Введение к работе
Рождение нейроэтологии четко датируется 1967 годом, когда на заднежаберном моллюске тритонии было продемонстрировано, что сложный поведенческий акт может быть запущен стимуляцией одного идентифицируемого нейрона (A.O.D. Willows, 1967, Science, 157: 570-574). Возможность гомологизировать индивидуальные нейроны отдаленно-родственных животных была вскоре после этого обоснована сравнительным изучением заднежаберных и легочных моллюсков (Д.А. Сахаров, 1970, Журн. общ. биол., 31: 449-457; 1970, Annu. Rev. Pharmacol., 10: 335-352; M.S. Berry and V.W. Pentreath, 1976, J. exp. Biol., 65: 361-380). Разработанные подходы впоследствии применялись на других группах беспозвоночных, в частности на аннелидах (К.Т. Keyser and СМ. Lent, 1977, Сотр. Biochem. Phisiol., 58А: 285-297) и низших червях (Б.А. Шишов, 1987. Журн. общ. биол., 48: 124-135; B.I. Joffe, 1991, Hydrobiologia, 227: 201-208).
В теоретической биологии приняты критерии гомологии морфологических структур, обоснованные немецким морфологом Ремане; эти же критерии используют при установлении гомологии нервных клеток. Критерий положения придает значение позиции тела, отростков и секреторных терминалей нейрона относительно других идентифицируемых структур. Критерий специального качества учитывает качественные особенности нейронов; в реальной нейробиологической практике наиболее полезными для гомологизации оказываются свойства, имеющие отношение к секреторной (нейротрансмиттерной или нейрогормональной) специфичности нейрона. При этом сходство должно наблюдаться по нескольким разным качественным признакам. Критерий непрерывности подразумевает возможность проследить в непрерывном ряду сравнимых структур, как развивается и появляется наблюдающееся несоответствие позиций или специального качества.
Использование этих критериев дало возможность во многих случаях проследит! ряды гомологичных нервных клеток - от вида к виду, от семейства к семейству и дальше к разным представителям крупных таксонов.
Достоверность ранних нейрональных гомологизаций получила полное подтверждение в современных результатах микрохимического и молекулярного анализа отдельных идентифицируемых нейронов, благодаря чему такой подход к анализу нейронных популяций стал общепризнанным и нашел широкое применение в нейробиологии (О. Breidbach and W. Kutsch, eds., 1995, The Nervous Systems of Invertebrates: An Evolutionary and Comparative Approach. Basel: Birkhauser) Благодаря этому создалась прочная основа для того, чтобы можно было анализировать гомологичные поведенческие акты в понятиях гомологичных нейронов.
Согласно современным представлениям, в основе той или иной поведенческой программы лежит активность центрального генератора (CPG, central pattern .. generator). Некоторые такие генераторы достаточно хорошо описаны. Однако только в единичных случаях удалось пока показать, что у представителей разных таксонов консервативная форма моторного поведения генерируется или управляется гомологичными нервными клетками. Примерами могут служить генераторы стоматогастрических моторных ритмов у разных ракообразных (P.S. Katz, 1991, Seminars Neurosci., 3: 379-389), генераторы, руководящие воздушным дыханием у пресноводных пульмонат - прудовиков и катушек (К. Луковяк, 1992, Онтогенез, 23: 105-117), а также гигантские серотонинергические нейроны церебральных ганглиев, модулирующие пищевую моторику морских, наземных и пресноводных гастропод.
Основу настоящей работы составляет описание ранее не известной консервативной нейрональной системы и выяснение ее регуляторной функции. В качестве отправной точки послужило краткое сообщение Мёрфи (A.D. Murphy, 1990, Brain Reaserch., 525: 300-303), посвященное симметричной паре плевральных нейронов пресноводного легочного моллюска Helisoma (аквариальная катушка). Свои аксонные проекции каждая клетка направляет в ипсилатеральный буккальный ганглий. При ее возбуждении наблюдалось торможение находящегося буккальных ганглиях нейронального генератора ритмических движений радулы. П предположению Мёрфи, эти парные нейроны "идеально подходят для того, чтобы
прекращать питание при подготовке животного к защитному втягиванию" в раковину.
В реальной эволюции животных, наряду с консервацией, имели место и резкие изменения поведенческих актов: радикально менялись способы локомоции, стратегии защитного поведения, и т. д. В настоящей работе сделана попытка экспериментального подхода к этому слабоизученному явлению. Мы рассматриваем здесь возможность участия гомологичных нейронов в механизме координации движений радулы и тела у разных представителей класса Gastropoda (брюхоногие моллюски).
Эта система привлекательна тем, что известны два варианта координации, соответствующие разным пищевым стратегиям. Для постоянно питающихся растительноядных пульмонат (таких, как широко известные прудовик и катушка) характерно подавление пищевого поведения при активации защитного: ритмические движения радулы останавливаются, едва животное получает тактильный, зрительный, вибрационный либо иной сигнал, вызывающий защитную ретракцию тела или его раздраженной части. Обратная иерархия -подавление защитной реакции при пищевом возбуждении наблюдается у хищных гастропод, в частности у пелагического крылоногого моллюска Clione limacina (клион, или морской ангел). Подавление защитного поведения наблюдалось у морского ангела как при возбуждении запахом жертвы (Y.I. Arshavsky et al, 1989, Exp. Brain Res., 78: 387-397), так и при "самопроизвольном" охотничьем поведении, вызванном активацией серотонинергической системы (ДА. Сахаров и Е.А. Каботянский, 1986, Журн. общ. биол., 47: 234-245). Что происходит с нейрональной основой при изменении пищевой стратегии? Те же самые координирующие нейроны начинают функционировать и взаимодействовать по-новому? Или система координации, присущая растительноядным моллюскам, элиминируется у хищных, и на ее месте появляется новая? Избранная нами модельная система координации моторных актов позволяет не только исследовать нейрональную основу самой координации, но и определить, на чем основана реверсия доминирования.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью экспериментальной части данной работы было выяснить, консервативна ли нейрональная основа координации, то
есть гомологичны ли координирующие нейроны у моллюсков, проявляющих одинаковую и противоположную иерархию защитного и пищевого поведения.
Конкретно, было необходимо найти координирующие интернейроны у разных гастропод и охарактеризовать их, используя методы нейроморфологии, иммуноцитохимии и нейрофизиологии. Особое внимание было уделено наиболее популярному на сегодня среди нейроэтологов легочному моллюску - большому прудовику. Далее, с меньшими деталями были обследованы другие пресноводные легочные улитки (Pulmonata Basommatophora), а затем и наземные легочные (Pulmonata Stylommatophora). Наконец, было предпринято, по возможности, обстоятельное изучение заднежаберного хищного моллюска - морского ангела Clione limacina (Opisthobranchia Pteropoda/
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована нейрональная основа координации защитного и пищевого поведения на восьми видах легочных моллюсков, для которых характерно подавление пищевого поведения защитным, и на одном хищном заднежаберном моллюске - морском ангеле, проявляющем противоположное доминирование. У всех девяти видов найден парный (плевро-буккальный, ПлБ) нейрон, дающий аксональную проекцию из области генерации защитного в область генерации пищевого поведения. Также на всех исследованных видах показано, что специальным признаком ПлБ нейрона является необычный ход его отростка, который всегда делает петлю, заходя в ипсилатеральный педальный ганглий.
Нижеследующие характеристики ПлБ нейронов определены впервые. Внутриклеточная инъекция красителя выявила существенное сходство строенш ПлБ нейрона у легочного (прудовик) и заднежаберного моллюска (рис. 1). У обоих видов аксоны правой и левой клеток проникают в буккальную комиссуру, создавав возможность контакта между симметричными нейронами. Особенностью ПлБ нейрона морского ангела является проникновение аксонных ветвей в некоторые церебральные нервы.
Иммуноцитохимически показано, что ПлБ нейроны легочных улиток (прудовик, катушка) и морского ангела окрашиваются антителами, реагирующими с нейропептидами семейства FMRFaMima. Результаты применения трех дополнительных антисыворогок указывают на то, что у прудовика RFaMim-подобная иммунореактивность обеспечивается экспресией второго экзона гена
FMRFaMima, и что вероятным продуктом этой экспресии является тетрапептид FMRFaMHfl.
При нейрофизиологическом исследовании ПлБ нейронов прудовика и морского ангела у обоих видов обнаружены: сильная электрическая связь между левой и правой ПлБ клетками, сильное тормозящее действие ПлБ нейрона на буккальный генератор пищевой моторики, а также возбуждение ПлБ нейрона стимулами или командными нейронами, вызывающими защитное поведение. У морского ангела дополнительно наблюдалось обратное влияние протракторного интернейрона пищевой моторики на ПлБ нейрон, имевшее бифазный характер -кратковременное возбуждение, переходящее в торможение.
Полученные результаты позволили впервые заключить, что у разных гастропод - растительноядных и хищных, легочных и заднежаберных - координация пищевого поведения с защитным осуществляется гомологичными КРамид-ергическими проекционными интернейронами, и что торможение пишевой программы при защитном поведении опосредуется ЯРамид-подобным пептидом (или пептидами) ПлБ клеток.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Исследованная модель координации, включающая обратные влияния мишени на координирующий нейрон, открывает возможность изучать в будущем эти важные механизмы на более глубоком - молекулярном уровне. Это позволит продвинуться в понимании того, как подобные пластичные координации осуществляются в мозге человека и высших животных.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации докладывались на 8-ом симпозиуме Международного общества нейробиологии беспозвоночных (ISIN) "Neurobiology of Invertebrates" (Тихань, Венгрия, 1995), на молодежных научных конференциях ИБР им. Н.К. Кольцова (1995, 1997), на 5-ой региональной конференции ISIN "Простые нервные системы" (Москва, 1997) и на семинаре нейробиологического отдела Свободного университета (Берлин, Германия, 1997). ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и тезисы 3 докладов.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материала и методов исследования, главы результатов и их обсуждения (4 раздела), заключения, выводов