Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи Кривой, Игорь Ильич

Введение к работе

- З -

Актуальность проблемы. Проблема пластичности синаптичес-кой функции и нервной системы в целом одна из важнейших в современной нейрофизиологии (Экклс, 1966; Вартанян, Василевский, 1966; Турпаев, Сахаров, 1967; Кэндел, 1980; Воронин, 1982; Мокрушин, Емельянов, 1992; Zucker, 1989; Malenka, 1995). Холинергический нервно-мышечный синапс позвоночных является традиционной моделью исследований в этой области. В модуляции нервно-мышечной передачи могут участвовать самые различные факторы нервного и мышечного происхождения (Северин и др., 1970; Турпаев, Путинцева, 1974; Матюшкин, 1975;1980; Болдырев, 1977,- Hamilton, Smith, 1991) , в том числе сам медиатор ацетилхолин (АХ). Классическая проблема физиологической роли медиаторов и вопрос о немедиаторной, регуляторной функции АХ (Ухтомский, 1940; Гинецинский, Михельсон, 1937; Коштоянц, 1951; Беритов, 1959; Зефиров, 1967; Полетаев, 1974; Никольский, 1974) сохраняют свою актуальность и в настоящее время. И это не случайно, если учесть широкий спектр действия АХ на самые различные биохимические системы клеток (Голиков и др., 1985; Долго-Сабуров, 1985). Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизмы хопинергической модуляции нервно-мышечной передачи остаются во многом не ясными.

Один из основных механизмов синаптической пластичности -модуляция секреции медиатора из нервных окончаний (Матюшкин, 1975;1980; Ноздрачев, Пушкарев, 1980; Zucker, 1989; Bowman, 1990; Voronin, 1993), которая может осуществляться через пре-синаптические ауторецепторы по принципу отрицательной или положительной обратной связи. До сих пор нет единого мнения о структуре, механизмах функционирования и о физиологической значимости ауторецепторов в нервно-мышечном синапсе позвоночных. В качестве пресинаптических мишеней медиатора АХ, через которые может осуществляться модуляция нервно-мышечной передачи, рассматривают самые различные структуры: Н- и М-холино-рецепторы (Никольский, 1990; Wessler, 1989; Wilson, Thomsen, 1991; Tian et al., 1994), К⁺-каналы (Зефиров, Шакирьянова, 1992; Hevron et al., 1986), некоторые ферментные системы, в частности, Ыа⁺/К⁺'-АТФазу и сопряженный с ней ионный насос. Однако механизм участия Na⁺/K⁺-насоса в хопинергической регуляции квантовой секреции медиатора из моторных нервных терми-

- 4 -налей и ее роль в модуляции нервно-мышечной передачи остаются неизвестными, несмотря на множество фактов, косвенно подтверждающих эту возможность (Глебов, Крыжановский, 1978; Никольский и др.,,. 1989; Vizi, 1978; Maeno et al., 1995).

Следующая проблема - постсинаптическая холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи, осуществляемая через постсинаптическую потенциацию и десенситизацию холинорецепто-ров (Магазаник, 1988; Гиниатуллин, 1992; Hartzell et al., 1975; Glavinovic, 1991). Постсинаптическая потенциация проявляется в увеличении амплитуды и длительности постсинаптичес-ких ответов при повышении концентрации АХ в синаптической щели, при десенситизации наблюдается обратная картина. К настоящему времени изучены далеко не все проявления и молекулярные механизмы этих феноменов. Это объясняется тем, что постсинаптическая потенциация, как правило, маскируется одновременно развивающейся десенситизацией и не было четкого критерия, позволяющего разделять и независимо изучать эти явления.

Проблема холинергической модуляции нервно-мышечной передачи тесно связана с механизмом формирования следовых реакций АХ, что во многом обусловлено особенностями функционирования синаптической ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Многочисленные данные свидетельствуют о высокой активности и "избыточности" синаптической АХЭ в фазных мышцах позвоночных (Прозоровский, Саватеев, 1976; Barstad, i960; Barnard et al., 1971; Hobbi-ger, 1976). Вместе с тем, накоплены факты, противоречащие такому представлению (Кривой, 1984; Магазаник, 1988; Miledi et al., 1984; Nikolsky et al., 1994). Эти разногласия, имеющие непосредственное отношение к вопросу о функциональной роли синаптической АХЭ, также требуют своего объяснения.

Важным в исследовании функциональной роли синаптической АХЭ является поиск надежного метода определения ее активности. С этой проблемой непосредственно связано изучение особенностей кинетики ингибирования нативной АХЭ в интактных синапсах, которая существенно отличается от кинетики ингибирования очищенного фермента (Bullock et al., 1977; Laskowski, Dett-barn, 1979), а также вопрос о механизме восстановления синаптической передачи после отравления фосфорорганическими ингибиторами АХЭ, который имеет несомненное практическое значение, но окончательно не решен (Данилов, Иванов, 1972; Самой-

лова, 1983; Melchers, Van der Laaken, 1991). Цель и задачи исследования.

1. Выяснить влияние изменения условий секреции, рецепции и гидролиза АХ, а также других факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи, на параметры постсинапти-ческих ответов.

2. Изучить условия диффузии медиаторного АХ и возможность формирования его следовых реакций в синаптическои щели, а также функциональную значимость синаптическои АХЭ при разных режимах активности нервно-мышечного синапса.

3. Проверить реальность участия Ыа⁺/К⁺-АТФазы в хояинер-гической модуляции квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний и выяснить возможный механизм такой модуляции.

4. Провести анализ проявлений постсинаптической потенци-ации в различных экспериментальных условиях и установить количественный критерий ее оценки.

5. Исследовать электрофизиологическим способом кинетику ингибирования синаптическои АХЭ, используя в качестве критерия параметры постсинаптических потенциалов и токов.

6. Изучить механизм восстановления нервно-мышечной передачи после нарушений, вызванных фосфорорганическим ингибитором АХЭ.

Положения, выносимые на защиту.

7. Благодаря особенностям структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса диафрагмы крысы при ин-тактной АХЭ имеется возможность задержки и накопления в синаптическои микросреде АХ в концентрации, достаточной для модуляции пре- и постсинаптической функции. Синаптическая АХЭ выполняет двойственную функциональную роль, обеспечивая не только надежную передачу частотной импульсации мотонейронов, но и тонкую модуляцию нервно-мышечной передачи через изменение уровня АХ в синаптическои щели.

8. Ацетилхолин в концентрации, сопоставимой с физиологическим его уровнем в синаптическои щели в покое, способен вызывать долговременное следовое усиление вызванного квантового освобождения медиатора, функционально значимое в условиях сниженного гарантийного фактора нервно-мышечной передачи. Последействие АХ реализуется через структуру, отличающуюся по

- б -

фармакологическим характеристикам от постсинаптических Н- или М-холинорецепторов, при участии Na⁺/K⁺-AT*a3bi и вторичных мессенджеров.

3. Постсинаптическая потенциация проявляется при полностью активной АХЭ и градуально усиливается по мере ее инги-бирования. Молекулярные механизмы связывания АХ, определяющие временное течение постсинаптических ответов и собственно постсинаптическую потенциацию, различны. Предложен критерий, позволяющий оценивать постсинаптическую потенциацию в условиях, когда это явление маскируется другими процессами, в том числе десенситизацией.

4. Амплитудно-временные характеристики постсинаптических токов содержат информацию об активности синаптическои АХЭ и могут быть использованы для ее оценки. Такой электрофизиологический подход позволяет в условиях интактного синапса оценивать состояние именно функциональной АХЭ (непосредственно участвующей в гидролизе медиаторного АХ), что не обеспечивается другими методами.

Научная новизна. Проведен комплексный экспериментальный и теоретический анализ параметров спонтанных и вызванных постсинаптических ответов при изменении факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи: активности синаптическои АХЭ, режима активации двигательного нерва, температуры, плотности распределения постсинаптических холинорецеп-торов. Впервые исследована кинетика активации постсинаптичес-кой мембраны в случае генерации миниатюрных и вызванных токов концевой пластинки (ТКП) при градуальном угнетении АХЭ с помощью ее ингибиторов разных типов.

Получены новые данные о возможности задержки и накопления медиаторного АХ в синаптическои щели при нормальной активности АХЭ. Эти факты, свидетельствующие против традиционных представлений об "избыточности" синаптическои АХЭ, наряду с другими нашими данными, подтверждающими эти представления, позволили по-новому оценить функциональную роль синаптическои АХЭ в нервно-мышечном синапсе позвоночных. Предложена идея о двоякой функции синаптическои АХЭ, обеспечивающей в зависимости от концентрации АХ не только проведение частотной им-пульсации мотонейронов, но и тонкую холинергическую пре- и постсинаптическую регуляцию нервно-мышечной передачи через

- 7 -изменение уровня АХ в синаптическои щели.

Обнаружена и исследована не известная ранее длительная следовая гиперполяризация мембраны мышечных волокон и нервных терминалей, вызываемая АХ в низкой концентрации, сопоставимой с физиологическим уровнем медиатора в синаптическои щели. Установлено, что этот эффект АХ реализуется при участии Na⁺/K⁺-AT*a3H и лежит в основе изменения спонтанной и вызванной квантовой секреции АХ. Впервые показано, что вызываемое АХ следовое увеличение квантового состава ТКП приводит к повышению гарантийного фактора синаптическои передачи и долговременному восстановлению работоспособности утомляемых мышц. Таким образом, получены новые данные, свидетельствующие об участии Ыа⁺/К⁺-АТФазы в пресинаптической холинергической модуляции, и продемонстрировано значение такого механизма в обеспечении эффективности нервно-мышечной передачи при сниженном гарантийном факторе.

Впервые исследованы проявления постсинаптической потен-циации и оценен молекулярный механизм этого явления в случаях спонтанных одноквантовых и вызванных многоквантовых ответов при градуальном снижении активности АХЭ; применены также изменение температуры, частичное блокирование постсинаптических холинорецепторов и разные режимы стимуляции двигательного нерва. В качестве критерия оценки постсинаптической потенциа-ции предложен и использован не применявшийся ранее показатель. Обоснована адекватность данного критерия, позволяющего экспериментально отделять постсинаптическую потенциацию от десенситизации и других маскирующих факторов.

Впервые применен электрофизиологический подход к оценке активности и кинетики ингибирования именно функциональной АХЭ, основанный на анализе амплитудно-временных характеристик спонтанных одноквантовых постсинаптических ответов. Полученные значения кинетических констант ингибиторов АХЭ обратимого и необратимого типов подтверждают представления об особенностях функционирования нативнои АХЭ в синаптическои щели. Такой же электрофизиологический подход, примененный при анализе механизма спонтанного восстановления нервно-мышечной передачи, нарушенной действием фосфорорганического соединения, подтвердил, что в основе этого явления лежит слабое повышение активности синаптическои АХЭ.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование, связанное с выяснением механизмов холинер-гической модуляции и пластичности нервно-мышечной передачи, вносит несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы немедиаторной функции нейромедиатора АХ. Обобщение результатов работы существенно расширяет представления о структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса позвоночных, а также о механизмах секреции, рецепции и гидролиза медиатора АХ, обеспечивающих синаптическое проведение и функционирование нервно-мышечного аппарата в естественных условиях. Предположение о двойственности функции синаптической АХЭ позволяет по-новому оценить функциональную роль этой ферментной системы в нервно-мышечной передаче. Получены новые данные о механизмах, противодействующих периферическому утомлению.

Результаты проведенного в работе теоретического и экспериментального анализа следует учитывать при проведении физиологических и фармакологических исследовний на нервно-мышечных и других холинергических синапсах, при разработке весьма актуальных в настоящее время математических моделей синаптической передачи. Полученные данные могут оказаться полезными для понимания патогенеза и при лечении некоторых заболеваний нервно-мышечного аппарата; при поиске новых эффективных средств для предупреждения, диагностики и лечения интоксикаций, вызванных фосфорорганическими и другими ингибиторами АХЭ; при разработке и лабораторных испытаниях новых лекарственных препаратов синаптотропного действия.

Разработанные и примененные в диссертации методы, а также результаты исследований использованы в работе Института токсикологии МЗ РФ, внедрены в практикумы и курсы лекций на кафедре общей физиологии Санкт-Петербургского государственного университета и могут быть рекомендованы при составлении учебных программ физиологических кафедр университетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Представленные в диссертации материалы были доложены на: заседаниях Ленинградского отделения общества физиологов, биохимиков и фармакологов им.И.М.Сеченова (1983-1995); XXVIII конгрессе Международного Общества Физиологических Наук (Будапешт, 1980); III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии (Тбилиси,

- 9 -1982) ; V и VI Всесоюзных симпозиумах "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1984, 1991); III, IV и V Всесоюзных конференциях "Физиология и биохимия медиаторных процессов", посвященных памяти Х.С.Коштоянца (Москва, 1980, 1985, 1990); V Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тепа-ви, 1985); IX совещании "Вопросы эволюционной физиологии" (Ленинград, 1986) ; I Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1986); XV съезде Всесоюзного физиологического общества им.и.П.Павлова (Кишинев, 1987) ; конференции ФНИИ им.А.А.Ухтомского ЛГУ "Доминантные механизмы поведенческих адаптации" (Ленинград, 1990); XXXII конгрессе Международного Общества Физиологических Наук (Глазго, 1993); XVII съезде Физиологического общества РАН (Пущино, 1993); Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994); I Всероссийской конференции токсикологов "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" (Санкт-Петербург, 1995) ; Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996); XXXIII конгрессе Международного Общества Физиологических Наук (Санкт-Петербург, 1997); Международном симпозиуме "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (Колтуши, 1997) .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе 3 обзора и 3 главы коллективной монографии "Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества" (Л.: Изд-во ЛГУ, 1987).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; методического раздела; 4-х глав, включающих обзор литературы, собственные экспериментальные данные и заключение; общего заключения; выводов; списка цитированной литературы, содержащего 403 источника. Диссертация изложена на 314 страницах, иллюстрирована 54 рисунками и 12 таблицами.