение ионов N0₂ в N0 является одной из определяющих стадий в реализации механизмов токсического и регуляторного действия нитритов.

2. Ионы N0₂ могут восстанавливаться в N0 в эритроцитах крови с участием гемоглобина, находящегося в дезокси-форме.

3. Ионы N0₂ могут восстанавливаться в N0 в митохондриях в результате акцептирования электронов с терминального участка дыхательной цепи

4. Восстановление ионов N0₂ с участием гемсодержащих белков, находящихся в дезокси-форме, может играть существенную роль при гипоксии, как один из регуляторных механизмов, обеспечивающих вместе с NO-синтазами контроль за содержанием N0 в живых организмах.

Внедрение. Разделы работы, посвященные изучению механизмов восстановления нитритов в оксид азота в крови и митохондриях млекопитающих, и рекомендации по уменьшению токсического действия нитросоединений на организм человека и животных были представлены на ВДНХ СССР в павильоне "Биология", а авторский коллектив (Я.И. Ажипа, Л П. Каюшин, Е.И Никишкин и В П. Реутов) награжден одной серебряной и тремя бронзовыми медалями ВДНХ СССР. Результаты этих исследований также вошли в отчет Президиума АН СССР за 20-летний период (1963-1983) и отнесены к тем работам, которые имеют наибольшее практическое значение. В 1996 г две работы: "Цикл окиси азота в организме млекопитающих" и "Механизмы токсического действия нитратов и нитритов" были представлены Институтом высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН в Президиуме Российской Академии Наук на выставке "Академическая наука -народному хозяйству". Дальнейшие разработки методов диагностики нитратно-нитритных интоксикаций бьши также представлены в Президиуме РАН на выставке "Экология и Здравоохранение" (Москва, 1998) и отнесены к существенным достижениям академической науки в области экологии и здравоохранения. Результаты диссертационной работы использованы как отечественными, так и зарубежными исследователями при обсуждении новых их данных в многочисленных статьях и в 7 книгах.

Результаты диссертациошюй работы, свидетельствующие о том, что при нитратно-нитритных интоксикациях образуются R- и Т-конформеры Hb-NO комплексов, с преобладанием R-конформеров при тяжелых интоксикациях с летальным исходом, приняты Республиканским научным центром по судебной медицине при МЗ России и используются при чтении лекций на кафедрах судебной медицины в медицинских ВУЗах.

Результаты диссертационной работы, свидетельствующие о том, что при гипоксии снижается содержание L-аргинина в сыворотке крови, применяются в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ при анализе слезной жидкости, используемой для ранней диагностики ишемических изменений сетчатки у больных с диабетической ангиоретинопатией. В зависимости от величины этого показателя (он также характеризует и стадию

процесса), при лечении сосудистых заболеваний глаз применяют либо ингибиторы синтеза N0, либо доноры оксида азота, обладающие антиагрегационным и фибринолитическим действием.

Личный вклад автора состоял в планировании, постановке и выполнении экспериментальной работы. Все фрагменты работы, в которых принимали участие студенты-дипломники, лаборанты и научные сотрудники отмечены в диссертации, а в указателе литературы представлены опубликованны совместные статьи. Автору диссертации принадлежит формулировка и обоснование всех концепций и гипотез, представленных в книгах, теоретических и обзорных статьях. Личный вклад автора заключался также в развитии, популяризации и изменении сложившихся теоретических представлений о механизме токсического действия нитритов, метаболизме ионов N0₂ в организме млекопитающих и циклическом превращении оксида азота. Значительная часть статей и книги написаны лично автором диссертации и небольшая часть - при активном его участии вместе с другими соавторами.

Апробация. Основные результаты исследований были представлены и обсуждены на V Международном биофизическом конгрессе (Копенгаген, 1975), на Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Москва, 1977, 1981, 1989, 1991, 1996), на XI Всесоюзном симпозиуме "Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции" (Пушино, 1981), на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982) и 2-ом Всероссийском биофизическом съезде (Москва, 1999), на VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Сыктывкар, 1982), на VII и VIII Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Лейпциг, 1983; Рига, 1985), на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), на Всесоюзной конференции "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" (Пушино, 1989); на Всесоюзном симпозиуме "Канцерогенные N-нитрозосоединения и их предшественники - образование и определение в окружающей среде" (Таллинн, 1990), на 2-м Всесоюзном симпозиуме по экологической онкологии "Образование канцерогенных N-нитрозосоединений в экосистемах" (Киев, 1990), на международных симпозиумах по гипоксии (Берлин, 1991, 1994), на международном симпозиуме "Структура и функция регуляторных полипептидов" (Москва, 1992), на симпозиуме "Проблемы экспериментальной легочно-сердечной недостаточности" (Киев, 1992), на симпозиуме "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, 1993), на конференции "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, 1993), на 11-ом Международном БиофизическОхМ конгрессе (Будапешт, 1993), на XV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Минск, 1993), на специальном FEBS симпозиуме по биологическим мембранам (Хельсинки, 1994), на международном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы активности мозга" (С-Петербург, 1994), на 27-ом Международном Ампер-конгрессе, посвященном 50-летию открытия явления магнитного резонанса (Казань, 1994), на II нейрогистологической конференции, посвященной памяти чл.-корр. АН СССР и АМН СССР Н.Г. Колосова "Колосовские чтения-94" (С-Петербург, 1994), на

международном симпозиуме "Простые нервные системы" (Пущино, 1994), на Первом Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 1996), на международной конференции по ЭПР-спектроскопии оксида азота в биологических системах (Суздаль, 1996), на международном симпозиуме "Свободные радикалы в биологии и медицине" (София, 1997), на ХХХШ международном конгрессе физиологических наук (С.-Петербург, 1997), на 12-й международной конференции Европейского Общества по нейрохимии (С-Петербург, 1998), на 17-м Физиологическом съезде (Ростов, 1998), на международной научной конференции "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1998); на международной конференции, посвящешгай 150-летию со дня рождения И.П. Павлова "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1999), на III Национальном конгрессе патофизиологов Украины (Одесса, 2000).

Результаты исследований были доложены на семинарах и конференциях в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, в Институте проблем передачи информации РАН, Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институте биологической физики СССР (Пущицо), Институте химической физики (лаборатория радиоспектроскопии) РАН, Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева, Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова (кафедры физиологии, высшей нервной деятельности, биофизики), Институте патологической физиологии РАМН, Институте педиатрии РАМН, Институте питания РАМН, Институте мозга РАМН, Институте усовершенствования врачей Минздрава СССР (кафедра патофизиологии), Одесском медицинском университете (кафедра патофизиологии), Институте физиологии НАЛ Беларуси, Шституте физиологии НАЛ Украины им А.А. Богомольца. На конкурсах научных работ доклады и статьи, написанные по материалам диссертации, неоднократно занимали призовые места и были отмечены 1-ой, 2-й и 3-ей премиями.

Диссертационная работа прошла также апробацию в ходе совместных исследований на различных биологических моделях с многочисленными сотрудниками, участие которых отражено в цитируемых публикациях (список работ, опубликованных по теме диссертации). По всем ключевым механизмам, представленным в диссертации, имеются прямые экспериментальные подтверждения в работах других авторов, опубликованных в журналах с высоким индексом цитирования. Многие исследователи проблемы оксида азота смогли более глубоко понять свои экспериментальные данные, проанализировав их с позиций, изложенных в опубликованных статьях. Последнее послужило тому, что идеи, результаты исследований и выводы, вытекающие их этих результатов, получили новый импульс развития в других медико-биологических проблемах, связанных с участием нитритов и оксида азота, как в работах отечественных, так и зарубежных авторов. Материалы, представленные в диссертационной работе, известны специалистам. В настоящее время имеются более 270 ссылок на книги и статьи автора диссертационной работы, опубликованные как в отечественных, так и в зарубежных изданиях, в том числе и в журналах с высоким индексом

цитирования ("Cell" (1999. Vol.98. P.105-114), J. Biol. Chem. (2002. Vol.277. №50. 48472-48478), PNAS (2003. Vol.100. №2. P.461-466), FEBS Letters (1999. Vol. 453. P.229-235), Toxicol. Letters (2001. Vol. 121. P.57-61. и др.). На книгу "Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих" М.: Наука, 156 с. в журналах "Успехи современной биологии" (1999. Т.119. №4. С.414); "Успехи физиологических наук" (1998. Т.29. №4.С.Ю8.) и в "Журнале эволюционной биохимии и физиологии (1999. Т.35. №4. С.339-340) опубликованы рецешии известных ученых с положительной оценкой концепции и основных ее положений. Опубликованы также положительные рецензии известных ученых и на книгу "Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности. Ретроспективный анализ идей, принципов и концепций." (1000 экз.) М.: Издательство научной и учебной литературы, Едиториал УРСС. 2003. 96 с. ("Успехи физиологических наук" (2004. Т.35. №1. С. 109), "Успехи современной биологии" (2004. Т.224. №1. С...).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 182работы. среди них 2 книги: "Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих" М.: Наука, 156 с. (тираж 1000 экз. в 1997 г. и 500 экз. в 1998 г.) и "Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности. Ретроспективный анализ идей, принципов и концепций. М.: Издательство научной и учебной литературы. Едиториал. УРСС. 2003. 96 с. (тираж 1000 экз); 2 брошюры: Бердиев У.Б., Кузнецов Ю.П., Куклин М.Г., Реутов В.П., Шекшеев Э.М. "Моделирование спектров ЭПР парамагнитных центров крови на персональных ЭВМ типа IBM PC/XT/AT. М.: Институт химической физики АН СССР, 1989, 31с; Реутов В.П., Гоженко А.И., Насибуллин Б.А, Доломатов СИ.. Косицын Н.С. Анализ циклических процессов с участием оксида азота в организмах и молекулярного азота в биосфере с позиций голографического принципа и принципа цикличности. Одесса: Одесский медуниверситет. 2003. 66 с; 54_ статьи (26 из них переведены и опубликованы на английском языке) и 124 кратких сообщения в журналах, книгах и сборниках. Основные статьи автора диссертационной работы, представленные в рецензируемых журналах: "Биохимия" (5 статей); "Доклады АН СССР и РАН" (7 статей); "Известия АН СССР, сер. биол." (2 статьи); "Бюлл. эксперим. биол. и мед." (2 статьи); "Физиология человека" (3 статьи); "Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова" (1 статья); "Вести национальной академии наук Беларуси" (News of Biomedical Sciences - 5 статей), "Биол. мембраны" (2 статьи), "Экспериментальная онкология" (Experimental oncology - 1 статья) переведены и опубликованы на английском языке. В 30 публикациях (статьях и книгах) соискатель является первым автором. В системах Интернета (Google), Пабмеда (PubMed) и Медлайна (Medline) имеются данные о более 100 публикациях автора и цитировании его работ (Reutov V.P., Reutov Valentin Р., Реутов Валентин П.) по ключевым словам NO, Nitric Oxide, EPR, ESR, Nitrite, Cyclicity Principle, Hypoxia.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (гранты№№94-04-11950,98-04-48679,00-04-48412)

Систематизированы данные литературы относительно механизмов токсического и регуляторного действия нитритов и NO-генерирующих соединений на организм млекопитающих [1,2, 10, 12]. Обобщены результаты исследований по механизмам восстановления нитритов в N0 [10, 17, 18], а также данные литературы о механизмах синтеза N0 из L-аргинина [1, 22]. Сформулирована цель диссертационной работы и осуществлена постановка задач, в ходе решения которых должна быть достигнута основная цель исследований. Как указывалось выше, основная цель диссертационной работы состояла: 1) в обнаружении, выяснении и анализе основных закономерностей, которые определяют широкий спектр токсического и регуляторного действия нитритов; 2) в изучении механизмов восстановления ионов N0₂ в N0 в крови и тканях млекопитающих и 3) в анализе роли реакции восстановления нитритов в N0 в осуществлении регуляторного и токсического действия нитритов в организме животных [1,2,27,35].