Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции) 16
1.1.Строение органа обоняния 16
1.2. Строение обонятельных клеток 21
1.3. Механизмы обонятельной трансдукции 22
1.3.1. Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов 22
1.3.2. Роль внутриклеточной сигнальной системы цАМФ в рецепции одорантов 32
1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции 34'
1.3.3. Участие Golf- белка в рецепции одорантов 37
1.3.4. Структура и функция циклонуклеотид-зависимых Са2+-каналов в обонятельных клетках 38
1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках 48
1.3.5.1. Роль фосфолипазы С в обонятельной трансдукции 48
1.3.5.2. Участие протеинкиназы С в обонятельной трансдукции 50
1.3.6..Роль тирозинкиназной сигнальной системы в обонятельной рецепции 53
1.4. Двигательная активность обонятельных ЖГУ тиков...58
1.5. Влияние одорантов на митохондриальное дыхание обонятельных клеток 64
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 72
2.1. Объект исследования 72
2.2. Методы люминесцентной микроскопии 74
2.2.1 . Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках 74
2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток 78
2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия 84
2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии .87
2.4. Электроольфактография 90
2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки 91
2.6. Фармакологический анализ 93
ГЛАВА 3. Результаты исследований 98
3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов 98
3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта 98
3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры 111
3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции цинеола 119
3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата 124
3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина 131
3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака 136
3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем
обонятельных клеток в рецепции сероводорода 145
3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток 148
3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 148
3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 153
3.2.3. Исследование влияния цинеола на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 155
3.2.4. Исследование влияния амилацетата на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 157
3.2.5. Исследование влияния ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 161
3.2.6. Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи. митохондрий обонятельных клеток 163
3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 168
3.3. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных ЖГУ тиков 173
3.3.1. Энергетическое обеспечение двигательной активности обонятельных жгутиков 173
3.3.2. Роль цитоскелета в движениях обонятельных жгутиков 176
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 183
4.1. Исследование внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина 183
4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода 196
4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий 198
4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток 209
4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков 220
Заключение 225
Выводы 229
Список литературы 231
- Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
- Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
- Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
- Исследование внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Обоняние относится к пяти чувствам, кото-
4 рые интересовали человека с незапамятных времен, но успехи в понимании
молекулярных механизмов обонятельной рецепции достигнуты в последние
годы. Методами биохимического, генетического, иммуноцитохимического
анализа идентифицированы рецепторные молекулярные комплексы. в обоня
тельных жгутиках и показано, что они принадлежат большому семейству ре
цепторов, сопряженньк с G-белками (Boyle et al., 1987; Lancet, 1987; Clyne et
al., 1999; Dryer, Berghard,' 1999).
&' Выявлены ключевые ферменты путей сигнальной трансдукции - аде-
нилатциклаза и фосфолипаза С (Bakalyar et al., 1990; Menco et al., 1992; Iorgenko, Levin, 2000). Образующиеся при их участии вторичные посредники (соответственно цАМФ и 1Рз) открывают кальциевые каналы в мембране обонятельных жгутиков (Restrepo et al., 1992; Matsuzaki et al., 1999), что обеспечивает сопряжение между конформационными изменениями рецепторных
I*
молекулярных комплексов и электрическими процессами, осуществляющими
передачу информации в центральную нервную систему.
Однако достижения в изучении механизмов обонятельной трансдукции, закрыв немало прежних вопросов, поставили еще больше новых. Установлено, что в рецепции одорантов участвует аденилатциклазный путь трансдукции, а в восприятии феромонов - фосфоинозитидный путь. Однако есть данные о том, что последний осуществляет трансдукцию сигналов и в обонятельных клетках, но до сих пор не выяснено, в каких взаимоотношениях находятся эти пути в обеспечении обонятельной рецепции. Нет ответа на вопросы о возможном участии в ней других сигнальных систем, в частности ти-розинкиназной, о возможных различиях в вовлечении тех или иных вторичных мессенджеров в трансдукцию сигналов об одорантах, обладающих каче-
ственно разными запахами. Не прослежена последовательность включения в ^ обонятельную трансдукцию компонентов сигнальной системы, активируемой <
данным пахучим веществом.
Если во вкусовой, каротидной и медуллярной рецепции доказано наличие гетерогенных механизмов восприятия качественно разных агентов (Самойлов и др., 1978; Самойлов и др., 1980; Лотарев, Самойлов, 1986,1987), то исследователи обонятельной системы до сих пор не задумывались о возможной гетерогенности первичных рецепторных процессов при обонянии веществ, обладающих различными запахами.
v* Нет сведений об энергетическом метаболизме обонятельных клеток,
включая обеспечение энергией двигательной активности обонятельных жгутиков, а это тормозит развитие весьма интересных представлений А.А.Брон-штейна (1966, 1977) о важной роли цилиарной подвижности в активном поиске одорантов, растворенных в обонятельной слизи. Не установлены различия в изменениях движений жгутиков под действием качественно разных одоран-тов.
По нашему мнению, изучение механизмов обонятельной рецепции с позиций теории гетерогенности хемосенсорных систем (Самойлов, 1983) может иметь как теоретическое, так и практическое значение для биологии и медицины, животноводства, парфюмерии и бионики. Известна высокая чувствительность, специфичность и широкий диапазон воспринимаемых обонятель-ными клетками запахов, которые обеспечиваются специфическими механизмами их восприятия. Биофизические механизмы узнавания запахов могут быть основой для создания искусственных обонятельных сенсоров (Минор, Зинкевич, 1997). Предпринимаются попытки использования принципов, лежащих в основе этих специфических для рецепторных клеток свойств, для
моделирования сверхчувствительных приборов химического анализа (Ганшин, Зинкевич, 2002).
Изучение механизмов действия, воспроизведение и синтез в промышленных масштабах веществ, обладающих отпугивающими или привлекающими запахами, могут сыграть решающую роль в овладении методами активного управления поведением и регулирования численности полезных или вредных для человека животных.
Важное практическое значение имеет использование одорантов в качестве инструмента воздействия на t эмоции человека. В частности, показано (Villemure et al., 2003), что запахи могут вызывать эмоциональные состояния, снижающие восприятие боли.
Знание особенностей строения и работы обонятельных рецепторных клеток необходимо для активного вмешательства при некоторых патологических состояниях органов обоняния.
У животных и человека+известны различного рода аносмии. Электрофизиологический анализ мышей со специфической аносмией показал, что дефект обоняния связан с нарушениями в периферическом отделе анализатора и не влияет на механизм центральной обработки (Lancet, 1986; Griff, Reed, 1995). Одной из причин специфической аносмии может быть дефицит циклических нуклеотидов (Winstock et al., 1986). Полагают, что этот феномен является следствием мутации или дефицита гена, кодирующего белок для одного из типов молекулярного обонятельного рецептора (Lancet, 1986). ^_
Вместе с тем известно, что нарушения обоняния у человека вызывают развитие состояния тревожности, стойкие депрессивно-подобные изменения поведения вплоть до депрессий, которые вызываются не только повышенной тревожностью, но и отсутствием положительных эмоций, получаемых от сенсорной стимуляции (Макарчук, Калусв, 2000). Показано также (Bello,
Rummler, 1980), что при сенсорном обонятельном дефиците возникает ги-покликемия.
В настоящее время предпринимаются попытки помочь пациентам с такой патологией. Известно, что люди со специфической аносмией способны приобретать долгосрочную периферическую чувствительность к данному пахучему веществу после повторного длительного воздействия его высоких концентраций. Реакция стабильна и держится до 6 недель. Полагают, что появление чувствительности связано со стимул-зависимой активацией экспрессии специфического рецептора. Длительное воздействие стимула приводит к повышению уровней вторичных посредников, которые могут положительно регулировать генную экспрессию для одного или более компонентов сигнального пути (Griff, Reed, 1995).
Целью диссертационной работы являлось изучение различий в механизмах обонятельной трансдукции сигналов об одорантах, обладающих разными запахами.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1)с использованием флуориметрического и фармакологического анализов определить участие аденилатциклазного, фосфоинозитидного и тирозин-киназного путей в обонятельной трансдукции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата, ванилина, аммиака и сероводорода;
исследовать компоненты сигнальных систем, участвующих в рецепции каждого из перечисленных одорантов;
изучить влияние пахучих стимулов на активность дыхательной цепи митохондрий рецепторных клеток;
выявить характер изменений двигательной активности обонятельных жгутиков при действии одорантов и исследовать роль актинового компонента цитоскелета в этом процессе.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Обонятельная рецепция обеспечивается гетерогенными механизмами трансдукции. Гетерогенность обонятельной рецепции проявляется в следующих феноменах: - в рецепторные процессы, обеспечивающие восприятие веществ, обладающих разными запахами, вовлекаются различные сигнальные системы;
если в рецепцию одорантов включаются одинаковые пути трансдук^' ции, то компоненты этих путей различны;
в обонятельной рецепции одорантов, имеющих острый и гнилостный запахи, внутриклеточные сигнальные системы не участвуют;
действие на митохондриальное дыхание качественно разных одорантов принципиально различно;
качественно разные одоранты по-разному изменяют двигательную активность обонятельных жгутиков.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Благодаря проведению комплексно-
го исследования механизмов обонятельной трансдукции, клеточного метаболизма, двигательной активности обонятельных жгутиков, роли цитоскелета и электрофизиологических реакций в рецепторных клетках обонятельной выстилки лягушки при стимуляции одорантами, имеющими разные запахи, впервые выявлены гетерогенные механизмы обонятельной рецепции.
ф Гетерогенность проявляется в том, что в рецепторные процессы, обес-
печивающие восприятие веществ, обладающих разными запахами, вовлекаются различные сигнальные системы: в рецепцию веществ, обладающих прогорклым, эвкалиптовым и фруктовым запахами, - цАМФ, а в рецепцию одорантов с камфорным и цветочным запахами - 1,4,5-трифосфоинозитиды. При этом у веществ, входящих в одну группу химических соединений, в механиз-
ме трансдукции участвуют различные сигнальные системы обонятельных 7
клеток.
* Впервые показано, что гетерогенность обонятельной трансдукции про-
является и в том, что при участии в рецепции разных одорантов одной и той же сигнальной системы ее компоненты могут быть различными. Так, под действием ванилина и камфоры в обонятельных клетках стимулируется гидролиз фосфоинозитидов. Однако в восприятии ванилина участвует Goif-белок, а '
камфоры нет. ~
Впервые выявлено, что для восприятия веществ с камфорным и эвка-
^ липтовым-запахами.необходимо участие тирозинкиназы, передающей сигнал
далее на эффекторные белки: фосфолипазу С для камфоры и аденилатцикла-зу - для цинеола.
В обонятельную рецепцию одорантов, имеющих острый и гнилостный запахи, внутриклеточные сигнальные системы не вовлекаются. Эти одоранты действуют непосредственно на митохондрии.
Впервые гетерогенность обонятельной рецепции обнаружена в принципиальных различиях действия ни активность дыхательной цепи митохондрий одорантов, обладающих разными запахами. Пахучие вещества, обладающие прогорклым, камфорным, эвкалиптовым, фруктовым и цветочным запахами активируют митохондриальное дыхание, но такая активация связана с повышением содержания кальция в цитозоле обонятельных клеток, что, в свою очередь, обусловлено влиянием одорантов на внутриклеточные сигнальные системы: амилового спирта, амилацетата и цинеола- на цАМФ (через аде-нилатциклазу), камфоры и ванилина - на 1Рз (через фосфолипазу С). Одоранты, имеющие острый и гнилостный запахи, оказывают непосредственное действие на окислительный метаболизм обонятельных клеток. При этом аммиак ингибирует транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий обоня-
тельных клеток с флавопротеидов на убихинон, тогда как сероводород - на всем ее протяжении.
* Гетерогенность выявлена и при исследовании изменений двигательной
активности обонятельных жгутиков. Показано, что амиловый спирт, камфора, цинеол, амилацетат, ванилин и аммиак инициировали цилиарные движения, тогда как сероводород их останавливал. Поскольку в рецепцию этих одорантов вовлекаются различные сигнальные системы, то и механизмы, участвующие в изменении характера жгутиковой активности, тоже разные, что является еще одним аргументом»в пользу неоднородных физических и
\ji химических процессов, лежащих в основе биомеханических процессов жгу-
тикового аппарата обонятельных клеток. Это относится и к формированию в них актинового*цитоскелета, обеспечивающего «им активные движения при стимуляции одорантами, что впервые было нами показано.
Таким образом, в диссертационной работе впервые показано, что разнородная рецепция пахучих веществ является сложным процессом; который
^ включает механизм обонятельной трансдукции, сопряженный с активацией
дыхательной цепи митохондрий и биомеханическими преобразованиями жгутикового аппарата обонятельных клеток. При этом рецепция одорантов, обладающих качественно разными запахами, обеспечивается посредством неоднородных физических и химических процессов. Следовательно, не только вкусовой, каротидной, медуллярной, но и обонятельной рецепции присуща гетерогенность механизмов трансдукции.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Теоретическая значение проведенной работы заключается в том, что выявленная гетерогенность обонятельной рецепции существенно дополнила концепцию гетерогенности хеморецепции, распространив ее на все хемосенсор-ные системы. Выявление биофизических, биохимических и физиологических
механизмов внутриклеточной сигнализации в обонятельных рецепторах имеет важное значение для понимания процессов, осуществляющих восприятие внешнего сигнала и передачу информации о нем в центральную нервную систему.
Самостоятельное теоретическое значение имеют полученные в работе данные о реорганизации актинового цитоскелета в процессе восприятия обонятельного стимула, что расширило представление о роли движений обонятельных жгутиков в активном поиске пахучих веществ, растворенных в обонятельной слизи.
Полученные в работе новые данные о неоднородности физических и химических механизмов обонятельной рецепции имеют не только теоретическое, но и практическое значение для медицины, парфюмерии, сельского хозяйства и экологии. Знание особенностей строения и работы, обонятельных рецепторных клеток необходимо для активного вмешательства при некоторых патологических состояниях, в частности, при аносмиях.
Изучение механизмов действия, а также синтез в промышленных масштабах веществ, обладающих отпугивающими или привлекающими запахами, могут играть решающую роль в овладении методами активного управления поведением и регулирования численности полезных или вредных для человека животных.
Понимание механизмов обонятельной рецепции важно для бионики. Биофизические механизмы узнавания запахов могут быть основой для создания искусственных обонятельных сенсоров при конструировании сверхчувствительных приборов химического анализа.
Результаты работы могут быть использованы при чтении курса лекций по физиологии сенсорных систем, биофизике сенсорных систем, а также внутриклеточным сигнальным системам.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции, посвящен-
^ ной 30-летию Красноярского легочно-аллергологического центра (Красно-
ярск, 1997); VII национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997); Всероссийской научно-практической конференции « Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии» (20 - 22 октября, 1997; Санкт-Петербург, 1997); Международном симпозиуме, посвященном 150-летию И.П.Павлова «Механизмы* адаптивного поведения» (Санкт-Перебург, 1999); X международном симпозиуме «Экологические проблемы
Э адаптации» (Москва, 29-31 января 2001); Международной конференции
«Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной175 -летаю со дня рождения А.М.Уголева (Санкт-Петербург, 14 - 16 марта, 2001); IV Международной конференции'по фундаментальной нейроморфологии. Колосовские чтения 2002 (Санкт-Петербург, 2002); XVII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); Всероссийской Конфе-
^ ренции «От современной' фундаментальной биологии к новым наукоемким
технологиям» (доклад на тему: «Гетерогенность биофизических механизмов» (Пущино, 11-14 ноября, 2002)); научно-практической конференции, посвященной 40-летию больницы РАН (Санкт-Петербург, 25 декабря, 2002); IV Всесоюзной конференции по проблемам науки и высшей школы «Фундаментальные исследования в технических университетах» (Санкт-Петербург, 6-7 июня, 2002); XI Международном симпозиуме «Экологические проблемы адаптации» (Москва, 2003); Научной конференции по итогам работы в 2003 г. в рамках программы «Фундаментальная наука - медицине» (10 - 11 декабря. Москва, 2003); Ш съезде биофизиков России (24 - 29 июня 2004). Воронеж, 2004; Международной конференции «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине» (к 100-летнему юбилею присуждения
Нобелевской премии академику И.П.Павлову) (15 - 16 июня 2004). Минск, Республика Беларусь. 2004; Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнические ситемы в XXI веке» Санкт-Петербург. 2004.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ в отечественной и зарубежной печати.
Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
Анализ аминокислотной последовательности показывает, что обонятельные рецепторы принадлежат к первому семейству (классу А) рецепторов, сопряженных с G-белком, который включает в свой состав рецепторы к опси-ну и катехоламинам. Их называют также серпантинными рецепторами. Их полипептидная цепь 7 раз пронизывает мембрану и имеет внеклеточные и внутриклеточные петли. Лиганд-связывающий домен формируется внеклеточными петлями рецептора. Конформационные изменения, вызванные образованием лиганд-рецепторного комплекса, позволяют внутриклеточным петлям взаимодействовать и связываться с G-белком (Eyster, 1998).
Обонятельные рецепторы кодируются мультигенным семейством, не имеющим себе равного по размерам и разнообразию. Ген обонятельного рецептора человека был впервые идентифицирован в 1992 году. Детально охарактеризовано несколько их кластеров, а у некоторых геномных областей полностью определена акминокислотная последовательность. Идентифицированы 44 области, разбросанные по 13 хромосомам, 33 из них содержат последовательности, которые перекрываются с одной или более геномной областью. Вероятно, дупликации большого масштаба формируют существующий репертуар генов обонятельных рецепторов. Поэтому, по-видимому, обоня тельных рецепторов больше, чем всех других известных сопряженных с G белком рецепторных молекул, вместе взятых, что согласуется с их способностью распознавать широкую область структурно разнообразных пахучих лигандов (Sulivan et al., 1990; Buck, Axel, 1991; Dryer, Berghard, 1999; Mom-baerts, 1999). Гены рецепторных молекул для одорантов обнаружены у насекомых, рыб, амфибий, птиц и млекопитающих, что говорит о том, что они имеют высокую степень гомологии и хорошо сохранились у всех видов (Dikielny et al:, 1994; Ressler et al., 1994; Sulivan et al., 1995; Clyne et al.,1999; Dryer, Berghard, 1999; Kutsukake et al., 2000). Существует гипотеза, согласно которой область между вторым и шестым трансмембранными доменами обонятельного рецептора-образует карман (pocket) для связывания с лигандом. Семейство генов кодирует синтез обонятельных рецепторных молекул у млекопитающих, обладающих значи-тельным разнообразием аминокислотных последовательностей внутри этой г предполагаемой зоны связывания, чем, вероятно, обусловлено такое разнообразие рецепторов (Shepherd, 1991; Dryer, Berghard, 1999; Morabaerts, 1999). Гены обонятельных рецепторов по способности образовывать друг с другом гибриды группируют в субсемейства. Члены одного и того же субсемейства кодируют рецепторы, гомологичные по аминокислотной последовательности и поэтому могут распознавать один и тот же или сходный одорант (Ressler et al., 1994). Согласно стереохимической теории обоняния, молекула пахучего вещества должна взаимодействовать с активным центром молекулярного обонятельного рецептора, имеющего соответствующую этой молекуле стерео-структуру. При картировании специфических протеинов на препаратах изолированных ольфаторных жгутиков был обнаружен гликопротеин с молекуляр ной массой 95 кДа (gp95) и плотностью распределения по поверхности мем бран жгутиков обонятельных клеток 10 - 20 тысяч молекул на 1 мкм2 (Chen, Lancet, 1984). Он является кандидатом на роль обонятельного рецептора. Этот протеин является тканеспецифичным и обнаруживается только в оль-факторном эпителии, а в нем - в жгутиковой мембране (Chen, Lancet, 1984; Chen, Расе, 1986; Lancet, 1986; Boyle et al., 1987; Lancet, 1987; Menco, Farb-man, 1992). Методом in situ гибридизации показано, что1 обонятельные ре 1 цепторы экспрессируются.в обонятельных клетках на ранней стадии разви тия (Е12), независимо от созревания клетки, когда периферический отросток еще не прорастает к апикальной поверхности обонятельной клетки, и присутствуют в ней задолго до возникновения детекции запаха. Экспрессия генов обонятельных рецепторов у этих животных обнаруживается между Е12 Е14 у крыс и Е13 - Е13,5 - у мышей (Saito et al., 1998). Картированы 16 генов, to кодирующих синтез предполагаемых ольфакторных рецепторов человека. Эти гены состоят из 4 субсемейств, причем два из них являются псевдогенами (Ben-Arie et al., 1994; Mombaert, 1999). У крыс обнаружен ген (OR37), кодирующий синтез ольфакторного белка (Strotmann et al., 1992). В различных экспериментах показано, что у обонятельных клеток нет специфичности к одоранту данного качества, и рецепторные клетки способен ны воспринимать несколько разных запахов (Moulton, 1976; Шеперд, 1987). Полагают, что в одной обонятельной клетке может экспрессироваться по крайней мере 2 типа рецепторов (Kashiwayanagi, Kurihara, 1994). По мнению G.M.Shepherd and S.Firestein (1991), обонятельная клетка экспрессирует единичный тип рецепторов, но с разной степенью сродства к разным лигандам. Наконец, существует мнение, согласно которому рецепторная клетка ольфакторного эпителия может обладать широкой чувствительностью к одоран-там. При этом каждая из них экспрессирует несколько молекулярных рецеп торных молекул данного субсемейства. Таким образом, спектр качественных ответов является суммой отдельных рецептивных полей данной обонятельной клетки. Причем на уровне одиночной клетки не только категории обонятельных рецепторов и их специфичность могут различаться, но и их сродство к молекулам одорантов. Таким образом, у позвоночных (крыс и амфибий) на клеточном уровне процесс связывания с молекулярным рецептором приводит в результате к активации множества обонятельных клеток с частично перекрывающимися профилями настройки (Duchamp-Viret et al., 1999).
Считают, что способность людей со специфической аносмией при некоторых условиях ошущать запахи обусловлена возможностью одного молекулярного рецептора обонятельных клеток взаимодействовать с разными пахучими веществами. Известно, что этот тип аносмии проявляется только при низких концентрациях одорантов, а при более высоких их концентрациях в рецепцию могут вовлекаться другие рецепторы, имеющие более низкое сродство к лиганду. Такое свойство рецепторных молекул обонятельной выстилки человека связывают с небольшим числом генов в геноме человека (около 500) по сравнению с числом воспринимаемых им одорантов (около 5000) (Ressler et al., 1994).
Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
Ионы кальция обладают интегрирующей функцией, его называют мультифункциональным мессенджером, влияющим на глобальные внутриклеточные процессы (Williams, 1988). Им принадлежит важная роль в обонятельной трансдукции ( Winegar et al., 1988; Menini, 1999). Помимо генерации рецепторного потенциала в невозбудимых клетках с участием Са2+ включается активность киназ, фосфатаз, ионных насосов, активация митохондрий и внутриклеточных сигнальных систе м (Sham, 1997). Ионы кальция контролируют фундаментальные клеточные функции (Drammond et al., 2000; Hajnoczky et al., 2000). Поэтому кальций может служить индикатором вовлечения того или иного сигнального пути в ответ на одоранты. Ca2f в качестве индикатора имеет преимущество, поскольку зонды для него и системы измерения гораздо более чувствительны, чем для любого другого клеточного параметра (Riz-zuto et. al., 2000).
Зондом на мембраносвязанный кальций является хлортетрациклин (ХТЦ), с помощью которого можно изучать клеточные процессы в суспензиях изолированных органелл, на целых тканях и в клетках в составе тканей.
Изменения в мембранах, вызванные воздействием физических или химических факторов, которыми являются и одоранты, отражаются на интенсивности свечения этого зонда (Владимиров и др., 1978; Владимиров, Добре-цов, 1980; Лисовский и др., 1984; Самойлов, 1985). Показано (Carvalho, Carvalho, 1977), что флуоресценция ХТЦ обусловлена связьшанием кальция мембранами. Величина свободного кальция в цитозоле строго контролируется с помощью цитоплазаматических кальциевых буферов, механизмов, выводящих Са2+ из клетки и кальций-секвестрирующих систем. Посредством забу-феривания связывается значительное количество этого иона (до нескольких мМ), оставляя менее 1 мкМ свободной фракции. Большое количество кальция связьгеается отрицательно заряженными головками фосфолипидов, а также низко- и высокоафинными связывающими протеинами, которые снижают концентрацию свободного кальция в субмикромолярной области (Cavagioni, 1989).
В основе использования хлортетрациклина лежит его способность резко увеличивать квантовый выход флуоресценции, попадая в гидрофобное окружение биологической мембраны. В присутствии кальция увеличивается сродство ХТЦ к мембране и квантовый выход его комплекса с ней. В результате обе эти причины вызывают усиление свечения. В присутствии Са2+ зонд практически полностью связан с мембраной. Известно, что хлортетрациклин проникает через плазмолемму. Оптимальную флуоресценцию комплекса: Са2 -ХТЦ-КМ регистрировали при 25 мкМ концентрации хлор-тетрациклина (Carvalho, 1978).
Показано, что рост интенсивности флуоресценции идет параллельно с накоплением меченого кальция, входящего в клетку из внеклеточной среды (Dixon et al., 1984). Следовательно, интенсивность флуоресценции отражает процесс переноса ионов кальция через плазмолемму. При этом повышение концентрации цитозольного кальция приводит к увеличению содержания комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ с цитозольной стороны мембраны и увеличению количества связанной с ней флуоресцирующей формы (Поглазов и др., 1975). Следовательно, люминесцентное исследование живых тканей при помощи хлортетрациклина отображает динамику транспорта этого иона. Однако по изменению кальций-аккумулирующей способности мембран можно оценивать не только транспорт Са2+ через плазмолемму, но и вовлече ние каскада ферментативных реакций, связанных с активацией внутрикле точных сигнальных систем, поскольку их активность регулируется ионами кальция. Поэтому применение ХТЦ в качестве флуоресцентного зонда удовлетворяет решению той задачи, которая перед нами поставлена, а имен но, определить по динамике мембрано-связанного кальция участие той или иной сигнальной системы в рецепции одорантов. J Для исследования кальций-аккумулирующей способности мембран ре цепторних клеток обонятельную выстилку помещали в 25 мкМ раствор ХТЦ, приготовленный на растворе Рингера (рН 7,33), и инкубировали в течение 40 - 45 минут. Затем ее размещали на предметном стекле под объективом люми-несцентного микроскопа ЛЮМАМ - МП (рис.1). В нем источник света коллектором и линзой проецируется в плоскость апертурной диафрагмы, затем системой линз и светоделительной пластинки переносится в плоскость выходного зрачка объектива. Полевая диафрагма объективом проецируется в плоскость объекта. Из общего излучения источника с помощью светофильтра выделяется свет, возбуждающий люминесценцию. Для предохранения препаратов и светофильтров от нагрева ртутной лампой предусмотрена кювета, наполненная дистиллированной водой и служащая теплозащитным фильтром. Светоделительная пластинка («зеленая») отражает 360 - 440 нм и пропускает 480 - 700 нм, что необходимо для исследования флуоресценции комплекса: Са2 -ХТЦ-КМ.
Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
Для выявления компонентов внутриклеточных сигнальных систем, участвующих в обонятельной рецепции различных одорантов, мы использовали ингибиторный и активаторный анализ. В экспериментах были использованы реактивы фирмы Sigma и ICN Biomedicals Inc.
Иономицин (1 мкМ) - кальциевый ионофор, опустошающий внутриклеточные кальциевые депо, не чувствительные к 1Рз. Мы использовали его в качестве имитатора фосфоинозитидного пути трансдукции, поскольку он повышает концентрацию цитозольного кальция, посредством чего активируется протеинкиназа С - один из ключевых ферментов этого пути (Авдонин, Ткачук, 1994).
Н-7 (50 мкМ) - сильный ингибитор протеинкиназы С и циклонуклео-тид-зависимых протеинкиназ. Отсутствие реакции на стимул на его фоне свидетельствует об участии этих киназ в ней.
Дилтиазем (10 мкМ) и нифедипин (50 мкМ) - специфические ингибиторы циклонуклеотид-зависисимых Са2 -каналов. После инкубации препарата в растворе одного из реактивов ответ на раздражитель исчезает, если он обусловлен входом ионов кальция через каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами.
Форсколин (10 мкМ) является универсальным активатором аденилатциклазы в различных типах клеток. Полагают, что он прямо взаимодействует с каталитической субъединицей аденилатциклазы, активируя ее более, чем в три раза в обонятельных рецепторах крыс (Iorgenko, Levin, 2000). Форсколин вызывает реакцию, подобную действию изучаемого стимула, но на его фоне подавляется рецепторзависимое увеличение внутриклеточного содержания Са2 (Авдонин, Ткачук, 1994).
Тапсигаргин (100 нМ) - это ингибитор Са2+-АТФазы эндоплазматиче-ского ретикулума. Вызывает пассивную мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо независимо от активации рецепторов и генерации специфических инозитолфосфатов. Его применяют для прямого исследования емкостного входа Са2+ (Крутецкая, Лебедев, 1998). Возникновение реакции под действием тапсигаргина, сходной с таковой под влиянием тестируемого раздражителя свидетельствует о том, что вход Са2+ в клетку обусловлен опустошением кальциевых депо.
Кофеин использовали в двух концентрациях. 10 мМ раствор этого вещества опустошал внутриклеточные депо за счет кофеин-индуцированного высвобождения кальция (Ganitkevich, Isenberg, 1992; Drummond et al., 2000), а в концентрации 100 мкМ он ингибировал фосфодиэстеразу. При этом повышалось цитозольное содержание циклического аденозинмонофосфата. Если регистрируется реакция, имитирующая действие стимула, а на фоне кофеина она снижается, то это означает, что механизм его действия опосредуется цАМФ (Lancet, 1987).
Участие в активации системы цАМФ исследовали также с помощью 2,5- дидеоксиаденозина (10 мкМ) - ингибитора аденилатциклазы. После инкубирования в нем препарата ответ на стимул не регистрировался, если он возникал в результате активации этого фермента. Рутениевый красный (30 мкМ) является неконкурентным ингибитором 1,4,5-трифосфоинозитид-регулируемых каналов (Cadiou et al., 1997; White, Reynolds, 1997; Ma, Michel, 1998). Он почти не проникает через мембрану, поэтому его использовали для изучения этих каналов, локализованных в плазмолемме (Rizzuto et al., 2000). Генистейн (ЮОмкМ) ингибирует тирозин-специфические протеинкина-зы (Akiyama et al., 1987). Для исследования участия ГТФ-связывающего белка (G-белка) в реакциях на одоранты мы применяли фтористый алюминий, с помощью которого достигается лиганднезависимая активация этого протеина. AIF4" имитирует реакцию, если в ней участвует G-белок. FCCP (5 мкМ) является классическим протонофором, разобщающим окислительное фосфорилирование. Он снижает градиент рН на внутренней мембране митохондрий, деполяризует митохондрии и ускоряет транспорт электронов по дыхательной цепи. Он быстро и обратимо блокирует мито-хондриальный захват Са2+, а при определенных условиях приводит к ингиби-рованию Са2 -АТФазы (White, Reynolds, 1997). С его помощью обнаруживается изменение кальций-аккумулирующей способности»мембран, связанное с выходом Са2 из митохондрий и его зависимость от уровня их энергизации. Ротенон (1 мМ) - специфический ингибитор НАДН-дегидрогеназного участка дыхательной цепи. Подавляет дыхание клеток и тканей, восстанавливает пиридиннуклеотиды, сильно блокирует окисление ФП, ингибируя НАДН-дегидрогеназу (Лукьянова и др., 1982, Ov Rourke, 2000). Анализ роте-ион-чувствительной компоненты дыхания препаратов позволяет получить информацию об относительном вкладе НАД-зависимого окисления. А это, в свою очередь, позволяет судить о направлении метаболического потока в клетке. Азид натрия (1 мМ) представляет собой ингибитор терминального участка электрон-транспортной цепи. Способен блокировать перенос электронов на цитохром с оксидазу. Он подавляет дыхание, активный транспорт ионов, восстанавливает переносчики электронов дыхательной цепи митохондрий. Маточные растворы тапсигаргина (500 мкМ), 1-(5-изохинолин сульфо-нил)-2 метил пиперазина (Н-7) (50 мМ), генистейна (100 мМ), нифедипина (20 мМ), форсколина (10 мМ), 2 ,5-дидеоксиаденозина (10 мМ) готовили в диметилсульфоксиде (DMSO). Маточные растворы кофеина (10 мМ), фтористого натрия (5 М), хлорида алюминия (20 мМ), рутениевого красного (1,5 мМ), ХТЦ (1,5 мМ), ЭГТА (2 мМ), неомицина (20 мМ), дильтиазема (10 мМ) готовили на дистиллированной воде. Маточные растворы одорантов камфоры, ванилина, амилацетата, цинеола (1 М) готовили в DMSO. Аммиак - 10% нашатырный спирт.
Исследование внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
Вход кальция из интерстиция возможен по кальциевым каналам в плаз-молемме. Известно, что ионные каналы могут открываться при непосредственном взаимодействии с ними внутриклеточных посредников. Лиганд-за-висимые каналы, регулируемые 1Рз и цАМФ, обнаружены в обонятельных клетках многих типов животных. Они представляют собой неселективные ионные каналы, проницаемые преимущественно для ионов кальция (Frings et al., 1991; 1992; Lowe, Gold, 1993; Okadaet., 1994; Matsuzaki et., 1999).
Мы предположили, что в обонятельную трансдукцию перечисленных одорантов может вовлекаться цАМФ. Для проверки такого предположения препарат обонятельной выстилки обрабатывали 10 мкМ раствором дилтиазе-ма - блокатора Са2+-каналов, регулируемых цАМФ (Frings, Lindemann, 1991; Косолапов, Колесников, 1992). В таком случае реакции на амиловый спирт, амилацетат и цинеол исчезали, тогда как на камфору и ванилин сохранялись. Данный факт свидетельствует, что свечение комплекса: Са2 -ХТЦ-КМ под действием веществ, обладающих прогорклым, фруктовым и эвкалиптовым запахами, возрастает благодаря входу кальция через цАМФ-зависимые каналы, в то время как под действием агентов, имеющих камфорный и цветочный аромат, эти каналы не открываются.
Одним из механизмов повышения концентрация цАМФ в цитозоле может быть ингибирование фосфодиэстеразы (ФДЭ). При воздействии ингибиторов ФДЭ на обонятельные клетки флуоресценция комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ должна усиливаться, как и под действием одорантов. Из литературных данных известно, что цинеол и амилацетат вовлекают в рецепцию аденилат-циклазу, а не фосфодиэстеразу (Минор, Сакина, 1973; Frings, Lindemann, 1989; Firestein et al, 1990; Lowe, Gold, 1991; Zufall et al., 1991; Lowe, Gold, 1993; Kawai et al., 1997; Reisert, Mattews, 1998; Sinnarajah et al., 1998; Kawai, 1999; Duchamp-Viret et al., 2000). Поэтому роль ФДЭ мы не стали исследовать для всех используемых нами одорантов, а только в рецепции камфоры и амилового спирта. Для этого обонятельную выстилку инкубировали в 100 мкМ растворе кофеина - ингибиторе фосфодиэстеразы и регистрировали ответ на него. Реакции на повышение концентрации цАМФ в цитозоле, сходной с реакцией на стимуляцию камфорой или амиловым спиртом, не наблюдалось. Следовательно, в рецепции камфоры и амилового спирта этот фермент не участвует, и вход ионов кальция в обонятельную клетку, стимулированную амиловым спиртом и камфорой не инициируется повышением цитозоль-ного содержания цАМФ в результате ингибирования фосфодиэстразы.
Вместе с тем показано, что ингибиторы ФДЭ влияют на длительность и амплитуду суммарного рецепторного потенциала обонятельной выстилки (Menevse et al., 1977). В наших опытах при обдувании ее амиловым спиртом на фоне кофеина интенсивность флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ превышала реакцию нативного препарата. Полученный факт свидетельствует, что при повышении внутриклеточного содержания цАМФ посредством ингибирования ФДЭ увеличивается кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток. Однако это связано, вероятно, не с непосредственным открыванием Са24"-каналов, а с тем, что более высокая концентрация циклонуклеотида внутри клетки увеличивает проводимость циклону-клеотид-зависимых каналов, способствуя увеличению кальциевой проницаемости (Lynch, Lindemann, 1994).
Следует, однако, отметить, что такой механизм регуляции проницаемости через цАМФ-каналы, вероятно, присущ только ФДЭ. В опытах, проведенных с аппликацией форсколина, тоже увеличивающего содержание цАМФ в цитозоле, но посредством активации аденилатциклазы, реакции на амиловый спирт не было.
Через систему цАМФ может также осуществляться регуляция рецептора к инозитол-1,4,5-трифосфату. На срезах мозга показано (Haug, 1999), что протеинкиназа А фосфорилирирует его. Вероятно, этим можно объяснить наблюдаемое в наших опытах ускорение реакции обонятельных клеток на камфору, предъявляемую после обработки обонятельной выстилки 100 мкМ раствором кофеина.
Другим путем повышения внутриклеточного цАМФ является.активация аденилатциклазы (Авдонин, Ткачук, 1994; Крутецкая и д.р. 2003). Ее участие доказано в обонянии большого числа одорантов (Saito et al., 1998; Sinnarajah, 1998; Matsuzaki et al., 1999). Авторы исследований5 применяли смеси пахучих веществ, в состав которых входили и такие, которыми пользовались мы в своих экспериментах. Поскольку механизм трансдукции смеси может отличаться от каждого из ее компонентов, то роль аденилатциклазы мы определяли в отдельности для каждого из применяемых нами одорантов.
Для выявления АЦ-пути в рецепции пахучих веществ стимулировали1 ими обонятельную выстилку на фоне 2,5-дидеоксиаденозина - ингибитора аденилатциклазы. В таком случае реакция на амиловый спирт, цинеол и амилацетат исчезала, тогда как на камфору и ванилин сохранялась. Данный факт свидетельствует, что в обонянии агентов, обладающих прогорклым, эвкалиптовым и фруктовым запахами, участвует аденилатциклаза, а в рецепцию камфорного и цветочного ароматов этот фермент не вовлекается.
Еще одним приемом для выявления роли этого фермента в наших опытах с амиловым спиртом было применение 10 мкМ раствора форсколина -активатора АЦ. Аппликация его на обонятельную выстилку вызывала усиление флуоресценции, подобное амиловому спирту. Сходство реакций на разные агенты может свидетельствовать о сходном механизме действия амилового спирта и форсколина. По-видимому, одоранты, обладающие прогорклым, а также фруктовым и эвкалиптовым запахами, активируют аденилат-циклазу.
Таким образом, эти факты свидетельствуют о том, что именно активация аденилатциклазы, а не ингибирование ФДЭ усиливает синтез цАМФ при стимуляции обонятельной выстилки амиловым спиртом, цинеолом и амилацетатом. На это указывает как потеря чувствительности к амиловому спирту, амилацетату и цинеолу при ингибированной АЦ, так и сходство реакций на форсколин и амиловый спирт. Данный факт, в свою очередь, означает, что в рецепцию прогорклого, фруктового и эвкалиптового запахов включается внутриклеточная сигнальная система цАМФ.