Исследование электрохимического механизма влияния ГАМК на спинальные нейроны миноги Цветков, Евгений Александрович

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В середине 50-х годов были получены первые сведения об участии ГАМК в торможении нейронов ЦНС позвоночных животных (см. обзор Roberts et al., 1976), в связи с чем в последующие десятилетия начались всесторонние исследования функциональной роли этой аминокислоты и механизмов ее действия. Было установлено, что в ЦНС различных представителей позвоночных и беспозвоночных животных имеются как минимум два типа ГАМК-рецепторов: бикукуллин-чувствителъные ГАМКа- и бикукуллин-нечувствительные ГАМКб-рецепторы (Bowery et al., 1980). В настоящее время имеются также данные о том, что ГАМКв-рецепторы опосредуют в основном пресинаптическую модуляцию синаптической передачи, в то время как ГАМКд-рецепторы могут быть ответственны как за постсинаптическое, так и за пресинаптическое действие ГАМК (обзор: Matsumoto, 1989).

В 80-х годах при использовании биохимических методов ГАМК была идентифицирована в спинном мозге миноги (Ногата, 1983). На интер- и мотонейронах спинного мозга миноги было показано, что эта аминокислота активирует бикукуллин-чувствителъные ГАМКл-рецепторы и ассоциированные с ними хлорные каналы, за счет чего оказывает тормозное действие на эти клетки (Homma & Rovainen, 1978; Сафронов и др., 1989). В начале 90-х годов были получены первые факты об участии ГАМК в модуляции локомоторной активности спинного мозга миноги (Alford et al., 1990) и сделано предположение, что модулирующее действие этой аминокислоты связано с активацией пресинаптических ГАМК-рецепторов (Alford et al., 1991). Основанием для такого предположения явились следующие факты. Было показано, что ГАМК, баклофен и мусцимол, вызывают деполяризацию аксонов интернейронов и модулируют активность, связанную с локомоторным ритмом (Alford et al., 1991). ГАМК подавляет Са²⁺-компонент потенциалов действия (ПД) в соме (Leonard & Wickelgren, 1985; 1986) и отростках первичных афферентных клеток (Alford & Grillner, 1991), которые в спинном мозге миноги представлены дорсальными чувствительными клетками (ДЧК) (Martin & Wickelgren, 1971). Показано также, что ГАМК и баклофен уменьшают амплитуду моносинаптических ВПСП, вызванных в интер- и мотонейронах

стимуляцией ДЧК. При этом мембранный потенциал (МП) и входное сопротивление в постсинаптических клетках не изменялось (Christenson & Grillner S, 1991). Позднее было показано депрессирующие влияние баклофена (агониста ГАМК) на Са²⁺-ток в мотонейронах и интернейронах спинного мозга миноги (Matsushima et al., 1993). В пользу предположения о возможности пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых и участия в этом процессе ГАМК свидетельствовали также данные морфологов, поскольку методами иммуноцитохимии было показано, что ГАМК локализована в основном в дорсальных отделах спинного мозга (Batueva et al., 1990) и, что ГАМК-иммунопозитивные терминали контактируют с волокнами дорсальной колонны, в которой находятся, в основном, ДЧК и их отростки (Rovainen, 1967; Christenson et al., 1991; Christenson etaL, 1993).

Несмотря на то, что данные, полученные в перечисленных выше работах, свидетельствуют о возможности пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых, до сих пор отсутствуют четкие экспериментальные доказательства того, что ГАМК действует именно на пре-, а не на постсинаптический элемент сенсомоторных синапсов; не достаточно понятен механизм этого влияния и его рецепторное обеспечение, не исследована также роль ГАМКа- и ГАМКв-рецепторов в этом процессе. Между тем вопрос о механизме пресинаптического торможения у круглоротых важен, так как исследования его деталей позволят сопоставить особенности этого механизма у круглоротых и млекопитающих, и тем самым выявить возможные пути совершенствования этого механизма в процессе эволюции.

Учитывая все вышесказанное, мы поставили ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ исследование механизма влияния ГАМК на электрические параметры и ионные токи первичных механосенсорных афферентов (ДЧК) спинного мозга миноги. Поскольку литературные данные свидетельствуют о том, что ГАМК-опосредованное торможение первичных афферентов может быть связано со снижением поступления кальция внутрь клетки (Dunlap & Fischbach, 1981; Desairmenien et al., 1984), то основное внимание в настоящей работе было

5 :осредоточено на исследовании трансмембранного Са²⁺-тока в ДЧК и его модуляции агонистами и антагонистами у-аминомасляной кислоты.

Для достижения указанной выше цели были поставлены следующие ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАЧИ:

1. В условиях препарата изолированного мозга исследовать действие ГАМК на электрические параметры мембран сомы и отростков ДЧК. Выяснить, вызывает ли аппликация ГАМК деполяризацию сомы или отростков ДЧК, которая может свидетельствовать о наличии первичной афферентной деполяризации (ПАД), наблюдаемой во время пресинаптического торможения в спинальных нейронах высших позвоночных животных.

2. Исследовать трансмембранные ионные токи (Na⁺, К⁺, Са²⁺) полностью изолированных ДЧК и изучить влияние на них у-аминомасляной кислоты.

3. Исследовать влияние агонистов и специфических антагонистов ГАМК на трансмембранный кальциевый ток в ДЧК и на основании фармакологических свойств определить тиц ГАМК-рецепторов, обеспечивающих модуляцию Са²⁺-тока.

4. На основании полученных данных сформулировать представление о возможном механизме пресинаптического торможения в афферентных путях спинного мозга круглоротых.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. В условиях препарата изолированного спинного мозга миноги на основании того, что ГАМК не изменяет амплитуду ПД ДЧК, не влияет на уровень МП и на входное сопротивление мембран этих клеток, было сделано заключение об отсутствии ГАМКл-рецепторов на мембранах ДЧК. Обнаруженные в большинстве ДЧК изменения длительности ПД были неодназначными и столь незначительными, что не позволяли сделать достоверный вывод относительно подавления ГАМК одного из компонентов ПД. На полностью изолированных ДЧК впервые исследованы кинетические параметры и фармакологические свойства основных потенциал-образующих токов (Na⁺, К⁺, Са²⁺). Показано, что несмотря на

большую разницу в уровне эволюционного развития между круглоротыми и высшими позвоночными животными, свойства потенциал-активируемых каналов для ионных токов, определяющих функциональные характеристики нервных клеток, являются сходными. Исследование фармакологических характеристик трансмембранного Са²⁺-тока в изолированных ДЧК подтвердило, что ГАМК уменьшает пиковую амплитуду входящего Са²⁺-тока, следствием чего может быть уменьшение выделения медиатора в сенсо-моторных и сенсо-интернейрональных синапсах. Показано, что действие ГАМК на Са²⁺-ток опосредуются ГАМКв-рецепторами. Агонисты ГАМК для ГАМКд-рецепторов не влияют на амплитуду Са²⁺-тока. Антагонисты ГАМК для ГАМКв-рецепторов (2-гидросаклофен и 5-амино-п-валериановая кислота) блокируют эффекты ГАМК и баклофена (агониста ГАМК для ГАМКв-рецепторов). При использовании метода иммуногистохимического выявления ГАМК в сочетении с методикой внутриклеточной окраски ДЧК пероксидазой хрена, впервые на электронно-микроскопическом уровне показано, что ГАМК-иммунопозитивные терминали образуют плотные контакты (типа "прилегания") с меченными пероксидазой хрена отростками ДЧК. Эти прилегания могут быть морфологическим субстратом пресинаптического торможения первичных сенсорных афферентов у миног.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования представляют интерес для общей нейрофизиологии, нейробиологии и физиологии нервной клетки. Они вносят существенный вклад в понимание механизма пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых и расширяют имеющиеся представления о принципах функциональной организации межнейронных синаптических связей в центральной нервной системе позвоночных, в частности, у миног. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов регуляции активности сенсорных афферентов спинного мозга миноги, которая как известно, играет важную роль в координации работы локомоторной сети, обеспечивающей движение у миног. Результаты настоящей

7 эаботы могут быть использованы для дополнения и уточнения имеющихся гейрональных моделей генератора локомоторного ритма у миног и могут быть юлезны для понимания процессов сенсомоторной координации движений у фугих позвоночных животных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены и
эбсуждены на следующих научных собраниях: Конференции молодых
физиологов и биохимиков "Биохимические и биофизические механизмы
физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995 г.); на 1(Х1)

Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996 г.); на ХХХШ Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.); на |7й Европейской зимней конференции по нейронаукам [Мюнхен, 1997 г.)

ПУБЛИКАЦИИ: Основные результаты диссертации отражены в десяти

публикациях

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ: Диссертация состоит из введения, 4 глав,