Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение.синапткческих механизмов деятельности мозга позволяет выяснить ряд важнейших теоретических и прикладных вопросов, таких как взаимодействие процессов возбуждения и торможения, пластичность центральной нервной системы при адаптивных перестройках в условиях быстро меняющейся внешней среды, позволяет объяснить многие аспекты нормальной высшей нервной деятельности и патологии мозговых процессов /Sherrington, 1920; Hebb, 1949; Eccles, 1953; Kandell, 1976; Шаповалов, 1979; Батуев, 1931/. Особенно интенсивно идет развитие представлений о химической передаче в центральных синапсах, использующих глутамат (Глу) в качестве нейромедиатора /Streit 1984; McCormlck, 1992; Morris, Davis, 1994; Hollmann, Heinemann, 1994/. В течение 30 последних лет было накоплена большое количество физиологических, анатомических и фармакологических данных, указывающих на то, что большинство нервных клеток в коре головного мозга млекопитающих, а также нейроны релейных ядер таламуса, образующих основные сенсорные пути в кору, являются глутаматергическими /Тsumoto. 1990; Kicks et al., 1991/. Однако, существующие данные о синаптической рели Глу в кере недостаточны, так как до настоящего времени собственно синаптические структуры коры в силу технических препятствий, не могли быть объектом единого морфофункционального исследования.
Открытиями последних лет в области молекулярно-нейробиологи-чееккх исследований стали определение структуры белкоз-субьедкнпц Глу рецепторов, идентифицированных ранее только по фармакологическому действию структурных аналогов глутамата: КМДА, АКРА, каи-ната и др. Медико-биологическое значение каждого из открытых классов Глу рецепторов подробно изучается и охватывает широкий спектр функций мозга. Например, было доказано, что ЖДА рецепторы вовлечены в формирование долговременной пстенциации в гиппскакпе, часто рассматриваемой в качестве достоверной синаптической модели механизма памяти в ЦНС /Bashir et al.. 1994/. НМДА рецептор играет ключевую рель в синаптической передаче в раннем онтогенезе и обеспечивает поздние компоненты синаптической передачи во взрослом состоянии /Salt., 1994/, тогда как АМРА рецептор специализирован для быстрой синаптической передачи возбуждения /Armstrong-James et al., 1993/. Считается, что центральный синапс со-
- г -
держит оба типа рецептора, однако прямого доказательства ко-лока-лизации АМПА и НМДА рецепторов до настоящего времени не имелось. Рецепторы Глу активируют нейротоксические процессы, сопряженные с синаптическим выделением Глу при различных патологиях, например при ишемии мозга /Herrling, 1994; Clark et al., 1994/. Большинство патологических эффектов прежде связывалось с проницаемыми по кальцию НМДА рецепторами, однако, в настоящее время появились данные, указывающие на возможное участие АМРА рецепторов, также вследствие их потенциальной проводимости по кальцию. Исследования ближайшего будущего должны показать насколько дивергентная природа Глу рецепторов найдет отражение в разнообразии функций корковых нейронов.
Нейроанатомические и нейрохимические исследования коры больших полушарий в ряду представителей млекопитающих свидетельствуют об общем плане клеточной композиции и принципиально сходном нейрохимическом фенотипе неокорковых зон /Jones. 1981, 1986/. Возбуждающие нейроны коры, в основном, это пирамидные нейроны, которые посредством аксонных коллатералей дают начало глутаматергическим корково-корковым связям /Conti et al., 1987/. Тормозные нейроны в коре представлены несколькими классами непирамидных клеток, преимущественно ГАМК-ергических. В ряде физиологических исследований было показано что пирамидные и непирамидные нейроны обладают различной реактивностью на синаптическое действие Глу при активации близлежащих пирамидных нейронов или других корковых связей /Hab-litz. Sutor, 1990; Hestrln, 1993; Thomson et al., 1993 a, 6/.
Взаимодействие тормозных и возбуждающих клеток особенно ярко выражено в корковых механизмах сенсорного восприятия, таких как распознавание физических признаков сенсорного сигнала /Sillito, 1977; Batuev et al.. 1989/. Электрофизиологические и фармакологические данные указывают на то, что афферентная активация нейронов сенсорной коры сопровождается выделением Глу /Tamura et al.. 1990; Hicks et al.. 1991/ и приводит к распространению как возбуждения, так и торможения /Jones. 1981/, предположительно через соответственно глутаматергические и ГАМК-ергические синаптические связи. Данное положение о пост-афферентном распространении возбуждения в коре с обязательным подключением ГАМК-ергического торможения особенно ярко было показано в экспериментах с отдаленной микроэлектрофоретической аппликацией Глу, наиболее адекватно имитирующей глутаматергическую афферентную активацию /Александров и др., 1982, 1983/, При этом функциональные свойства нейронов коры
достоверно меняются, например, клетки коры приобретают свойства нейронов-детекторов /Александров и др., 1986; Батуев и др., 1S87/. Однако -прежние данные по внутрикорковой активации на ин-тактной коре нуждались в подтверждении на'препарате-изолированной коры.
Комбинирование экспериментальных подходов молекулярной биологии Глу рецептора с современными представлениями о возбуждающих и тормозных типах нейронов в ЦНС пока было возможно только в работах, проделанных в условиях in vitro, на ранних стадиях онтогенеза мозга /Geiger et al., 1995/. Существует очевидная необходимость интегрирования последних достижений в молекулярной нейроби-ологии Глу и глутаматных рецепторов и традиционных анатомических и физиологических in vivo подходов.
Цель исследования - Целью настоящей работы явилось комплексное изучение синаптической организации глутаматергических связей коры, включая: а) физиологическое доказательство существования внутрикорковых возбуждающих и тормозных связей, активируемых глу-таматом; б) анатомическую идентификацию глутаматергических тала-мо-корковых и корково-корковых синапсов на корковых нейронах; в) выявление природы Глу рецепторов на возбуждающих и тормозных нейронах коры и определение особенностей синаптической локализации Глу рецепторов на мембране корковых нейронов.
Задачи исследования:
-
Изучение реактивности корковых нейронов к отдаленной мик-рсэлектрофоретической аппликации Глу в условиях in vivo, в изолированной по методу Сентаготаи полоске сенсомоторной коры.
-
Сравнительное изучение содержания Глу и особенностей анатомических свойств идентифицированных аксонных терминалей в коре.
-
Микроскопическое исследование особенностей клеточного, субклеточного и синаптического распределения субъединиц АМПА- и ККЛА-селективных Глу рецепторов в соматической коре.
Основные положения выносимые на защиту. На основе анализа динамики реагирования корковых нейронов на отдаленную аппликацию Глу в деафферентированнои коре делается вывод о существовании Глу-активируемкх возбуждающих и тормозных внутрикорковых связей. Ка примере популяции синаптических терминалей IV слоя коры доказывается положение о медиаторной роли эндогенного Глу в основных афферентных входах на корковые нейроны: таламо-корковых и корково-корковых. На основе данных по распределению субъедкниц АМПА Глу рецепторов на пирамидных и непирамидных ГАМК-ергических ней-
ронов делается вывод об особых синаптических свойствах тормозных нейронов коры. Описывается синаптическое распределение АМПА и НМДА рецепторов.
Научная новизна исследования:
-
Впервые проведено электрофизиологическое исследование на изолированном препарате коры с использованием отдаленной микроэ-лектрофоретической аппликации Глу, при этом доказана внутрикорко-вая природа возбуждения и торможения, вызываемых данным воздействием.
-
Впервые исследовалось содержание эндогенного Глу в идентифицированных таламо-корковых и корково-корковых синаптических терминалях. Настоящая работа представляет собой первое исследование синаптического содержания Глу в таламо-корковой сенсорной системе.
-
Впервые изучалась ко-локализация субъединиц АМПА типа глутаматного рецептора на идентифицированных ГАМК-ергических нейронах у взрослых животных. Установлен факт, что ГАМК-ергические нейроны в коре могут иметь проницаемую по кальцию форму АМПА рецептора.
Теоретическое и практическое значение работы: Полученные результаты дополняют существующие научные представления в нейро-биологйи коры головного мозга млекопитающих. Данные по реактивности нейронов к искусственно подводимому Глу находят подтверждение в реальном содержании эндогенного Глу в корковых синапсах, как таламо-корковых, так и корково-корковых. Полученные сведения расширяют представление о механизмах, лежащих в основе синапти-ческой рецепции глутамата у различных типов корковых нейронов.
Использованный подход позволяет выявить и оценить роль таких факторов, как уровень Глу в пресинаптической терминали. локализация и конфигурация Глу рецептора на постсинаптической терминали, имеющих ключевую роль в функционировании основного звена корковых возбуждающих связей - глутаматергического синапса. Высокая возможность для разнообразия синаптических свойств в глутаматерги-ческой передаче указывает на источник изменчивости и пластичности синаптической деятельности коры головного мозга.
Полученные в настоящей работе данные о функциональной и нейрохимической организации корковых связей могут быть использованы в неврологии, нейрофармакологии и невропатологии.
Апробация диссертационного материала. Основные положения
диссертации доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры физиологии высшей-нервной деятельности Санкт-Петербургского университета (1994,1995). заседании Ученого-совета-Физиологического НИИ им. А. А. Ухтомского Санкт-Петербургского университета (1994)", на второй Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1986), на заседании Физиологического общества (Ленинград, 1991), на 4-х ежегодных конференциях Общества по нейронаукам (США, 1992-1995). По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Структура и объем диссеетапки. Диссертация изложена на 1?0 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех разделов описания и анализа результатов, заключения, выводов и списка пег.сльзованной литературы. Работа иллюстрирована 27 рисунками и фотографиями и включает 4 таблицы. Указатель литературы содержит 12 источников отечественной литературы и 243 работы зарубежных авторов.