Гепатопротекторные и антиоксидантные эффекты экстрактов лотоса орехоносного Хассан Мустафа Салахелдин Абделхамид

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. Обзор литературы 15

1.1. Общие представления о механизмах токсического поражения печени и методах его коррекции 15

1.2. Механизмы гепатотоксического действия 18

1.3. Гепатотропные эффекты четыреххлористого углерода. Механизм его токсического действия и влияния на обменные процессы в организме 22

1.4. Лотос орехоносный (Nelumbo nucifera): история применения 25

1.5. Фармакологические и биологические свойства лотоса орехоносного.. 27

1.6. Химический состав и антиоксидантная активность различных экстрактов лотоса орехоносного 34

1.6.1. Семена 34

1.6.2. Плоды и коробочки 36

1.6.3. Лепестки 36

1.6.4. Листья 37

1.6.5. Сравнение антиоксидантной активности различных экстрактов лотоса орехоносного 37

Глава II. Материалы и методы исследования 39

2.1. Схема эксперимента 39

2.2. Приготовление экстрактов лотоса орехоносного 42

2.3 Оценка гепатопротекторной активности экстрактов Л 0 42

2.3.1. Биохимическое исследование крови 42

2.4.2. Оценка антиоксидантной активности экстрактов ЛО

2.5. Морфологические методы исследования ткани печени крыс 53

2.5.1. Промывание и обезвоживание материала 53

2.5.2. Заливка материала в парафин 54

2.5.3. Приготовление гистологических препаратов 54

2.5.4. Депарафинирование срезов 55

2.5.5. Методика окраски гематоксилин - эозином 55

2.6. Исследование химического состава экстратков лотоса орехоносного 56

2.6.1 Хромато-масс-спектрометрический анализ 56

2.1. Статистическая обработка полученных результатов 57

ГЛАВА III. Результаты исследований 58

3.1. Результаты гепатопротекторных свойств экстрактов лотоса орехоносного

3.1.1. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию аланинаминотрансферазы (АЛТ) (ммоль/fч-л)) 58

3.1.2. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию аспартатаминотрансферазы (ACT) (ммоль/(ч-л)) 59

3.1.3. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию щелочной фосфатазы (ЩФ) (нмоль/(с-л)) 60

3.1.4. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию общего белка (г/л) 61

3.1.5. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию альбумина (г/л) 62

3.1.6. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию общего билирубина (мкмоль/л) 63

3.1.7. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию мочевины (ммоль/л)

3.1.8. Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию общего холестерина (ммоль/л) 66

3.1.9. Результаты антиоксидантной активности экстрактов лотоса орехоносного в тканях печени и почек крыс 67

3.1.10. Результаты анализа влияния экстрактов семян, плодов-коробочек и

листьев лотоса орехоносного на морфофункциональные параметры дезинтоксикационной функции ткани печени 68

3.1.10.3. Анализ морфометрических показателей паренхимы печени под действием силимарина и экстрактов различных частей лотоса орехоносного в условиях CCL4 -индуцированного гепатоза 71

3.2. Результаты фитохимического анализа 74

3.2.1. Результаты исследования состава спиртового экстракта семян лотоса орехоносного методом хромато-масс-спектрометрии 74

3.2.2. Результаты исследования состава спиртового экстракта плодов-коробочек лотоса орехоносного методом хромато-масс-спектрометрии..77

3.2.3. Результаты исследования состава спиртового экстракта листьев лотоса орехоносного методом хромато-масс-спектрометрии 80

ГЛАВА IV. Обсуждение результатов исследований 84

Заключение 91

Выводы 93

Список литературы

• Гепатотропные эффекты четыреххлористого углерода. Механизм его токсического действия и влияния на обменные процессы в организме
• Оценка антиоксидантной активности экстрактов ЛО
• Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию аспартатаминотрансферазы (ACT) (ммоль/(ч-л))
• Результаты исследования состава спиртового экстракта семян лотоса орехоносного методом хромато-масс-спектрометрии

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Печень играет ключевую роль в обмене веществ и часто упоминается как «великий химический завод» тела, физиологическая эффективность которого зависит от синтетической активности печени, ее способности к выведению токсинов. Риск интоксикации печени в последнее время значительно возрос за счет воздействия экологических факторов, пестицидов и химиотерапевтических средств (S.H. Garba et al.,2009). Гeпатотоксины при воздeйствии на пeчeнь повреждают ee парeнхиму и нарушают обменные и ферментативные процессы, вызывая разнообразные патологические состояния – от жировой и белковой дистрофии до токсического гепатита, цирроза и карциномы (G. Сhаnder et аl., 2002; Абдуллаeв, 2007; Ч.С. Павлов, В.Т. Ивашкин, 2007; Н.В. Багинская с соавт., 2007; И.В. Козлова, М.В. Сафонова, 2008; E.В. Вайс с соавт., 2012; В.М. Махов, 2012; E.В. Лузина с соавт.,2013).

В настоящее время разнообразные побочные эффекты, сопровождающие физиологическую активность синтетических соединений, сместили направление научных исследований в область изучения биологических эффектов растительного сырья, являющегося богатым источником биологически активных веществ (D. S. Fabricant and N.R. Farnsworth, 2001). Препараты растительного происхождения -наиболее востребованная группа гепатопротекторов, поэтому поиск перспективных методов коррекции токсических поражений печени включает в себя изучение гепатопротекторных свойств лекарственных растений. Одним из ключевых элементов защиты клеток печени от токсического повреждения является воздействие на свободно-радикальный статус организма. В этой связи целесообразно рассмотреть проявление гепатопротекторного эффекта в сочетании с антиоксидантным действием экстрагированных компонентов растительного сырья.

Кроме того, направление проведенного исследования в значительной мере было обусловлено существующими в литературе сведениями о высокой биологической активности и лечебной эффективности экстрактов различных частей лотоса орехоносного (ЛО) (D.B. Lee et al., 2015; Н.А. Ломтeва с соавт., 2014 ; N.R. Mehtа et аl., 2013; A.R. Im et al., 2013; S. Liu et al., 2013; B. Huang et al., 2013; R. Subashini et al., 2012; E.И. Кондратeнко с соавт., 2012; H.H. Ho et al., 2010; B. Huang et al., 2010).

Цель исследования: изучить в сравнительном аспекте гепатопротекторную и антиоксидантную активности экстрактов лотоса орехоносного, полученных из листьев, плодов-коробочек и семян у самок крыс с CCl₄-индуцированным повреждением печени.

Задачи исследования

1.Изучить химический состав экстрактов ЛО с помощью газовой

хроматографии и масс-спектрометрии. 2.Оценить влияние экстрактов, полученных из листьев, плодов-коробочек и

семян ЛО на биохимические маркеры функционального состояния печени при

ее токсическом поражении четырёххлористым углеродом. 3.Рассмотреть влияние экстрактов ЛО на морфофункциональное состояние

печени крыс с CCl₄-индуцированным повреждением, выявить экстракты,

которые наиболее эффективно поддерживают дезиноксикационную функцию

печени.

4.Сравнить гепатопротекторный эффект экстрактов различных частей ЛО с эффектами силимарина на фоне токсического поражения печени четырёххлористым углеродом, оценить интенсивность действия в дозозависимом аспекте. 5.Оценить в сравнительном аспекте антиоксидантные эффекты экстрактов семян, плодов-коробочек и листьев ЛО в ткани печени крыс при ее токсическом поражении, оценить интенсивность действия в дозозависимом аспекте.

Научная новизна работы. В представленном исследовании впервые в сравнительном аспекте изучено гепатопротекторное и антиоксидантное действие экстрактов, полученных из листьев, плодов-коробочек и семян лотоса орехоносного на фоне токсического поражения печени тетрахлорметаном (ССl₄) и установлена зависимость «доза – эффект». Впервые проведено углубленное комплексное изучение химического состава различных морфологических частей растения ЛО. Методом хромато-масс-спектрометрии определены биологически активные вещества, входящие в состав исследуемых экстрактов. Впервые в сравнительном аспекте изучено влияние экстрактов ЛО на гистоструктурные и морфометрические показатели печени при моделировании CCl4-индуцированного гепатоза.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены экспериментальные обоснования для расширения спектра практического применения экстрактов лотоса орехоносного в медицине и фармации. Гепатопротекторная активность экстрактов лотоса орехоносного в условиях токсического повреждения печени указывает на возможность использования этих экстрактов при лечении заболеваний печени. Химический анализ исследуемых экстрактов дополняет аналитическую базу биологически активных веществ растительного происхождения, влияющих на функциональные системы организма. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе в рамках дисциплин «Физиология», «Биологически активные вещества растительного происхождения» и «Биохимия».

Материалы и методы исследования

Получение экстрактов лотоса орехоносного. Семена, плоды-коробочки и листья ЛО отдельно измельчали до порошкообразного состояния. 20 г каждого порошка помещали в 500 мл 60%-ного этанола на 3 часа при 60С в термостате. Спиртовые экстракты фильтровали, затем отгоняли спирт в ротационном испарителе при 60С. Растворы экстрактов вводили животным внутрижелудочно с помощью зонда в дозах 50 и 100 мг/кг массы тела.

Хромато-масс-спектрометрическое изучение химического состава
спиртовых экстрактов лотоса орехоносного. Хромато-масс-спектрометрический
анализ проводили на системе GC Clarus 500 Perkin Elmer, включающей AOC-20i
автосамплер и газовый хроматограф, сопряженный с масс-спектрометром

(GC-MS). Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Неподвижная фаза 5% фенил метил полисилоксановой жидкости с толщиной слоя 0,2 мкм, ионизация электронами 70 эВ; гелий (99,999%) использовали в качестве газа-носителя при постоянном потоке 1 мл / мин, объем инъекции -1 мкл (сплит-отношение 10:1). Температура инжектора и интерфейса - 200 С; температура ионно-источника - 200 C. Хроматографирование проводили в режиме программирования температуры от 110 до 280 C со скоростью 10 град./мин до 200

С, а затем 5 град. / мин до 280 С, заканчивая 9 мин изотермой при 280 С. Масс-спектры проводили при 70 эВ; интервал сканирования 0,5 с, фрагменты - от 40 до 650 да. MC температура линии передачи 280 C. Обработку данных проводили с помощью штатных программ прибора. Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ с базой данных масс-спектров Wiley9 и NIST (K.P. Praveen et al., 2010).

Схема эксперимента

В первой серии эксперимента на 63 самках беспородных крыс (средняя масса – 240 г, возраст – 12-13 мес.) определяли гепатопротекторное и антиоксидантное действие исследуемых экстрактов в условиях токсического повреждения тетрахлорметаном.

Во второй серии экспериментов на 36 самках белых беспородных крыс того же возраста и массы изучали влияние введения экстрактов ЛО на морфофункциональное состояние печени на фоне CCl₄-индуцированного гепатоза. Самки крыс были разделены на 9 групп. Все препараты и экстракты вводились согласно схеме (табл. 1), животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Экстракты и силимарин вводили в дозе 50 мг/кг массы тела через 5 ч после введения CCl₄, чтобы избежать нарушения абсорбции каждого вещества.

На 50–й день крыс декапитировали после кратковременной наркотизации диэтиловым эфиром. Кровь забирали в сухие стерильные пробирки. Материал центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Сыворотку хранили при температуре – 20 С для дальнейшего биохимического анализа. Образцы печени и почек фиксировали для дальнейших гистологических исследований.

Таблица 1.

Общая схема эксперимента

Экстракт семян

лотоса орехоносного

Экстракт листьев

лотоса

орехоносного

Экстракт

коробочек лотоса

орехоносного

Оценка биохимических показателей. Для оценки гепатопротекторной и почечной протекторной активности экстрактов ЛО в сыворотке крови определяли активность АЛТ и АСТ, щелочной фосфатазы (ЩФ), уровни общего холестерина, общего билирубина и альбумина, используя наборы биохимических реактивов «Оль-векс диагностикум» (г. Санкт-Петербург). Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом (набор Агат-Мед, г. Москва), концентрацию мочевины (ммоль/л) – диацетилмонооксимовым методом с помощью наборов реактивов «Vital diagnostics» (г. Санкт-Петербург), активность ЩФ - унифицированным методом по конечной точке (O.A. Bessey et al., 1946), активности АЛТ и АСТ – унифицированным методом Райтмана-Френкеля (S. Reitman and S. Frankel., 1957), концентрации альбумина – унифицированным колориметрическим методом (B. T. Doumas et al.,1971), концентрации общего билирубина – методом Йендраше-ка-Грофа (L. Jendrassik and P. Grof, 1938), концентрации общего холестерина – эн-зиматическим колориметрическим методом (P. Trinder, 1969).

Оценка антиоксидантной активности экстрактов ЛО. Антиоксидант-ные свойства экстрактов ЛО оценивали по методу, основанному на взаимодействии продуктов перекисного окисления липидов с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного комплекса (максимум поглощения - 540 нм) (И.Д. Стальная и

Т.Т. Гаришвили, 1977) и снижению каталазной активности в печени и почках (М.А. Королюк с соавт., 1988).

Гистологическое исследование печеночной ткани позволило верифицировать ее изменения в условиях моделирования токсического поражения тетрахлор-метаном. Кусочки ткани фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина на 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,2– 7,4, обезвоживали проводкой через ряд растворов этанола восходящей концентрации с последующей заливкой в парафин. Из полученных блоков готовили срезы толщиной 3 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином (Д.Э. Коржевский, А.В. Гиляров, 2005). Морфологическое исследование гистологических препаратов проводили при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS (Германия) в пяти полях зрения при увеличении 400 и цифровой фотокамеры Leica DC320 (Германия). Степень влияния различных экстрактов лотоса орехоносного и силимарина на дезинтоксикационную функцию печени и морфофункциональное состояние органа оценивали по общей гистологической картине паренхимы, а также по комплексу морфометрических показателей: диаметру клеток и их ядер, числу безъядерных клеток, клеток с крупным светлым ядром и гигантских клеток с двойным ядром на 100 клеток паренхимы печени.

Статистическая обработка полученных результатов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 7 крыс. Полученные данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Результаты обрабатывали статистически с использованием t–критерия Стьюдента с применением стандартного набора программ SPSS, версия 16.0. Отличия считали статистически значимыми при p <0,05.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наибольшим гепатопротекторным действием в условиях CCl₄-индуцированного повреждения печени обладают экстракты, полученные из семян и плодов-коробочек лотоса орехоносного. В меньшей степени этот эффект проявляется у экстракта листьев ЛО.

2. Изученные экстракты лотоса орехоносного обладают антиоксидантным действием в тканях печени и почек в условиях токсического повреждения. При этом, наиболее выраженный антиоксидантный эффект отмечен у экстракта плодов-коробочек ЛО. Выявлена не значительная специфичность влияния экспериментальных доз на биохимические и морфологические показатели.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на следующих конференциях: VII Международной научно-практической конференции для молодых ученых «Фундаментальные и прикладные проблемы получения новых материалов: исследования, инновации и технологии» – Астрахань, Россия, (23-25 апреля 2013 г.); III Международной научной конференции «Новые Направления в Химии Гетероциклических Соединений» – Пятигорск, Россия (17–21 сентября 2013 г.); III Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная и прикладная исследование в биологии (Биотехнология)» – Донецк, Украина (24-27 февраля 2014г.); VIII Международной научно-практической конференции для молодых ученых «Фундаментальные и прикладные проблемы получения новых материалов: исследования, инновации и технологии» – Астрахань, Россия (28-30 апреля 2014 г.); II Международной научно-практической конференции «Современная биология: актуальные вопросы» – Санкт-Петербург, Россия, (17-18 октября 2014г.); XII Международной конференции «Химия и ее роль в развитии» – Эль-Мансура и Шарм-Эль-Шейх, Египет,

(16-20 марта 2015г.); V Юбилейной Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» – Санкт-Петербург, Россия, (20-21 апреля 2015 г.) ; VI Российско-Корейской конференции «Современные достижения химии биологически активных веществ и биотехнологии» – Новосибирск , Россия, (5-10 июля 2015 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 1 статья в зарубежном издании, включенном в базу систем цитирования Scopus, 4 статьи в российских изданиях, включенных в список Высшей аттестационной комиссии.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 15 рисунками. Диссертация состоит из введения, четырех глав и выводов, а также списка литературы, состоящего из 125 отечественных и 186 зарубежных источников.

Гепатотропные эффекты четыреххлористого углерода. Механизм его токсического действия и влияния на обменные процессы в организме

Гепатотоксины при воздействии на печень повреждают паренхиму и нарушают обменные и ферментативные процессы в ее ткани, вызывая разнообразные патологические состояния - от жировой и белковой дистрофии до токсического гепатита, цирроза и карциномы (G. Chander et al., 2002; Абдуллаев, 2007; Ч.С. Павлов, В.Т. Ивашкин, 2007; Н.В. Багинская с соавт., 2007; И.В. Козлова, М.В. Сафонова, 2008; Е.В. Вайс с соавт., 2012; В.М. Махов, 2012; Е.В. Лузина с соавт.,2013).

В рамках синдромальной классификации токсических повреждений печени выделяют вещества, вызывающие острое, подострое и хроническое поражение ткани (С.Д. Подымова, 2005). Тип повреждения зависит от природы химического вещества и продолжительности его действия в организме. Основными мишенями гепатотоксикантов являются ядро, плазматическая мембрана, митохондрии и эндоплазматический ретикулум гепатоцитов (I. Colle et al., 2002; A. Canbay et al., 2004; Г.К. Мироджов и соавт., 2005; Е.Л. Мальцева с соавт., 2005; Д.М.Фалер, Д. Шилдс, 2006; P.M. Курабекова с соавт., 2012). При этом поврежденные митохондрии теряют способность обеспечивать энергобаланс клетки, повреждается структура ДНК, молекулярный механизм ионных насосов плазматической мембраны, развиваются внутриклеточные пролиферативные изменения, нарушается ионный баланс клетки.

Механизмы повреждения гепатоцитов различаются в зависимости от типа токсина. Так, под действием четыреххлористого углерода возникает нарушение функционирования ферментных систем эндоплазматического ретикулума. Тяжелые металлы вызывают повреждение клеток печени, блокируя функциональную активность сульфгидрильных (SH) групп ферментов. При воздействии тетрахлорметана и аллилового спирта наблюдается усиление процессов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембранных липидов (СВ. Котельникова с соавт., 2008; Н.И. Калетина, 2008; П.В. Корой, 2008; А.В. Калинин, Н.А. Петрук, 2011; Г.В. Коршунов с соавт., 2012; А.В. Рудакова, 2013).

Токсический эффект ксенобиотиков в большой мере определяется состоянием ферментативных систем, участвующих в их метаболизме и детоксикации. Индукция или ингибирование набора изоферментов цитохрома Р450, а также ферментов конъюгации могут быть детерминированы генетически, что и объясняет различную индивидуальную чувствительность к действию токсинов на печень. Гепатоциты с высокой активностью цитохрома Р450 более чувствительны к ССІ4 и парацетамолу по сравнению с клетками печени с низкой его активностью. Этанол, ацетон, голодание могут индуцировать активность цитохрома Р450, а диэтилдитиокарбамат и диметилсульфоксид - ингибировать его, что соответственно усиливает либо ослабляет гепатотоксичность этих веществ (Е. Aicriviadis et al., 2000; М. Christensen et al., 2003; J. Yilleneuve, V. Pichette, 2004; B.T. Ивашкин с соавт., 2007 a; B.A. Миханов, 2008; Е.Б. Меньшикова, 2008; В.Ю. Серебров с соавт., 2008, 2009; A.M. Miller et al., 2011). Предшествующее повреждение печени вирусной инфекцией, а также алкоголем повышает чувствительность к гепатотропным ядам. Дефицит белка в организме, а также бактериальные инфекции усиливают токсический эффект (Т. Zhang et al., 2003; О.Л. Арямкина, 2005, 2006; А.И. Хазанов с соавт., 2007, 2008;

С.Н. Мехтиев с соавт., 2008 а, б). Морфофункциональные изменения ткани печени зависят от химической структуры, дозы и путей поступления гепатотоксикантов в организм. Спектр таких изменений включает белочную и жировую дистрофию, центролобулярный некроз гепатоцитов, заканчивающиеся восстановлением нормальной структуры печени при исключении действия гепатотоксичных факторов (А.Ф. Черноусое с соавт., 2012; А.С. Василевская с соавт., 2013).

При острых интоксикациях могут формироваться субмассивные и массивные некрозы паренхимы, ведущие к развитию мультилобулярного цирроза печени (И.А. Шикалова с соавт., 2012).

Некроз гепатоцитов осуществляется поэтапно. Вслед за повреждением плазматической мембраны происходит набухание митохондрий и дезинтеграция ядра с последующим фагоцитозом погибших клеток. К факторам, инициирующим описанные изменения гепатоцитов, следует отнести образование соединений ксенобиотиков с биологически важными внутриклеточными и плазматическими биомолекулами, активацию процессов перекисного окисления липидов, формирование окислительного стресса, массивный выход из клеток ионов кальция, разрушение цитоскелета. Некроз гепатоцитов сопровождается развитием воспалительного процесса с вовлечением в деструктивный процесс окружающих тканей (С.К. Курбанов, 2003; С.С. Перцов, Г.В. Пирогова, 2004; A. Cardenas, P. Gines, 2005; Е.В. Копляк с соавт., 2008; К.Л. Райхельсон с соавт., 2014). Печень обладает очень высокой способностью к регенерации, благодаря чему некротизированные гепатоциты уничтожаются и заменяются новыми, в результате чего восстанавливается архитектоника и функции органа. Однако, когда количество поврежденных гепатоцитов слишком велико, регенераторные возможности печени оказываются недостаточными, что приводит к разрушению органа (Г.Д. Миронова с соавт., 2008; И.П. Ермакова с соавт., 2012).

Гепатотоксины вызывают гибель клеток не только по механизму некроза, но и путем апоптоза (J. Kountouras et al., 2003; Н.Ф. Кушнерова, Ю.А. Рахманин, 2008; В.И. Петухов с соавт., 2008). Предикторами апоптоза являются падение электрохимического потенциала мембраны митохондрий и активация продукции активных форм кислорода (С. J. Chen et al., 2006; Т.Г. Сазонтова, Ю.В. Архипенко, 2007). Апоптоз гепатоцитов морфологически характеризуется образованием мембранных вакуолей и пузырей, агрегацией хроматина, образованием апоптотических телец с их последующим фагоцитозом. При апоптозе воспалительный процесс не возникает. Одни и те же факторы (оксид азота, активные формы кислорода) могут инициировать как апоптоз, так и некроз.

При хронических повреждениях печени токсическими веществами чаще наблюдается развитие жировой дистрофии печени, а изменения в соединительной ткани представляют собой неспецифический реактивный гепатит (А.В. Ягода с соавт., 2006; Д.А. Мискевич с соавт., 2007; Л.Ю. Ильченко, 2007; В.Т. Ивашкин, А.О. Буеверов, 2008; Ю.К. Караман с соавт., 2012; Ю.О. Шульпекова, 2012).

Оценка антиоксидантной активности экстрактов ЛО

Свежее растительное сырье (листья, плоды - коробочки и семена лотоса орехоносного) собирали и промывали индивидуально в проточной водопроводной воде, высушивали, измельчали до порошкообразного состояния в механическом измельчителе. 20 г каждого порошка последовательно экстрагировали путем погружения в 500 мл 60%- ного этанола на 3 часа при 60С в духовке. Этаноловые экстракты фильтровали с использованием фильтровальной бумаги, после чего отгоняли спирт в ротационном испарителе при 60 С.

Для оценки гепатопротекторной активности в сыворотке крови крыс определяли концентрации общего белка, альбумина, щелочной фосфатазы, АсАТ, АлАТ, общего билирубина, мочевины и холестерина. Концентрацию мочевины (ммоль/л) измеряли диацетилмонооксимовым методом с помощью наборов реактивов «Vital diagnostics» (Санкт- Петербург). Активность щелочной фосфатазы (нмоль/с.л) определяли унифицированным методом по конечной точке (Bessey et al., 1946), АлАТ и АсАт (ммоль/ч.л) -унифицированным методом Райтмана- Френкеля (Reitman and Frankel., 1957), общего белка (г/л) - биуретовым методом, концентрацию альбумина унифицированным колориметрическим методом (Doumas et al.,1971), общего билирубина - методом Йендрашека- Грофа (Jendrassik and Grof, 1938), общего холестерина - энзиматическим колориметрическим методом (Trinder Р., 1969) с помощью наборов реактивов «Ольвекс Диагностикум» (Санкт- Петербург).

Содержимое пробирок перемешивали и выдерживали при комнатной температуре 18- 25С 30 мин. Пробы фотометрировали против контрольной пробы при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см не позже, чем через час после начала инкубации. Концентрацию общего белка (С) рассчитывали в г/л по формуле: С = (Eon/Екал) х 70 (1), где: Еоп - экстинция опытной пробы, Екал - экстинция калибровочной пробы, 70 - концентрация белка в калибраторе в г/л. 2.4.1.2.0пределение концентрации альбумина Альбумин образует окрашенный комплекс с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации альбумина в пробе (Doumas et al., 1971).

Пробы тщательно перемешивали и инкубировали 5 мин. при комнатной температуре (18- 25С). Измеряли оптические плотности опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 628 нм (620-640 нм). Интенсивность окраски стабильна не менее часа. Концентрацию (С) альбумина в пробе рассчитывали по формуле: С = (Е пробы / Е калибратора) х 60 г/л (2), где: Е пробы - оптическая плотность исследуемой пробы, Е калибратора - оптическая плотность калибровочной пробы, /л -концентрация альбумина в калибраторе.

Активность аланинаминотрансферазы в сыворотке крови определяли унифицированным методом Райтмана-Френкеля (Reitman and Frankel., 1957). Под действием фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на а-кетоглутарат. Активность АЛТ пропорциональна количеству образовавшихся динитрофенилгидразонов пирувата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.

Пробы перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре (18- 25С). Затем в пробирки вносили по 2,5 мл разведенного реагента № 3, перемешивали реакционную смесь и через 10 минут (18- 25С) измеряли оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500- 560 нм). Интенсивность окраски стабильна не менее часа в защищенном от света месте. Активность аланинаминотрансферазы выражается в единицах, которые определяются количеством образовавшегося пирувата (ммоль или мкмоль) за единицу времени (час, секунда) в единице объема (литр) биологической жидкости. Расчет активности (А) фермента проводили по формуле: А = (Е опыт - Е контр.) х К (3), где: Е опыт - оптическая плотность опытной пробы, Е контр. -оптическая плотность соответствующей контрольной пробы, К -коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику.

Активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови определяли унифицированным методом Райтмана- Френкеля (Reitman and Frankel., 1957). Под действием фермента аспартатаминотрансферазы (ACT) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на а- кетоглутарат. Активность ACT пропорциональна количеству образовавшихся динитрофенилгидразонов пирувата и оксалоацетата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.

Пробы перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре (18- 25С). Затем в пробирки вносили по 2,5 мл разведенного реагента № 3, перемешивали реакционную смесь и через 10 минут (18- 25С) измеряли оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500- 560 нм). Интенсивность окраски стабильна не менее часа в защищенном от света месте. Активность аланинаминотрансферазы выражается в единицах, которые определяются количеством образовавшегося пирувата (ммоль или мкмоль) за единицу времени (час или секунда) в единице объема (литр) биологической жидкости. Расчет активности фермента проводили по формуле 3.

Смешивали реагент №1 (Глициновый буфер) и реагент №3(р-Нитрофенилфосфат) в соотношении 4:1. Пробы перемешивали и фотометрировали при длине волны 405 нм. Расчет активности фермента проведите по калибровочной кривой (Bessey et al., 1946). 2.4.1.6. Определение концентрации общего билирубина

Концентрация общего билирубина в сыворотке крови определяли методом Йендрашека- Грофа в присутствии кофеинового реагента с образованием окрашенного азотсоединения. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации билирубина и измеряется фотометрически при длине волны 535 (500- 560) нм.

Смешивали необходимые количества реагентов №2 (сульфаниловая кислота) и №3 (натрия нитрит) в соотношении 40:1. Пробы тщательно перемешивали, через 20 мин (при комнатной температуре) измеряли величину экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной при длине волны 535 нм (500 - 560 нм), экстинкцию калибратора - против дистиллированной воды при той же длине волны. Расчет концентрации билирубина в пробе (С) проводили по формуле: С = Е „робы/ Е калибр, х 85,5 мкмоль/л (4), где: Е „робы- экстинкция опытной пробы, Е калибр. - экстинкция калибровочной пробы, 85,5 - концентрация билирубина в калибраторе, мкмоль/л. 2.4.1.7. Определение концентрации мочевины Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли диацетилмонооксимовым методом. Мочевина с диацетилмонооксимом в кислой среде в присутствии тиосемикарбазида и трехвалентного железа образует окрашенный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Влияние экстрактов лотоса орехоносного на концентрацию аспартатаминотрансферазы (ACT) (ммоль/(ч-л))

Угнетение естественных ферментативных механизмов защиты организма под действием CCU, согласно полученным результатам, обусловлено также снижением каталазной активности в тканях печени и почек, сопровождающемся повышением уровня ТБК- активных продуктов в 5,9 и 4,7 раза (р 0,001) по сравнению с интактным контролем.

Перекисное окисление липидов, инициируемое тетрахлорметаном изучено довольно подробно и является классической моделью повреждения печени с последующим взаимодействием производных окислительной цепи с биологическими молекулами, встроенными в мембраны гепатоцитов.

В тоже время необходимо помнить, что перекисное окисление липидов -не единственный механизм повреждения гепатоцитов и его ингибирование не всегда достаточно для протекции клеток печени от токсического действия реагентов. Именно поэтому в представленной работе мы анализировали комплекс биохимических показателей.

Исследование гепатопротекторного действия экстрактов ЛО при экспериментальном повреждении печени, вызванном ССІ4, показало, что введение всех трех экстрактов способствует коррекции гепатоза не зависимо от дозы введения экстрактов. При этом, существует некоторая специфичность воздействия: нормализации уровня общего белка, АлАт и АсАТ в большей степени способствует спиртовой экстракт плодов-коробочек ЛО, в то время как максимальное снижение ЩФ, общего билирубина и мочевины наблюдалось после введения экстрактов семян и плодов-коробочек. Это указывает на то, что различные части лотоса орехоносного оказывают селективное воздействие на различные звенья гепато-белиарной функции. В большей степени нормализует метаболическую функцию печени, особенно в условиях экспериментального токсического воздействия, экстракт семян ЛО.

Уровень ТБК-активных продуктов как в печени, так и в почках максимально приблизился к нормальному значению под воздействием препарата-сравнения - силимарина. Однако экстракты ЛО также проявили свои антиоксидантные свойства, что привело к снижению количества ТБК-активных продуктов.

Приведенные выше данные подтверждаются полученными данными об антиоксидантной активности экстракта семян ЛО. Нами показано, что у животных, получавших 50 и 100 мг / кг м. т. экстракта семян ЛО после введения ССІ4, уровень МДА в печени и почках значительно снизился, а уровень каталазной активности значительно увеличился. То есть, интенсивность процессов свободно-радикального окисления уменьшилась, что сопровождалось интенсификацией очищения тканей от Н2Ог. Полученные результаты согласуются с данными о том, что введение водно-спиртового экстракта семян в дозах 100 и 200 мг / кг м. т. в течение 4 дней до четыреххлористого углерода вызывает значительный рост уровня супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы и значительное снижение ТБК-активных продуктов (Rai et al., 2006). Как известно, мощные растительные антиоксиданты повышают уровни каталазы и СОД и снижают уровень ТБК-активных продуктов в крови и тканях по сравнению с контролем СС14 (Badami et al., 2005). Экстракты Л О содержат алкалоиды, сапонины, фенольные соединения и углеводы. Представители этого химического ряда обладают антирадикальной и антиоксидантной активностью (Tripathi et al.,1996). Основные фитокомпоненты, присутствующие в экстрактах - алкалоиды, такие как ниферин, лиензинин, изолиензинин, пеуциферин, N-норнуциферин, N-норармепавин, лиензинин, нуциферин, пронуциферин, лотузин, О-метилниферин; флавоноиды - цинарозид, гиперин, рутин (Tomita et al., 1961; Furukawa et al., 1965; Wang et al., 1991; Anonymous, 1992; Qian, 2002). Лупеол, содержащийся в экстракте семян ЛО, обладает фармакологической активностью против различных заболеваний, таких как артрит, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, поражения почек, печени, микробные инфекции и рак (Chaturvedi et al.,2008). Он подавляет рост опухолей, вызванных перекисью бензоила (Saleem, 2008), играет очень важную роль в нормализации липидного профиля (Sudhahar et al.,2007), ранозаживления (Harish et al.,2008), имеет защитный эффект при гиперхолестеринемии, связанной с повреждением почек (Sudhahar et al.,2008) и подавлением иммунных факторов (Bani et al.,2006; Vasconcelos et al., 2008).

Предыдущие исследования показали, что производные витамина D имеют противоопухолевую активность (Sato et al., 1991). Олеаноловая кислота защищает клетки печени от действия четыреххлористого углерода (Jeong et al., 1999; Liu et al., 1994; Liu et al., 1995), и подавляет перекисное окисление липидов в микросомах печени крысы (Balanehru et al., 1991).

Сообщалось, что плоды ЛО являются важным природным источником олигомеров и полимеров катехина и эпикатехина, которые также являются выраженными процианидинами (Ling and Xie, 2002). Обнаружено, что процианидины плодов и коробочек ЛО обладают многими биологическими эффектами, включающими антирадикальное действие, в частности освобождение организма от перекисных радикалов гидроксила, водорода, гидро-пероксильного и супероксид-анион-радикалов.

Согласно полученным результатам, основными фитохимическими компонентами спиртового экстракта плодов-коробочек ЛО являются органические кислоты, их эфиры, а также флавоны, характеризующиеся противоопухолевой и антиоксидантной активностью (Yeong et al., 1989; Govindappa et al., 2014; Veitch and Grayer, 2008).

Наши результаты согласуются с проведенным ранее исследованием, в котором оценивали гепатопротекторную и антиоксидантную активность экстракта листьев ЛО против ССІ4-индуцированной гепатотоксичности и обнаружили, что введение экстракта листьев ЛО в дозах 300 и 500 мг / кг м. т. привело к снижению концентрацию общего билирубина и активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы по сравнению с контролем ССЬ (Huang et al.,2010).

Полученные данные свидетельствуют о том, что экстракты, полученных из семян, плодов-коробочек и листьев лотоса орехоносного способствовают улучшению функции печени у самок крыс с CCU индуцированным повреждением печени. Кроме того, введение экстрактов лотоса орехоносного подавляет перекисное окисление липидов и активирует каталазу в тканях печени и почек. Это подтверждает наличие у экстрактов лотоса орехоносного гепатопротекторных и антиоксидантных свойств в отношении ССЬ-индуцированного повреждения печени самок крыс за счет содержания в них фенольных соединений.

Результаты исследования состава спиртового экстракта семян лотоса орехоносного методом хромато-масс-спектрометрии

Наши результаты согласуются с проведенным ранее исследованием, в котором оценивали гепатопротекторную и антиоксидантную активность экстракта листьев ЛО против ССІ4-индуцированной гепатотоксичности и обнаружили, что введение экстракта листьев ЛО в дозах 300 и 500 мг / кг м. т. привело к снижению концентрацию общего билирубина и активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы по сравнению с контролем ССЬ (Huang et al.,2010).

Полученные данные свидетельствуют о том, что экстракты, полученных из семян, плодов-коробочек и листьев лотоса орехоносного способствовают улучшению функции печени у самок крыс с CCU индуцированным повреждением печени. Кроме того, введение экстрактов лотоса орехоносного подавляет перекисное окисление липидов и активирует каталазу в тканях печени и почек. Это подтверждает наличие у экстрактов лотоса орехоносного гепатопротекторных и антиоксидантных свойств в отношении ССЬ-индуцированного повреждения печени самок крыс за счет содержания в них фенольных соединений. Учитывая известные данные о механизме токсического поражения печении под действием тетрахлорметана, можно предположить, что ингибирование ПОЛ экстрактами лотоса орехоносного обусловлено стабилизацией цитохрома Р-450 фенольными соединениями, входящими в состав экстрактов. Анализ химического состава показал насыщенность экстрактов ЛО фенолами и их производными. Включаясь в обменные процессы в тканях, фенольные соединения экранируют реакционный субстрат в цепи перекисного окисления. Возможно, некоторые представители этого класса химических соединений стабилизируют цитохром Р-450 в самом начале действия ССІ4, в то время как другие реагируют с уже образовавшимися перекисными радикалами, защищая структурные белки и липиды на финальном этапе реакции окисления.

В частности, широко представленные в растительных экстрактах дубильные вещества, относящиеся к группе полифенолов, обладают способностью к закреплению белковых молекул в клеточных структурах. В тоже время, при насыщении тканей тяжелыми металлами и алкалоидами, полифенолы образуют нерастворимые соединения, что может привести к отравлению.

Таким образом, можно сказать, что исследованные экстракты обладают выраженными гепатопротекторными и антиоксидантными свойствами, обусловленными содержанием в них представителей важнейших классов органических соединений, активных в отношении свободных радикалов. Достоверное изменение основных биохимических показателей при введении экстрактов свидетельствует о значительном ингибировании перекисного окисления липидов и выведении уже образовавшихся продуктов окисления. Специфичность влияния экстрактов, выделенных из разных частей растения также обусловлена их качественным составом. Так, экстракты семян и плодов-коробочек лотоса орехоносного содержат больше высших жирных кислот, их эфиров, терпенов и стеролов, чем экстракт листьев, который насыщен флавонолами, такими как кверцетин.

Сопоставление результатов биохимического и гистологического анализа подтвердило высокую степень протективного действия экстрактов, выражающегося в нормализации основных морфометрических характеристик печеночной ткани, аналогичной действию силимарина. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования выявили гепатопротекторное и антиоксидантное действие экстрактов семян, плодов-коробочек и листьев лотоса орехоносного у самок крыс с СС14-индуцированным повреждением печени. Нами было показано, что экстракты ЛО способствуют ингибированию гепатотоксического действия тетрахлорметана через активацию фермента каталазы и утилизацию свободных радикалов, образующихся при метаболизме тетрахлорметана, предотвращая тем самым перекисное окисление липидов в тканях печени и почек.

Анализ химического состава показал насыщенность экстрактов ЛО фенолами и их производными. Включаясь в обменные процессы в тканях, фенольные соединения экранируют реакционный субстрат в цепи перекисного окисления. Возможно, некоторые представители этого класса химических соединений стабилизируют цитохром Р-450 в самом начале действия ССІ4, в то время как другие реагируют с уже образовавшимися перекисными радикалами, защищая структурные белки и липиды на финальном этапе реакции окисления.

Различные экстракты лотоса орехоносного оказали в разной степени выраженный гепатопротекторный эффект. Наиболее эффективным оказался экстракт семян ЛО. Диаметр гепатоцитов и их ядер даже на фоне введения тетрахлорметана не отличались от соответствующих значений в контроле, что свидетельствует о высокой, сравнимой с эталонным гепатопротектором силимарином защитной активностью экстракта семян лотоса орехоносного в отношении гепатотоксического агента. Гепатопротекторная активность экстрактов плодов-коробочек, вводимых крысам в двух концентрациях, оказалась достаточно высокой, однако степень повреждения паренхимы печени по сравнению с действием экстракта семян и силимарина была выше.

В результате, гепатопротекторное действие исследуемых экстрактов ЛО проявляется через восстановление основных биохимических показателей и улучшение морфофункциональных характеристик паренхимы печени. Эффективность исследуемых экстрактов семян и плодов-коробочек лотоса орехоносного сопоставима с известным гепатопротекторным препаратом -силимарином.

Антиоксидантная активность экстрактов проявилась на уровне препарата контроля - силимарина - в достоверном снижении концентрации ТБК-активных продуктов и увеличении активности каталазы. Аналогично результатам исследования гепатопротекторных свойств, наиболее выраженные антиоксидантные эффекты наблюдались у экстракта семян лотоса орехоносного, что подтверждает высокую роль свободно-радикального окисления в процессе токсического повреждения клеток печени.