Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Структура и функции тромбоцитов 9-13
1.2. Современные представления об активации и агрегации тромбоцитов 14-21
1.3. Пуриновые рецепторы тромбоцитов 22
1.3.1 Ионотропные Р2Х1 -рецепторы тромбоцитов 22-26
1.3.2. Метаботропные рецепторы тромбоцитов 26-28
1.4. Роль оксида азота в функциональной активности тромбоцитов 29
1.4.1 NO/cGMP-сигнальная система тромбоцитов 29-40
1.4.2. Инактивация NO 40-41
Экспериментальная часть 42
Глава 2. Материалы и методы 42-48
Глава 3. Результаты исследования 49-67
Обсуждение результатов 68-80
Выводы 81
Список литературы 82-107
- Структура и функции тромбоцитов
- Современные представления об активации и агрегации тромбоцитов
- Роль оксида азота в функциональной активности тромбоцитов
- Инактивация NO
Введение к работе
Процесс тромбообразования, будучи физиологически необходимым процессом, должен находиться под жестким контролем. На основании имеющихся литературных данных, функцию этого контроля в тромбоцитах выполняют сАМР и cGMP внутриклеточные системы. Взаимоотношения Са2+ системы сигнализации и выше указанных систем циклических нуклеотидов приводят к изменению чувствительности тромбоцитов к стимулу. Точные молекулярные механизмы изменения функциональной активности тромбоцитов при различных патологических состояниях в настоящее время требуют уточнения. Патологические состояния, характеризуемые высокой чувствительностью тромбоцитов к стимулу, обусловливают повышенный риск возникновения тромбозов. Понятно, что данные нарушения регуляции активности тромбоцитарного звена гемостаза нуждаются в фармакологической коррекции.
Тромбоциты представляют собой высоколабильную структуру и способны переходить в состояние активации даже при небольших воздействиях ADP. При этом, нередко наблюдается повышение их чувствительности к стимулу. ADP является одним из наиболее важных физиологических стимуляторов тромбоцитов (Born G.V.R. 1963, 1970, Siess W. 1989). Действие этого пурина на тромбоциты опосредовано активацией трех типов рецепторов, экспрессируемых на поверхности цитоплазматической мембраны: Р2Х1-, P2Y1- и Р2У12-рецепторы (Woulfe D. 2001). Установлено, что уровень экспрессии пуриновых рецепторов в тромбоцитах соответствует следующему порядку: P2Y12 » Р2Х1 > P2Y1 (Wang L, et al.. 2003).
Ранее, используя новый метод малоуглового светорассеяния (Э.Ф. Деркачев, 1998), была показана концентрационная последовательность действия ADP на пуриновые рецепторы тромбоцитов: ЕСбо~ 20 nM (Р2Х1) < ЕС50 ~ 90 nM (P2Y1) < ЕС50 ~ 120 nM (P2Y12) (Сакаев М.Р., 2000). В последующих работах, при клонировании этих рецепторов в другие клеточные линии, показан их близкий фармакологический профиль (Takasaki J.,etal.,2001).
Хорошо известно, что активация тромбоцитов достигается за счет повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция [Ca2+]j. ADP за счет стимуляции Р2Х1-рецептора вызывает ток ионов кальция в клетку. Через G-белок-сопряженные рецепторы активирует фосфоинозитольный цикл при последующем высвобождении Са из внутриклеточных депо (Р2У1). Для полноценной агрегации необходимо ингибирование аденилатциклазы, что осуществляется через активацию P2Y12 рецептора.
Все больше внимания исследователей уделяется изучению, как самих рецепторных комплексов, так и внутриклеточных сигнальных событий. Лиганд-рецепторное взаимодействие приводит к сопряжению внеклеточных стимулов различного характера и процесса их трансдукции по системе внутриклеточной путей и петель обратной связи. Изменения этого точного механизма взаимодействия является ключевым этапом проявления нарушений функциональной активности тромбоцитов при различных патологических состояниях.
В норме адгезии тромбоцитов к эндотелию не происходит. Это связано с образованием эндотелиальными клетками простациклина (PGI2), оксида азота (N0), экто-АДФазы (CD39) и других факторов, ингибирующих адгезию и агрегацию тромбоцитов (Forsterman V., et al.. 1993; Зенков Н.К., и др. 2000). Пусковым моментом для осуществления адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов является повреждение компонентов сосудистой стенки. При этом происходит изменение функциональной активности тромбоцитов. В некоторых случаях возникает ее повышение, а в других - снижение агрегационного потенциала клеток. Снижение чувствительности тромбоцитов к индуктору агрегации свидетельствует о реакции «ухода» уже активированных клеток от мест нарушения целостности сосудистой стенки. Этот процесс имеет мощное физиологическое значение, препятствуя развитию тромбов вне зоны повреждения эндотелия. Повышение чувствительности клеток обусловливает опасность возникновения массивного тромбоза и требует соответствующего фармакологического вмешательства. Интересно, в литературе рассматривается вариант повышения агрегационной активности тромбоцитов при сверхэкспрессии Р2Х1 рецепторов тромбоцитов трансгенных мышей, что приводит к проявлению особого протромботического фенотипа (Oury С, et al.. 2003).
Другими словами, поиск ответа на вопрос о причинах изменения функциональной активности тромбоцитов при различных патологических состояниях затрагивает, как рецепторное звено сигнальной системы, так и функциональное состояние клетки в целом.
Цель исследования: оценка функционального состояния тромбоцитов в условиях гестоза (нефропатия I) и модели лучевой болезни, коррекция гиперчувствительного статуса тромбоцитов органическими нитратами, а также создание модели гиперчувствительного состояния тромбоцитов к индуктору агрегации (ADP).
Задачи исследования:
Исследование функциональной активности тромбоцитов беременных с гестозом, степень тяжести которого определена как нефропатия I.
Моделирование состояния гиперчувствительности тромбоцитов крыс и исследование характера агрегационного ответа тромбоцитов при действии ADP.
Определение состояния гиперчувствительности тромбоцитов в динамике изменения функциональной активности клеток после общего однократного гамма-облучения крыс в дозе ЗГр.
Исследование действия нитропруссида натрия на ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов крыс.
Изучение влияния органических нитратов (изосорбида динитрата, изосорбида -5'- мононитрата) на агрегационную активность тромбоцитов беременных с гестозом (нефропатия I).
Научная новизна работы.
Впервые показано, что тромбоциты беременных с гестозом демонстрирующие гиперчувствительность к действию ADP, характеризуются кооперативным эффектом связывания этого агониста агрегации с пуриновыми рецепторами. При установлении зависимости агрегации тромбоцитов беременных с гестозом (нефропатия I) от концентрации агониста (ADP) получены значения функциональной чувствительности клеток в диапазоне доз ADP ~ 7-15 пМ. Инициация агрегации данной концентрацией индуктора указывает на прохождение процесса агрегации через Р2Х1 рецептор, активация которого инициирует ток ионов кальция в клетку. Впервые предположено, что этот катионный канал характеризуется положительным кооперативным эффектом связывания с ADP с коэффициентом Хилла h= 2.59±0,5.
При применении органических нитратов показан их корректирующий эффект на гиперчувствительный статус тромбоцитов беременных с гестозом.
Впервые получена модель гиперчувствительного состояния тромбоцитов с искомым кооперативным эффектом связывания ADP с пуриновыми рецепторами.
Впервые в фазном характере восстановления агрегационной активности тромбоцитов после общего однократного гамма-облучения крыс в дозе 3 Гр обнаружено преходящее состояние гиперчувствительности тромбоцитарного звена гемостаза.
Научно-практическая значимость.
Полученные в результате исследования новые данные расширяют представление об изменении функциональной активности тромбоцитов при патологических процессах: гестозе и лучевой болезни.
Результаты проведенных исследований существенно дополняют знания о патогенетическом значении изменения функциональной активности тромбоцитов (статус гиперчувствительности) при гестозе и лучевой болезни.
Представленная модель развития гиперчувствительного состояния тромбоцитов дает возможность объективно оценивать полученные результаты и может использоваться при изучении механизмов нарушения тромбоцитарного звена гемостаза при гестозе и лучевой болезни, а также других патологических состояниях, характеризующихся повышенной агрегационной активностью тромбоцитов, и возможность коррекции данного статуса клеток.
Результаты исследований гиперчувствителности тромбоцитов могут быть использованы при разработке методов клинической оценки нарушений системы гемостаза, прогноза и профилактики связанных с ними осложнений и результатов коррекции тромбоцитарного звена гемостаза.
Полученные данные о гиперчувствительности тромбоцитов и возможных механизмах ее возникновения и развития могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в курс физиологии и патологической физиологии при рассмотрении вопросов гемостаза, микроциркуляторных нарушений, нарушений клеточной рецепции, а также могут быть использованы в лекционных курсах в ВУЗах медико-биологического профиля.
Положения, выносимые на защиту.
Тромбоциты беременных с гестозом (нефропатия I) характеризуются гиперчувствительным статусом к индуктору агрегации (ADP).
Значения чувствительности тромбоцитов к индуктору агрегации составляют 7-15 пМ (параметр ЕС5о), что указывает на прохождение агрегации через Р2Х1 рецептор. На основании результатов предположен кооперативный эффект связывания ADP с пуриновыми рецепторами тромбоцитов.
При применении органических нитратов обнаружено их корректирующее действие на гиперчувствительный статус тромбоцитов
Инкубация тромбоцитов крыс со фторацетатом натрия (SFA) позволяет получить статус гиперчувствительности клеток к агонисту агрегации. В полученной модели тромбоциты характеризуются кооперативным эффектом связывания агониста агрегации (ADP) с пуриновыми рецепторами.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на заседании второй международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 12-14 апреля 2001 г.), межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2003 г.), научно-практической конференции «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург 2004 (февраль)), X юбилейной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 15-16 апреля, 2004 г.), VI научно-практической конференции с международным участием "Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 1-3 декабря 2004г.), XI межвузовской . конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург 21-22 апреля 2005 г.), научно-практической конференции молодых ученых -2005 «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург 13 мая 2005 г.), международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург 7-9 декабря 2005 г.); XII международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург 19-20 апреля 2006 г.).
Структура и функции тромбоцитов
Тромбоциты образуются из мегакариоцитов, являясь безъядерными фрагментами их цитоплазмы (Иванов Е.П. 1991, Вестрайт М. 1986). Мегакариоциты участвуют в поддержании нормального количества циркулирующих тромбоцитов в периферической крови (Kaushansky К. 1999). Количество тромбоцитов у млекопитающих подвержено значительным колебаниям. Количество тромбоцитов у человека колеблется от 150— 300х106/мл, у крыс от 400-700x106/мл. Время жизни тромбоцитов в норме составляет от 6 до 10 суток (Иванов Е.П. 1991, Вестрайт М. 1986).
Тромбоциты (кровяные пластинки) как самые малые по размеру клетки крови (диаметр покоящихся (интактных) тромбоцитов составляет 2-4 мкм) (Иванов Е.П. 1991, Вестрайт М. 1986) практически не способны к производству собственных белков и ионных каналов. Таким образом, мегакариоциты экспрессируют рецепторные и формируют многие внутриклеточные системы тромбоцитов, необходимые в дальнейшем для полноценного функционального ответа кровяных пластинок. Однако, в настоящее время не известно, на какой стадии развития мегакариоцитов происходит экспрессия рецепторов (Vial С, et al.. 2002).
Плазматическая мембрана тромбоцитов содержит специализированные компоненты (комплексы), участвующие в межклеточных контактах и взаимодействиях, в трансдукции сигнала по системе внутриклеточной сигнализации и в транспорте молекул из клетки и внутрь её. Внутренняя мембрана образует систему открытых каналов и плотную тубулярную систему, представляющую собой сложную сеть трубчатых структур и не имеющую контактов с плазматической мембраной, органеллами и системой открытых каналов (Frojmovic М.М. 1982, Nachmias V.T. 1980). Плотная тубулярная система подобна эндоплазматическому ретикулуму мышечных клеток (Ермолаева Т.А. 1991).
В цитозоле тромбоцитов обнаружены микротрубочки и микрофиламенты, образующие цитоскелетную сеть (Самаль А.Б., и др.. 1990). Определяя форму и объем кровяных пластинок, эта сеть является динамическим каркасом клетки, реагирующим как на внутренние, так и на внешние стимулы (Фултон А. 1987). Белки цитоскелета составляют более 50% от общего количества тромбоцитарных белков и соответствуют по физико-химическим свойствам сократительному аппарату мышечных клеток (Ермолаева Т.А. 1991). На долю актина приходится 20 - 30%, миозина - 12%, актинсвязывающих белков - 8% и Р235 - 3 - 8% (Daniel J.L. 1976, Siess W. 1989). Сократительные микрофиламенты распространяются от субмембранного пространства по всей цитоплазме тромбоцита и обуславливают изменения его формы, происходящие во время активации клетки. В цитоплазме неактивированных тромбоцитов можно обнаружить 4 вида гранул: ос-гранулы, плотные гранулы, лизосомы и пероксисомы. Наиболее многочисленные а-гранулы содержат тромбоцитоспецифические и тромбоцитонеспецифические пептиды, участвующие в механизмах коагуляции, воспаления, иммунитета и репарации и модулирующие эти процессы (Мазур Э.М. 2000). В этих гранулах содержатся пептиды коагуляции (фибриноген, фактор свертывания V (FV)), растворимые молекулы адгезии (фактор фон Виллебранда (vWF), витронектин), факторы роста (тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста), ингибиторы протеаз (ингибитор активатора плазминогена 1, аг-антиплазмин), молекулы адгезии (Р-селектин, аІІЬрЗ) (Holmsen Н. 1994). Мембраны а-гранул тромбоцитов содержат белки, обнаруженные в плазматической мембране (аІІЬрЗ, CD36, CD9, Raplb) (Cramer Е.М., et al.. 1990; Berger G., et al.. 1996; 1993; 1994). Плотные гранулы, названные так сообразно их внешнему виду под электронным микроскопом, в основном содержат пурины (ATP, ADP), серотонин, а также Са и Mg (Holmsen Н. 1994). Для всех этих низкомолекулярных веществ показано наличие рецепторов у тромбоцитов. Лизосомальные гранулы содержат гидролитические ферменты, а пероксисомы - каталазу (Мазур Э.М. 2000). Агрегация сопровождается выбросом химических веществ, находящихся в гранулах, из клеток в окружающую среду (Siess W. 1989). Выброс содержимого, или процесс секреции, осуществляется за счет сокращения системы открытых каналов, связанной с поверхностью тромбоцитов (Nachmias V.T.1980). Характерно, что секреция не сопровождается лизисом клеток (Гаврилов O.K. 1985). Высвобождение содержимого гранул протекает в два этапа. Первый включает в себя выход содержимого из плотных гранул - ADP, АТР, серотонина. Второй — секрецию адгезивных белков, фактора роста тромбоцитов, фактора IV, небольшого количества липидов и гидролаз из сс-гранул. Происходит лавинообразное усиление процесса, - активированные тромбоциты выделяют вещества, которые в свою очередь вызывают агрегацию (Самаль А.Б. 1990).
В состоянии покоя тромбоциты имеют форму двояковыпуклых дисков с гладкой, реже складчатой ("рифленой") поверхностью, поддреживаемой микротубулиновым кольцом (Frojmovic М. М. 1982; Nachmias V.T. 1980; Siess W. 1989). Такие тромбоциты не вступают в физиологически значимое взаимодействие с другими форменными элементами периферической крови или монослоем эндотелиальных клеток, выстилающим эндоваскуляное пространство. Физиологическая активация тромбоцитов начинается только тогда, когда поврежден сосудистый эндотелий или обнажен субэндотелиальный внеклеточный матрикс (Шиффман Ф.Д., 2000). При действии факторов, индуцирующих агрегацию, тромбоциты быстро переходят в сферизованное состояние за счет изменений цитоскелета (Nachmias V.T. 1980). При этом происходит ряд последовательно возникающих процессов, сопровождающихся морфологическими изменениями клеток. Изменение формы кровяных пластинок является результатом быстрой реорганизации цитоскелета, что включает образование новых филаментов актина, исчезновение краевой области микротубулинового кольца и централизацию гранул (Siess, 1989).
Современные представления об активации и агрегации тромбоцитов
Тромбоциты играют важную роль в гемостазе. Гемостатический процесс начинается с травмы или разрыва сосуда, а заканчивается образованием тромбоцитарно-фибриновой сетки (гемостатическая пробка). Функция гемостатического механизма включает взаимодействие между стенкой сосуда, тромбоцитами, коагуляционными белками крови и фибринолитической системой. Нарушения гемостаза ведут к серьезным клиническим последствиям (Мазур Э. М. 2000).
При сосудистом повреждении и/или в условиях высокой скорости сдвига тромбоциты в течение секунд связываются с коллагеном обнаженного субэндотелиального матрикса через их гликопротеиновые рецепторы (GP). Природа связывания определяется диаметром сосуда и скоростью кровяного потока. В большинстве сосудов, при низкой скорости тока крови (например, в венах) и низкой силы сдвига, тромбоциты способны взаимодействовать с коллагеном через их интегриновые а2рЗ- и гликопротеиновые рецепторы (GP) (Lopez JA, et al. 1988; Nieswandt B,et al. 2001). При усилении скорости тока крови (артерии) или при уменьшении сосудистого диаметра (капилляры) увеличивается сила сдвига, и адгезия тромбоцитов в большей степени зависит от присутствия фактора фон Виллебранда (vWF), большие мультимеры которого содержат связывающие сайты и для коллагена и для тромбоцитов (Ruggeri ZM. 1999). В условиях высокой силы сдвига тромбоциты связываются с vWF через гликопротеиновую часть их GPIb-IX-V-рецепторов (Sakariassen KS, et al.. 1979; Nurden AT, et al.. 1975; Huizinga EG, et al.. 2002). Адгезия тромбоцитов к обнаженному субэндотелиальному матриксу инициирует активацию, секрецию и агрегацию, таким образом, способствуя дальнейшему скучиванию тромбоцитов в зоне образуемого тромба, стимуляции и формированию новых агрегатов (Nieswandt B,et al. 2001).
Коллаген содействует агрегации тромбоцитов, удерживая молекулы vWF у сосудистой стенки, что, в свою очередь способствует адгезии тромбоцитов через взаимодействие с интегрином a2pi и GP IV (CD36). Кроме того, взаимному сцеплению тромбоцитов между собой и последующей агрегации способствует сама активация интегринового рецептора ПЬрЗ для фибриногена и vWF (Sims PJ, et al.. 1991). Фосфатидилсерин, отрицательно заряженный фосфолипид мембраны интактных тромбоцитов, высвобождается из активированных тромбоцитов, что приводит к появлению отрицательного заряда на внешней липидной мембране, способствуя адгезии тромбоциов к эндотелию (Heemskerk JW, et al.. 2002).
Коллаген субэндотелия и образующийся локально тромбин инициируют секрецию содержимого гранул тромбоцитов. Коллаген-опосредованная активация тромбоцитов приводит к сложному комплексу событий, инициированных координацией сигналов от поверхностных рецепторов тромбоцитов, включая суперсемейство иммуноглобулиновых рецепторов гликопротеина VI (GP VI), GPV и интегрина a2pl (Sugiyama Т., et al.. 1987; Staatz W.D., et al.,1989). Коллаген и тромбин также активируют фосфолипазы тромбоцитарной мембраны, освобождая арахидоновую кислоту, которая посредством тромбоцитарной циклооксигеназы превращается в простагландины Н2 и G2 (PG Н2 и PG G2). Последние под воздейсвтием тромбоксансинтетазы превращаются в тромбоксан А2 (ТХ А2) и другие гидроксижирные кислоты. Внутриклеточный ТХ А2 активирует сократительную реакцию в канальцевой системе тромбоцитов, за счет чего происходит процесс централизации гранул и их высвобождение (Мазур Э. М. 2000). Совместно с ТХ А2 происходит высвобождение ADP/ATP и серотонина во внеклеточную среду, что способствует активации и агрегации циркулирующих тромбоцитов и индуцирует вазоконстрикцию, тем самым ограничивая кровопотерю (Lopez JA, et al. 1988) путем образования тромбоцитарной «пробки» (Мазур Э. М. 2000). Уже давно установлена уникальная роль ADP в образовании и стабилизации тромбоцитарных агрегатов (Dangelmaier C.,et al.. 2001; Jantzen H.-M., et al.. 2001). Внутриклеточные сигнальные события, индуцируемые ADP необходимы для полного агрегационного ответа тромбоцитов (Cattaneo М, et al. 1990). На периферии образуемой тромбоцитарной пробки происходит дезагрегация тромбоцитов из-за выделения антиагрегантов, в частности простациклина (PG 12), окиси азота (NO), аденозиндифосфатазы (ADPasa) и других ферментов, синтезируемых интактными соседними эндотелиальными клетками. Первичной тромбоцитарной пробки достаточно для инициации гемостаза, но недостаточно для его поддержки. Постоянная гемостатическая пробка формируется при образовании тромбина, который вызывает необратимую агрегацию тромбоцитов и отложение фибрина на тромбоцитарных агрегатах (Мазур Э. М. 2000).
Этот тромбоцитарный ответ к сосудистому повреждению, итогом которого является формирование тромбоцитарного сгустка, называется первичным гемостазом. В общем, коагуляция, инициированная местом повреждения сосудов посредством тканевого фактора и распространяемая активированными тромбоцитами, в конечном счете, приводит к образованию фибрина и стабилизации тромбоцитарного сгустка.
Фибронектин является важным лигандом, опосредующим тромбоцит-тромбоцитарные взаимодействия внутри растущего тромба (Ni Н., et al..2003). VWF опосредует раннюю адгезию тромбоцитов к местам поврежденного сосуда, а фибронектин обеспечивает быструю поперечную связь тромбоцитов через связывание с активированным аІІЬрЗ. Таким образом, тромбоциты, прикрепляются фибрин/фибриногеновой сетью посредством интегрина аІІЬрЗ, что стабилизирует тромб. VWF, предположительно, участвует в укреплении тромба через связывание с GPIb (Goto S, et al.. 1998).
Роль оксида азота в функциональной активности тромбоцитов
N0 синтезируется из гуанидинового атома азота L-аргинина семейством цитохром-Р450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз (NOS), которые присоединяют молекулярный кислород к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина (Cooke J.P. et al., 1997). NOS в реакции с L-аргинином одновременно с продукцией N0 образуют конечный продукт - L-цитруллин, который является маркером активности NOS (Cooke J.P. et al., 1997).
NOS подразделяются на два класса по характеру действия и идукции NO (Forstemann U. et al., 1991; Moncada S. et al., 1991). Первый класс составляют Ca /СаМ-зависимые, конститутивно экспрессируемые физиологическими факторами NOS. Конститутивные NOS подразделяются на нейрональную (ncNOS, тип I) и эндотелиальную (ecNOS, тип III) изоформы.
Конститутивные cNOS обнаружены во многих клетках тканей и органов. В тромбоцитах человека идентифицирована конститутивная Са2+-зависимая эндотелиальная NO-синтаза (ecNOS) (Moncada S., et al.,1991). Этот тип синтаз также преобладает в энлотелии и нервной ткани (Monbouli J.V., 1997).
Во второй класс синтаз окиси азота входит кальций-независимая, индуцибельно экспрессируемая NOS (тип II) (Devies M.G. et al., 1995). При активации индуцибельной NOS происходит продолжительное повышение генерации NO (Stadler J. et al., 1991; Devies M.G. et al., 1995). При этом продукция NO индуцибельной NOS (iNOS) может превышать количество NO, продуцируемого ecNOS, в 1000 раз (Radomski M.W. et al., 1990). Индуцибельная NOS обнаружена в клетках сердца, поджелудочной железы, а также в гепатоцитах, моноцитах/макрофагах, мегакариоцитах, тромбоцитах и многих других клетках. Генерация оксида азота конститутивными формами синтазы окиси азота составляет пикомолярные концентрации. Поэтому, обнаруженная суперпродукция оксида азота в тромбоцитах при действии агонистов, генерируется индуцибельной формой NO-синтазы. Предполагают, что это не исключает участие конститутивной изоформы синтазы окиси азота в общем пуле генерации N0 в тромбоцитах (Stolarek R., 1998).
Основные каталитические различия изоформ заключаются в том, что Са необходим для активности эндотелиальной и нейрональной NOS, в то время как кальмодулин связан с индуцибельной NOS настолько прочно, что добавление Са не является необходимым. Кальмодулин придает ферменту конформационное состояние, необходимое для внутреннего переноса электронов (Горрен А.К. и др., 1998). Эндотелиальная и нейрональная изоформы NOS экспрессируются постоянно и их активность регулируется концентрацией кальция Са2+ (Cooke J.P. et al., 1997). ecNOS в интактных тромбоцитах продуцирует низкий уровень NO, который, как полагают, играет гомеостатическую и регуляторную функцию (Claudette К.2002). Эндотелиальная NOS подвергается миристоилированию и пальмитоилированию, что определяет субклеточную локализацию и активность фермента (Горрен А.К. и др., 1998).
К факторам, усиливающим генерацию NO тромбоцитами относят а-токоферол, посредством ингибирования протеинкиназы С (Freedman J.E., et al., 2000; Freedman J.E., et al., 1996), статины, посредством усиления экспрессии NOS в тромбоцитах (а также в эндотелиальных клетках) (Laufs U., et al., 2000; Laufs U., et al., 1998), L-аргинин, посредством усиления синтеза NO, и внутриклеточные пулы тиолов, посредством усиления синтеза S-нитрозотиолов и ограничения оксидативной инактивации NO (Anfossi G., et al., 1999). Оксид азота, генерируемый NOS тромбоцитов, не только модулирует активацию тромбоцитов к агонистам, но и, что более важно, заметно ингибирует процессы скучивания тромбоцитов в местах образования тромба (Freedman J.E., et al., 1999). В гемостазе в норме играют важную роль пул оксида азота, производимый и самим эндотелием и тромбоцитами, а дефицит какого-либо NO-пула усиливает гемостатический ответ к сосудистому повреждению (Loscalzo J. 2001).
NO функционирует как сигнальная молекула и большинство его эффектов опосредовано активацией гуанилатциклазы (sGC) (Friebe А., 2003). Гуанилатциклаза относится к группе нуклеотидциклаз - семейству ферментов, катализирующих превращение нуклеотидтрифосфатов до циклических нуклеотидов. Нуклеотидциклазы включают: аденилатциклазу (АС), мембранно-связанную гуанилатциклазу (pGC) и растворимую форму гуанилатциклазы (sGC) (Denninger 1999).
Рецептором для оксида азота в тромбоцитах является растворимая форма гуанилатциклазы, также известная как NO-сенситивная гуанилатциклаза. Термин NO-сенситивная гуанилатциклаза введен для того, чтобы была возможность отличить растворимую форму фермента от мембранно-связанной формы гуанилатциклазы (Friebe А., 2003). В последнее время обнаружено, что растворимая форма этого фермента при активации клеток ассоциируется с клеточной мембраной (Zabel U., et al 2002).
Растворимая форма гуанилатциклазы, ассоциированная с плазматической мембраной, обладает более высокой степенью чувствительности к низкому уровню N0. Таким образом, субклеточная локализация sGC модулирует активационные свойства этого фермента. Мембранная ассоциация фермента является оправданной, поскольку в этих условиях гуанилатциклаза оказывается более близкой к сфере влияния молекулы окида азота, обладающей коротким полупериодом жизни. Взаимодействие sGC с мембраной и/или кальцием, что увеличивает чувствительность этого фермента к NO, способствует и эффективной активации cGS и более пролонгированному действию самого оксида азота, по сравнению с молекулой гуанилатциклазы, находящейся в цитозоле (Zabel U. et al 2002).
NO-сенситивная, или растворимая, форма гуанилатциклазы представляет собой гетеродимерный гемопротеин, состоящий из а- и 0-субъединиц. sGC содержит гем, как простетическую группу (Gerzer R, et al.,1981). Присутствие гема в молекуле фермента является характерной чертой гуанилатциклазы и обязательно для активации гуанилатциклазы оксидом азота (Craven PA et al, 1978; Ignarro L.J., 1990; Северина И.С. 1995,2002). Фермент, лишенный гема, сохраняет способность к активации NO-соединениями, однако этот эффект несравненно ниже. Протопорфирин IX как непосредственным предшественник гема представляет сильный активатор sGC. Введение железа в порфириновое кольцо приводит к образованию ферропротопорфирина IX или гема, являющегося ингибитором фермента. Этой системе придается большое значение в эндогенной регуляции фермента. Роль гема гуанилатциклазы связывают с активацией фермента эндогенным NO и соединениями, содержащими или образующими свободнорадикальную группу NO. Природа связи гема с белковой молекулой гуанилатциклазы лабильна.
Инактивация NO
Беременность вызывает существенные изменения функционального состояния сердечно-сосудистой системы не только у женщин с предшествующими заболеваниями, но и у здоровых женщин. При этом сочетание гипертензивных состояний и акушерских осложнений, в частности гестоза, ограничивают возможности адаптации к тем многообразным изменениям, которые происходят во время беременности (Савельева Г.М. и др., 1998).
Гестоз характеризуется гипертензией, отеком, протеинурией и является синдромом полиорганной функциональной недостаточности, который развивается в результате патологической беременности. Гестоз обусловлен несоответствием возможностей адаптационных систем организма матери адекватно обеспечить потребности развивающегося плода (Mattar F. et al., 1999). В основном гестоз проявляется в результате нарушения функции сосудистого эндотелия. Основная роль в повреждении эндотелия принадлежит активации процессов перекисного окисления липидов и нарушению регуляторной функции системы NO (Vural Р., 2002). В настоящее время общепризнанным фактом является многофакторность патогенеза гестоза. К несомненным факторам риска возникновения гестоза относятся экстрагенитальная патология (гипертоническая болезнь, заболевания почек, ЦНС, эндокринной системы и т.д.), иммунологические нарушения.
Изменения тромбоцитарного звена гемостаза при беременности, осложнённой гестозом, получили широкое освещение в современной литературе, но, тем не менее, остаётся предметом для изучения, учитывая распространённость данного осложнения беременности (Redman C.W.G. 1990). Многими авторами при гестозе отмечено снижение числа циркулирующих тромбоцитов, в то время как их внутрисосудистая активация и агрегация повышены. Отмечается корреляционная связь между агрегационной активностью тромбоцитов и степенью тяжести гестоза, причём обнаруженные изменения нередко предшествуют клиническим проявлениям гестоза (MCrea K.R., et al., 1992).
Ранее методом малоуглового светорассеяния исследовалась функциональная активность тромбоцитов женщин с физиологически протекающей беременностью. Чувствительность тромбоцитарного звена гемостаза к индуктору агрегации (ADP) составляла 69.28±2.72 пМ (показатель ЕС50). По отношению к нормальным значениям функциональной чувствительности тромбоцитов к ADP для здоровых доноров (небеременные) значения ЕС50 составляют порядка 110-160 пМ ADP. Тромбоциты беременных характеризуются повышенной и даже высокой чувствительностью к стимулу (Миндукшев И.В., и др. 2003).
Нами проведены исследования функциональной чувствительности тромбоцитов беременных женщин с гестозом, степень тяжести которого была определена как нефропатия I. Для каждого образца PRP сделаны 5-Ю независимых измерений скорости агрегации от концентрации ADP в диапазоне доз 2-40 пМ.
При проведении экспериментов ответ клеток на очень низкие концентрации (порядка 2-5 пМ) агониста наблюдался через 30-50 минут после получения обогащенной тромбоцитами плазмы. Кроме того, через 40-60 мин после начала регистрации интенсивности светорассеяния тромбоцитами наблюдалась коагуляция плазмы. Вследствие этого в экспериментах с тромбоцитами беременных, характеризующихся повышенной скоростью агрегации и высокой чувствительностью к стимулу, ADP вносили в суспензию тромбоцитов от больших концентраций (40 пМ) к меньшим (до пМ). Порядок применения соответствующих концентраций ADP (в пМ) следующий: 30, 15, 10, 9, 6, 4, 2 пМ. На рис. 4 приведена протокольная запись эксперимента, в котором агрегацию тромбоцитов беременных индуцировали однократным внесением соответствующих доз ADP.
Проведено сравнение экспериментально полученной зависимости скорости агрегации тромбоцитов от концентрации ADP с теоретическими расчетами кинетической кривой. На графике (рис.5) теоретические расчеты показаны сплошной линией. Точками показаны экспериментально полученные значения зависимости скорости агрегации от концентрации субстрата.
В серии экспериментов исследования функциональной чувствительности тромбоцитов беременных женщин с гестозом (нефропатия I) получены следующие значения параметров агрегационной активности тромбоцитов: ЕС50= 10.88±3.7, h = 2.59±0.5. Получаемые величины ЕС50 и h отражают функциональный статус тромбоцитов. Величина ЕС50 характеризует чувствительность тромбоцитов к индуктору агрегации, а коэффициент Хилла (h) указывает на количество субстратсвязывающих сайтов рецептора.
Модель кооперативного связывания лиганда с рецептором по нескольким взаимодействующим между собой центрам, которая положена в основу уравнения Хилла, предполагает, что связывание лиганда с одной субъединицей рецептора настолько повышает сродство к нему остальных субъединиц, что это приводит почти к полному насыщению всего белка-рецептора лигандом.
В наших экспериментах получены значения коэффициента h=2.59±0.5. Чем выше значение h, тем более резко происходит переход от практически полного отсутствия ответа клетки к максимально возможному его значению. Кроме того, связывание агониста с рецептором происходит более чем по двум субстратсвязывающим сайтам в соответствии с полученными значениями коэффициента Хилла (h). График, характеризующий зависимость связывания агониста агрегации (ADP) с пуриновыми рецепторами, проявляющих положительное кооперативное действие, приведен на рис.5а.
На основании результатов исследования функциональной чувствительности тромбоцитов беременных с гестозом (нефропатия I) можно утверждать, что тромбоциты характеризуются гиперчувствительным статусом с положительным кооперативным эффектом связывания ADP с пуриновыми рецепторами.